草酸對冷藏去殼馬蹄筍的保鮮效果及機制研究

戴 丹 鄭 劍 周成敏 成紀予 丁立忠

(1浙江農林大學信息工程學院，浙江 杭州 311300；2浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300；3 浙江省麗水市農林科學研究院，浙江 麗水 323000；4浙江省杭州市臨安區農林技術推廣中心，浙江 杭州 311300)

草酸是植物自身產生并廣泛存在于各組織器官中的小分子有機酸，在植物的多種代謝中起著重要的調控作用[6]。近年來，低濃度外源草酸處理對果蔬采后保鮮效果以及調控機制方面的研究備受關注。Pareek[7]綜述了外源草酸在延緩果蔬采后成熟衰老、控制采后病害、抑制酶促褐變和緩解冷害等方面的應用效果及其調控機制，并指出適當施用外源草酸有助于延緩幾種常見果蔬的品質下降并延長其貨架期。如，采收前草酸處理能夠明顯改善洋薊采收至2℃貯藏21 d 期間的品質[8]，能夠提高獼猴桃維生素C 含量，抑制乙醇和乙醛累積并提高對展青霉菌的抗性[9－10]；采后草酸處理能夠降低20℃貯藏期間洋薊的腐爛率，保證其綜合品質[11]，保持鮮切綠色和紫色蘆筍的外觀和營養品質[12]，也能夠抑制鮮切蓮藕的褐變并保持其品質[13]，還能通過提高抗氧化系統關鍵酶的活性并上調對應酶的基因表達量或維持細胞膜的完整性、調控能量代謝或調控糖代謝累積更多的還原糖進而緩解哈密瓜和番茄冷藏期間冷害，更長時間地保持果蔬的良好品質[14－15]。草酸處理作為一種新型的保鮮方法備受關注。

然而，關于草酸處理對去殼馬蹄筍冷藏和冷鏈流通過程中的品質劣變(如褐變、筍肉木質化等方面)的調控效果及關鍵酶的基因表達研究尚鮮見報道。去殼凈筍產業是竹筍加工產業一個新的方向。去殼凈筍因其加工烹飪方便以及無筍殼等固體廢棄物污染等優點廣受城市消費者青睞，并為生產竹筍佐餐食品和休閑食品的精深加工企業提供干凈的原料。鑒于此，本試驗以去殼馬蹄筍為原料，研究低濃度外源草酸延緩馬蹄筍凈筍冷藏期間木質化、褐變進程以及延緩品質下降的效果，并深入研究關鍵基因的相對表達水平，以期為有效抑制去殼凈筍貯藏流通期間木質化和褐變機理提供理論依據，并為竹筍采后貯藏保鮮新方法的篩選提供借鑒與技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬蹄筍:2017年7月中旬早上5:00 左右采集于浙江省溫州瑞安市馬蹄筍基地。

草酸、L－苯丙氨酸、愈創木酚、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA )、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、鄰苯二酚、EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)、TritonX－100、β－巰基乙醇、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α－萘胺、丙酮、四氯化鈦、過氧化氫溶液(30%)、氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)、核黃素、L－蛋氨酸、硫酸、鹽酸，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；松柏醇、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化態)，美國Sigma 公司；PureLink? plant RNA Reagent、RNase-Free DNase Ⅰ、PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR? Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，日本TaKaRa Bio Inc 公司。

1.2 儀器與設備

DDS－307 臺式電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；3－30K 冷凍離心機，德國Sigma 公司；TYI－3016F 便攜式紅外二氧化碳分析儀，上海唐儀電子科技有限公司；UV－2355 紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；LHS－350SC 恒溫恒濕箱，上海科辰實驗設備有限公司；TA-XT2i 質構儀，英國Stable Micro Systems 公司；CHROMA METER CR－400 色差儀，日本柯尼卡公司；M200 酶標儀，瑞士TECAN 公司；iQTM5多重實時熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司。

程元敏先生檢得北魏時引用《偽古文尚書》經、傳者凡八人，分別為房景先、酈道元、邢巒、韓顯宗、張普惠、李騫、王神貴、元恭⑥。其中，酈道元、邢巒、韓顯宗、張普惠、李騫五人均系河北人物。結合諸人經歷可知，至遲在北魏孝文帝朝，《偽古文尚書》已經北傳。

