鐵皮石斛引種前后主要生物活性成分對比分析

陸方舟 張詩婧 戴亞峰 董蘭營 陸 瑤 李繼福郭曉暉 王增利

(1中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2九仙尊霍山石斛股份有限公司，安徽 六安 237000；3 北京嘉萬成生物科技有限公司，北京 102600)

鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬植物，又名鐵皮蘭、黑節草，以其莖表面呈鐵綠色而得名，是一種多年生常綠草本植物[1]，廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶以及大洋洲等地區[2]。

鐵皮石斛含有多種生物活性成分，如多糖、生物堿、黃酮、多酚類化合物等；其中，多糖被認為是鐵皮石斛最重要的生物活性物質[3]。且石斛多糖具有多種生物學作用，包括增強免疫、抗腫瘤、降血糖、抗衰老等[4－6]；生物堿具有抗氧化、抗疲勞、預防糖尿病等功效，對糖代謝、脂代謝等代謝過程也具有調控作用[7－8]；鐵皮石斛中的酚類物質在清除體內DPPH 自由基、抑制癌細胞活性等方面發揮著重要作用[9－12]；黃酮類化合物具有清除自由基和保護心血管系統等生物活性[13]。因此，開發基于鐵皮石斛為原料的功能性食品具有良好的應用前景。

鐵皮石斛對生長環境要求嚴苛，自然繁殖力極低，生長緩慢、產量較低。為滿足市場需求，20 世紀70年代，我國鐵皮石斛人工栽培技術開始發展。張志勇等[14]綜合分析了利用生物技術手段對鐵皮石斛進行人工繁殖和種質改良的方法，發現鐵皮石斛繁殖的上游技術較為成熟，種質資源的保藏與改良研究較多，而關于鐵皮石斛植株引種與南北方石斛植株差異的相關研究尚鮮見報道?；诖?，本研究針對同一品種鐵皮石斛在北京、安徽兩地發育成熟后生物活性成分進行比較，以期為鐵皮石斛引種及采收提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北京產鐵皮石斛種苗，由北京嘉萬成生物科技有限公司提供，引種的鐵皮石斛種植于連棟溫室(暖棚)，無加溫措施；安徽產鐵皮石斛種苗，由安徽圣蘭生物科技有限公司提供，種植于安徽六安的冷棚。兩地使用的種苗，為同一批次組培苗，育苗地為安徽六安，大瓶苗引入北京地區后種植，且兩地設施栽培鐵皮石斛所使用栽培基質相同。

從組培開始計算，本試驗所用鐵皮石斛為整叢第3年生分蘗新條，在第4年內采收，從根部計第二節或第三節中部到頂部，每次取樣30 根作為樣品測定原材料。采樣周期自2018年10月25日開始，至2019年9月25日止，每月25日兩地各采收一次，共計采樣12組次。

沒食子酸、氫氧化鈉、溴甲酚綠、濃鹽酸(37%)、濃硫酸(98%)、三氯甲烷、葡萄糖、苯酚，購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙醇，購自北京化工廠；福林酚(色譜純)、蘆丁(色譜純)、石斛堿(色譜純)，購自美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

FD－1A－50 真空冷凍干燥機，北京傅醫康實驗儀器有限公司；UV－5200 紫外－可見分光光度計，上海元析有限公司；FXB101－1 干燥箱，上海樹立儀器有限公司；PKB－501SS 恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；JP－120ST 超聲清洗機，北京廣達恒益有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 空氣溫濕度數據記錄 測定并獲取兩地鐵皮石斛種植溫室內一年內各月的空氣溫度與空氣濕度數據，并繪制曲線。數據每日定時人工記錄，以平均值作為該月份內溫度與濕度的特征值。

1.3.2 鐵皮石斛莖水分含量的測定 參照國標GB 5009.3－2016 中的直接干燥法測定[15]。取潔凈干燥的玻璃質扁形稱量瓶，稱取試樣2～10 g 研磨細碎后置于101～105℃干燥箱中，每0.5 h 進行一次稱量，重復操作至前后兩次質量差不超過2 mg，即為恒重。按照公式計算水分含量:

式中，X 為試樣的水分含量，g·100g－1；m1為稱量瓶(加海砂、玻棒)和試樣的質量，g；m2為稱量瓶(加海砂、玻棒)和試樣干燥后的質量，g；m3為稱量瓶(加海砂、玻棒)的質量，g；100 為單位換算系數。