1.3 試驗方法

1.3.1 預處理試驗 現場采挖馬蹄筍，盡可能貼近竹鞭采挖，以減少采收的機械損傷；現場揀選基部切口小且平整、筍體其他部位無機械損傷、無病蟲害且粗細和長短相近的筍，放置于采樣盒中，筍體上方鋪一層厚度為2～3 cm 的棉花墊，棉花墊上方平鋪一塑料袋碎冰(碎冰質量約1.5 kg)，用空調車5 h 內運至實驗室。切除自基部切口向上長度約2～3 cm 部分，剝去筍殼，用150 μL·L－1次氯酸鈉浸泡消毒5 min，自來水沖洗，陰涼通風處晾干10 min。晾干后，隨機取180 根筍，分成6組，1 組用于測定0 d 初始數據，另外5 組浸入一系列濃度的草酸溶液中進行預試驗[于0(清水)、5、10、15 和20 mmol·L－1草酸溶液中浸泡10 min，之后于陰涼通風處晾干，然后分別置于已清洗消毒的塑料筐中，筐外套上0.05 mm 聚乙烯薄膜袋，不封口，于溫度6±1℃、相對濕度80%～85%條件下貯藏10 d，通過測定硬度、L*值、木質素含量和失重率篩選出最適處理參數。

另取288 根筍，分成兩組，一組于5 mmol·L－1草酸溶液中浸泡10 min(該參數為前期預試驗獲得的最佳處理參數)，另一組以浸入清水10 min 為對照(CK)，晾干后于溫度6±1℃、相對濕度80%～85%條件下貯藏10 d，每2 d 隨機取樣，每組每次取24 根筍，檢測基部切面的色差、測定呼吸速率，并選取自基部切口往上2 ～4 cm 的一段，檢測該段筍肉組織的電導率、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、H2O2含量、超氧陰離子()產生速率、硬度、木質素和纖維素含量以及苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、 超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)的活性及其編碼基因的相對表達量，試驗重復3 次。

1.3.2 呼吸速率和失重率的測定 取6 個密封良好且潔凈的干燥器，置于溫度6±1℃條件下，先用便攜式紅外線CO2分析器檢測各自干燥器中CO2濃度(C0)，然后將CK 和草酸處理的去殼馬蹄筍放入各自對應的干燥器中，密封后兩組筍放置2 h，再檢測干燥器中CO2濃度(C1)，根據前后兩次CO2濃度變化、干燥器的容積(V干)與筍的體積(V筍)以及筍的質量(m筍)計算呼吸速率:

失重率采用稱重法測定:

1.3.3 色差的測定 采用色差儀測定去殼馬蹄筍基部切面的L*值。

1.3.4 相對電導率和MDA 含量的測定 相對電導率的測定參照曹建康等[16]的方法稍作修改。測定的樣品改為10 片直徑為1 cm、厚度為1 mm 左右的筍肉組織的圓片；MDA 含量的測定也參照曹建康等[16]的方法。

1.3.5 硬度的測定 從馬蹄筍取樣部位切下約1.0～1.5 cm 厚筍肉，切成邊長約1 cm×1 cm 的正方形片狀，然后用質構儀P/2(直徑2 mm)平頭柱形探頭檢測筍肉的硬度，探頭測試深度為4 mm，貫入速度為0.5 mm·s－1，單位為N。

1.3.6 纖維素和木質素的測定 參照Zeng 等[17]的方法，結果以其占筍肉鮮重質量百分比(%)計。

1.3.7 相關酶活性及ROS 指標的測定 PAL、POD、PPO 活性測定參照曹建康等[16]的方法，CAD 活性測定參照Zeng 等[17]的方法，SOD 活性測定參照沈玫等[1]的方法，CAT 活性、H2O2含量、超氧陰離子自由基(superoxide anion free radical，)產生速率的測定參照Zeng 等[18]的方法。

1.3.8 馬蹄筍木質素代謝和褐變相關酶基因表達的測定 參照Zheng 等[19]和鄭劍等[20]的方法并稍作修改。逆轉錄試驗: 用 SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis Super Mix 進行逆轉錄試驗。

Real-time PCR 檢測:用多重實時熒光定量PCR 儀進行擴增，引物及條件見表1，擴增總體系為25 μL，包括ddH2O 10.5 μL、SYBR Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL、PCR-F(10 μmol·L－1)0.5 μL、PCR-R(10 μmol·L－1)0.5 μL、模板cDNA 1.0 μL。

表1 定量PCR 引物序列及反應條件Table 1 Real-time PCR primers and conditions

反應程序:95℃預變性1 min；95℃變性10 s，62℃退火25 s(收集熒光)，40 個循環；在55～ 95℃之間進行熔解曲線分析。

1.4 數據分析

采用SPSS 16.0 軟件中的one-way ANOVA 方法對數據進行顯著性檢驗分析，用Duncan 進行多重比較分析(P<0.05)，用Excel 2010 作圖。