1.3.3 活性成分含量的測定

1.3.3.1 多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸法測定樣本中粗多糖含量[16]。將真空冷凍干燥后的鐵皮石斛莖粉碎、過40 目篩。取0.1 g 鐵皮石斛粉加入10 mL體積分數為80%的乙醇溶液，于25℃浸提后抽濾，并用80%乙醇洗滌粉末。收集沉淀并加入20 mL 蒸餾水，結合多次超聲處理，將濾液充分混勻備用。之后于490 nm 波長處測定吸光度值，根據標準曲線計算多糖含量。

1.3.3.2 生物堿含量的測定 采用酸性染料比色法測定樣本的生物堿含量[17]。真空冷凍干燥后的鐵皮石斛莖粉碎、過40 目篩。取0.5 g 粉末倒入試管，以氨水充分潤濕干燥粉末，靜置后加入10 mL 三氯甲烷，65℃水浴2 h，冷卻后用三氯甲烷補足水浴揮發部分，過濾。將2 mL 濾液、8 mL 三氯甲烷、5 mL pH 值4.5的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液和1 mL 0.04%溴甲酚綠溶液混合并劇烈振蕩。室溫靜置后，取三氯甲烷層5.0 mL，加入1 mL 0.01 mol·L－1氫氧化鈉－無水乙醇溶液搖勻。以三氯甲烷溶液為空白對照，測定620 nm 波長處吸光度值，并根據標準曲線計算鐵皮石斛的生物堿含量。

1.3.3.3 總酚含量的測定 采用福林酚比色法測定樣本的總酚含量[18]。將真空冷凍干燥后的鐵皮石斛莖粉碎、過40 目篩。取0.1 g 干燥粉末，用10 mL 體積分數為80%的甲醇溶液室溫浸泡干燥粉末2 h，5 000 r·min－1離心10 min 后取上清液，用體積分數80%的甲醇溶液定容至25 mL，充分混合均勻，待用。待測液與標準曲線各組溶液同時測定760 nm 波長處吸光度值，根據標準曲線計算鐵皮石斛中總酚的含量。

The authors report a case of a primary cardiac dedifferentiated liposarcoma in a pregnant woman causing small bowel seeding leading to bowel intussusception.

1.3.3.4 黃酮含量的測定 參考張露月等[19]的方法測定樣本的黃酮含量，并略作修改。將真空冷凍干燥后的鐵皮石斛莖粉碎、過40 目篩。取0.2 g 干燥粉末，加入體積分數為70%的乙醇溶液10 mL，60℃水浴浸提3 h 后冷卻過濾。取濾液，用體積分數70%乙醇溶液補足至25 mL，待測。待測液按標準曲線的繪制過程中黃酮的測定方法進行操作，與標準曲線各組溶液在510 nm 波長處測定吸光度值，根據蘆丁(黃酮苷)標準曲線計算鐵皮石斛中的黃酮含量。

1.4 數據處理

采用Excel 2019 及SPSS 22 軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛種植環境空氣溫濕度全年變化

由圖1 可知，安徽六安鐵皮石斛栽培地區溫室內空氣濕度普遍高于北京地區，冬季安徽六安溫室內濕度較高，維持在40%～55%，同期北京溫室內濕度基本維持在25%～35%；北京、安徽六安兩地溫室空氣溫度變化趨勢相同，均在7月份達到全年最高月平均溫度，分別為29℃和30℃。

春季北京地區溫室空氣濕度總體低于安徽六安，而北京地區鐵皮石斛莖水分含量卻高于安徽六安鐵皮石斛(圖2)，這可能與北京地區鐵皮石斛種植設施內越冬條件設置有關。此外，北京地區連棟溫室內空氣溫度變化趨勢與安徽地區接近，9、10月份兩地空氣溫度快速下降，設施內采取降低用水量、減少灌溉次數等措施以降低植物蒸騰作用。

2.2 鐵皮石斛莖水分含量全年變化

由圖2 可知，北京地區生長的鐵皮石斛莖在10月份時水分含量最高，為86.31 g·100 g－1，在1月份含量最低，為75.39 g·100 g－1。安徽地區鐵皮石斛水分含量隨月份變化明顯，8月份水分含量最高，為90.57 g·100g－1，1月份水分含量最低，為70.41 g·100g－1。

圖2 兩產地鐵皮石斛莖水分含量變化情況Fig.2 Variation of water content in Dendrobium officinale stems from two origins

安徽地區鐵皮石斛水分含量在8月份達到峰值，極顯著高于同期北京地區鐵皮石斛(P<0.001)；北京地區鐵皮石斛莖水分含量在10月份達到峰值，極顯著高于同期安徽地區鐵皮石斛。且在1—5月份，北京地區鐵皮石斛莖水分含量極顯著高于同期安徽地區鐵皮石斛。