2 結果與分析

2.1 草酸處理保鮮馬蹄筍的預試驗篩選

預試驗中不同濃度草酸處理去殼馬蹄筍的品質指標變化如表2 所示。馬蹄筍筍肉組織的硬度和木質素含量在6℃貯藏10 d 后對照和各處理都較貯藏0 d 呈現明顯上升趨勢；與清水處理相比，四組不同濃度草酸處理都顯著抑制了竹筍硬度、木質素含量以及失重率的上升，同時不同濃度草酸處理之間上述3 個指標差異不顯著。另外，與清水處理相比，5 mmol·L－1草酸處理顯著抑制了去殼馬蹄筍切面的褐變，且效果優于10、15 和20 mmol·L－1處理組。

表2 不同草酸濃度對6℃下冷藏10 d 的馬蹄筍硬度、L*值、木質素含量以及失重率的影響Table 2 Effects of different oxalic acid treatment on firmness， L*value，lignin contents and weight loss of bamboo shoot during storage at 6℃for 10 days

綜合預試驗結果，確定5 mmol·L－1草酸處理為本試驗中延緩去殼馬蹄筍品質下降相對較理想的處理方法，并以5 mmol·L－1草酸處理開展后續試驗。

2.2 草酸處理對馬蹄筍呼吸速率和L*值的影響

由圖1-A 可知，冷藏過程中，去殼馬蹄筍的呼吸速率總體呈先快速上升之后緩慢下降的趨勢，草酸處理去殼馬蹄筍的呼吸速率在4 ～ 10 d 內顯著低于CK(13%～31%)。L*值的大小可以反映去殼馬蹄筍切面褐變程度的高低。由圖1-B 可知，草酸處理也延緩了去殼馬蹄筍切面L*值下降，其在6～10 d 顯著高于CK，在冷藏第10 天，草酸處理去殼馬蹄筍切面L*值下降幅度為10.9%，明顯低于CK 下降幅度(19.8%)。說明草酸處理能夠有效抑制去殼馬蹄筍呼吸速率的上升和切面褐變。

圖1 草酸處理對6℃條件下冷藏馬蹄筍呼吸速率(A)和L*值(B)的影響Fig.1 Effects of oxalic acid treatment on respiration rate(A) and L*value(B) of bamboo shoots during storage at 6℃

由圖2 可知，冷藏第10 天時，CK 去殼馬蹄筍的切面和筍體發生明顯褐變，筍肉和外表面呈現明顯的棕褐色且伴有不良氣味；而草酸處理去殼馬蹄筍的切面和筍體顏色大部分仍呈現淡米白色和淡棕黃色，褐變輕微、筍體飽滿且帶有馬蹄筍特有的清香味。

圖2 草酸處理后冷藏10 d 馬蹄筍的外觀品質狀況Fig.2 Appearance quality of bamboo shoots treated with oxalic acid during storage for 10 days

2.3 草酸處理對馬蹄筍相對電導率和MDA 含量的影響

由圖3 可知，貯藏期間，采后去殼馬蹄筍的相對電導率和MDA 含量都呈上升趨勢，草酸處理延緩了兩者的上升，且在貯藏6～10 d 期間，其相對電導率和MDA 含量顯著低于CK。冷藏第10 天時，草酸處理去殼馬蹄筍的相對電導率和MDA 含量較0 d 分別增加了156%和118%，而CK 的相對電導率和MDA 含量較0 d 分別增加了221%和243%。說明草酸處理能夠延緩筍肉組織電導率的升高和MDA 的累積，有助于保持細胞膜的完整性。

圖3 草酸處理對6℃條件下冷藏馬蹄筍相對電導率(A)和MDA 含量(B)的影響Fig.3 Effects of oxalic acid treatment on relative electrical conductivity(A)and MDA content(B) of bamboo shoots during storage at 6℃

2.4 草酸處理對馬蹄筍硬度、纖維素和木質素含量的影響

由圖4 可知，冷藏過程中，去殼馬蹄筍的硬度和木質素、纖維素含量總體呈現逐漸上升趨勢，草酸處理組馬蹄筍在冷藏第4、第8～第10 天時顯著抑制了筍肉硬度的上升，在冷藏6～10 d 顯著抑制了木質素和纖維素的累積。在冷藏第10 天時，草酸處理的去殼馬蹄筍硬度、木質素和纖維素含量較0 d 分別增加了176%、475%和88%，CK 組對應指標較0 d 分別增加了240%、727%和133%。說明草酸處理能夠抑制木質素和纖維素的累積，進而延緩筍肉硬度上升。

2.5 草酸處理對馬蹄筍H2O2 含量和O·－2 產生速率的影響

由圖5-A 可知，草酸處理去殼馬蹄筍中H2O2含量在冷藏期間呈先上升而后波動下降的趨勢，且顯著低于CK，在冷藏第10 天時，草酸處理馬蹄筍中H2O2含量較0 d 減少了5.6%，而CK 中H2O2含量較0 d 增加了24.3%。草酸處理去殼馬蹄筍中O·2－生成速率在冷藏期間呈較平緩的上升－下降－上升的變化趨勢，且在第4、第8～第10 天顯著低于CK(圖5-B)。說明草酸處理有助于降低馬蹄筍貯藏期間細胞的ROS 脅迫。

2.6 草酸處理對馬蹄筍中PAL、POD、CAD、PPO 活性及其基因表達的影響

冷藏期間，CK 和草酸處理去殼馬蹄筍的PAL、CAD、POD 和PPO 活性基本都呈先上升后下降并伴有一定的波動的變化趨勢，草酸處理的馬蹄筍中PAL、CAD 和PPO 活性分別在2～10 d、4～10 d 和4～10 d顯著低于CK(圖6-A、C 和G)；草酸處理的馬蹄筍中POD 活性在第2 和第6～第10 天時顯著低于CK(圖6-E)。

隨著冷藏時間的延長，CK 和草酸處理去殼馬蹄筍的CAD和POD基因表達量基本呈先上升而后下降的趨勢，并伴有一定的波動，草酸處理馬蹄筍的CAD和POD基因表達量分別在4～8 d 和6～10 d 顯著低于CK(39%～51%和34%～45%)(圖6-D、F)；CK 馬蹄筍中PAL，基因表達量先下降而后快速上升，而草酸處理組呈先下降后上升，再下降后上升的平緩波動變化，且在8～10 d 顯著低于CK(51%～68%)(圖6-B)；CK 中PPO基因表達量先上升后下降至第4 天達到最低點，而后快速上升，6～10 d 開始下降，草酸處理較平緩上升，至第6 天達到最高點而后下降，且在第2 和第6～第8 天顯著低于CK(31%～64%)(圖6-H)。說明草酸處理有助于抑制木質素代謝關鍵酶的活性并下調對應基因的表達量，進而抑制木質化進程。

圖4 草酸處理對6℃條件下冷藏馬蹄筍硬度(A)、纖維素(B)和木質素(C)含量的影響Fig.4 Effects of oxalic acid treatment on firmness(A)and contents of cellulose(B)and lignin(C)of bamboo shoots during storage at 6℃

2.7 草酸處理對馬蹄筍中SOD 和CAT 活性及其基因表達的影響

CK 和草酸處理的去殼馬蹄筍中SOD 和CAT 活性在冷藏期間總體呈先上升后下降的變化趨勢，且草酸處理的馬蹄筍中SOD 和CAT 活性分別在4～10 d和2～10 d 顯著高于CK，其增幅分別為9.8%～52.6%和14.4%～62.8%(圖7-A、C)。

冷藏期間，SOD和CAT基因相對表達量總體皆呈先上升后下降的變化趨勢，而草酸處理的馬蹄筍中SOD基因相對表達量在第4～第6 天和第10 天顯著高于CK，增幅為41.7%～57.9%，CAT基因相對表達量在4～8 d 顯著高于CK，增幅為37.5%～64.2%(圖7-B、D)。以上結果表明草酸處理能夠有效提高抗氧化酶的活性或延緩其活性下降并上調對應基因的表達量，有助于降低細胞的氧化傷害。

圖6 草酸處理對6℃條件下冷藏馬蹄筍PAL、CAD、POD、PPO 活性及其基因相對表達量的影響Fig.6 Effects of oxalic acid treatment on activities and relative gene expression level of PAL，CAD，POD and PPO of bamboo shoots during storage at 6℃

圖7 草酸處理對6℃下冷藏馬蹄筍SOD、CAT 活性及其基因相對表達量的影響Fig.7 Effects of oxalic acid treatment on activities and relative gene expression level of SOD and CAT of bamboo shoots during storage at 6℃

3 討論

呼吸會導致水分和干物質的損失，引起果蔬采后失重失鮮等[17，19]。因此，降低呼吸速率對于保持果蔬采后貯藏期間的品質和延長貨架期至關重要。研究表明，采收時和采后預處理的機械傷極易誘發竹筍采后呼吸速率的急劇升高和失重率的快速增加[6，17]。本試驗結果顯示，草酸處理顯著抑制了去殼馬蹄筍冷藏過程中呼吸速率和失重率的快速上升，這與Razzaq等[21]研究草酸處理芒果的結果一致，也與Ruíz-Jiménez 等[22]等研究草酸處理洋薊的結果一致。

一般認為，植物組織中木質素通過苯丙烷類代謝合成，其中PAL、CAD、POD 為關鍵酶。木質素由木質素單體聚合而成，單體的合成過程中，PAL 催化L－苯丙氨酸脫氨基成為反式肉桂酸，后者可以轉化為多種苯丙烷類化合物如木質素單體、類黃酮等；而CAD 可參與催化合成多種木質素單體[23－24]；POD 則催化木質素單體聚合最終形成多種結構的木質素[25]。研究表明，γ－射線和1－甲基環丙烯(1-methylcy clopropene，1-MCP)處理能夠抑制PAL、POD 和CAD 活性進而抑制竹筍采后的木質化進程[17，26]。本試驗中，與CK 相比，草酸處理顯著抑制了去殼馬蹄筍冷藏期間硬度的上升和木質素的累積，同時顯著抑制了PAL、POD 和CAD 活性并下調了其基因的相對表達量。說明草酸處理能夠抑制去殼馬蹄筍筍肉組織的木質化進程，從而保持其冷藏期間較好的品質。

研究發現，果蔬和鮮切果蔬采后貯藏期間細胞膜的損傷誘發了組織褐變，其主要原因在于細胞膜損傷導致酚類物質與PPO 和POD 接觸，在有氧條件下發生酶促氧化反應，進而產生醌類等棕褐色物質，褐變嚴重降低了果蔬的品質和商品價值[27]。竹筍，尤其是去殼竹筍，在冷藏過程中極易發生褐變，這是導致品質劣變的另一個重要因素。

Feliziani 等[28]認為，草酸有助于抑制細胞膜的脂質過氧化作用，有效保持果蔬細胞膜的完整性，從而有利于保持品質和延長果蔬的貨架期。另外，相關研究證實，外源草酸對細胞膜具有保護作用，并能夠有效延緩多種果蔬的成熟衰老，抑制褐變，原因在于其能夠提高細胞的抗氧化能力進而有效清除ROS[7]。如，草酸處理能夠維持菠菜貯藏期間細胞膜的完整性并降低呼吸速率，從而有助于延長其貨架期和改善品質[29]，草酸有助于保持室溫貯藏下桃子以及冷藏番茄細胞膜的完整性，并能延緩褐變[30－31]。因此，草酸處理被認為是多種水果采后抑制褐變的有效方法。本試驗結果表明，草酸處理抑制了馬蹄筍中MDA 的累積和電導率的上升，并且有效抑制了基部切口的褐變，同時也有效抑制了POD 和PPO 活性的升高，與Zheng 等[6]在草酸處理去殼高節筍以及Huang 等[32]用草酸處理香蕉的研究結果一致，同時草酸處理也下調了其對應的基因相對表達量。以上結果說明，草酸處理能夠通過維持細胞膜完整和抑制褐變相關酶活性有效抑制馬蹄筍冷藏期間的褐變。

ROS 參與了木質素合成代謝并對木質素合成有一定的促進作用[33]，而SOD 和CAT 作為細胞中重要的抗氧化酶，能夠協同作用將超氧陰離子轉變為H2O2進而分解[34]。本試驗中草酸處理通過上調SOD 和CAT 基因的相對表達量顯著提高了SOD 和CAT 的活性，從而抑制了去殼馬蹄筍中H2O2的含量和O·－2 的產生速率，這與梁春強等[35]草酸處理獼猴桃以及Ali等[13]草酸處理鮮切藕片的結果相似。說明草酸處理能夠提高去殼馬蹄筍冷藏期間抗氧化酶的活性，進而有效清除ROS 并使之維持在相對較低的水平，既降低了筍肉組織的氧化脅迫，又協同抑制了褐變和木質化進程。

4 結論

采后5 mmol·L－1草酸處理能夠抑制去殼馬蹄筍呼吸速率和失重率的上升，可通過抑制木質素合成代謝和褐變關鍵酶活性并下調其基因表達延緩去殼馬蹄筍冷藏期期間木質化進程；通過抑制褐變關鍵酶活性并下調其基因表達延緩去殼馬蹄筍冷藏期期間褐變進程；同時能夠提高抗氧化酶活性并上調其基因表達進而有效清除并維持較低的ROS 水平，從而延緩細胞膜的氧化傷害并協同輔助抑制木質化和褐變進程，有效保持了去殼馬蹄筍冷藏期間品質。