環境溫度與濕度是影響鐵皮石斛莖水分含量的重要因素[20]。冬季北京鐵皮石斛生長于保溫被下栽培環境濕度高于安徽，夏季6—8月濕度維持在35%～50%，低于安徽六安；此外，北京地區9月份起對石斛進行保水(減少灌溉次數)，安徽六安地區10月份開始保水，設施內空氣濕度降低至平穩水平，石斛植株水分蒸發量減少，其水分含水量保持在較高水平。

2.3 鐵皮石斛莖多糖含量全年變化

由圖3 可知，安徽、北京兩地產鐵皮石斛莖多糖含量的全年變化趨勢相似。安徽、北京地區鐵皮石斛莖多糖含量分別在9 和8月份達到峰值，分別為509.20和491.75 mg·g－1。安徽與北京兩地鐵皮石斛莖多糖含量谷值分別出現在11 和12月份，分別為269.67 和268.57 mg·g－1。

圖3 兩產地鐵皮石斛莖多糖含量變化情況Fig.3 Variation of polysaccharide content in Dendrobium officinale stems from two origins

2.4 鐵皮石斛莖生物堿含量全年變化

由圖4 可知，安徽、北京兩地區生物堿含量最高值分別出現在4 和5月份，其含量分別為0.26 和0.28 mg·g－1。除3、4月份外，北京地區鐵皮石斛莖生物堿含量普遍極顯著高于同期安徽鐵皮石斛。

圖4 兩產地鐵皮石斛莖生物堿含量變化情況Fig.4 Variation of alkaloid content in Dendrobium officinale stems from two origins

2.5 鐵皮石斛莖總酚含量全年變化

由圖5 可知，安徽地區鐵皮石斛莖總酚含量在8月份含量最高，為26.61 mg·g－1；北京地區鐵皮石斛莖總酚含量在4 和10月份達到峰值，分別為20.94 和22.45 mg·g－1，略低于安徽地區峰值。

圖5 兩產地鐵皮石斛莖總酚含量變化情況Fig.5 Variation of total phenol content in Dendrobium officinale stems from two origins

兩地鐵皮石斛莖總酚含量變化趨勢的差異主要表現在2—6月份，北京地區鐵皮石斛莖總酚含量呈先上升后下降的波動趨勢，同期安徽地區鐵皮石斛莖總酚含量則平穩上升。8月份兩地石斛總酚含量差異最大，安徽地區為峰值，北京地區則為數月內的谷值。10月份至次年1月份，北京地區鐵皮石斛莖總酚含量高于安徽地區，6—9月份則呈相反狀態。

2.6 鐵皮石斛莖黃酮含量全年變化

由圖6 可知，安徽地區鐵皮石斛莖黃酮含量在一年內出現2 個峰值，分別是1 和8月份，鐵皮石斛莖黃酮含量分別為28.91 和20.29 mg·g－1；北京地區鐵皮石斛莖黃酮含量同樣有2 個峰值，但較安徽地區出現峰值時間有所推延，峰值分別出現在2 和9月份，鐵皮石斛莖黃酮含量分別為29.13 和21.18 mg·g－1。

圖6 兩產地鐵皮石斛莖黃酮含量變化情況Fig.6 Variation of flavonoid content in Dendrobium officinale stems from two origins

3 討論

本研究分析了北京、安徽兩地鐵皮石斛在一年內水分、多糖、生物堿、總酚、黃酮類化合物含量的差異，結果表明，北京、安徽兩地鐵皮石斛莖主要活性成分含量出現峰值的時間存在明顯差異，春季和秋季是各主要活性成分峰值出現時間，提示鐵皮石斛的最佳采摘時間在春季或者秋季。

開花是影響鐵皮石斛主要生物活性成分的重要因素。試驗期間，4—5月份為兩地鐵皮石斛開花期(北京地區鐵皮石斛較安徽六安延后半月)，多糖、生物堿含量均出現上升且至峰值后迅速下降。金小麗等[21]和闕彩霞等[22]研究發現鐵皮石斛莖多糖含量在開花期前較高，開花期后顯著下降；開花季節鐵皮石斛莖黃酮含量下降至谷值，分析可能為莖稈中黃酮轉移至花上所致。另外，龔慶芳等[23]研究發現黃酮和總酚在鐵皮石斛花中含量顯著高于莖，可解釋開花期兩地鐵皮石斛莖黃酮含量的下降。

此外，鐵皮石斛莖生物活性成分含量與環境溫濕度變化有關，高溫環境下石斛莖稈多糖含量偏低；低溫低濕度環境中，鐵皮石斛生物堿含量較高。研究表明較高的夜間溫度中，石斛植株呼吸速率居高，可溶性多糖消耗較大，不易累積[24]。唐麗等[25]研究顯示，鐵皮石斛總生物堿含量受濕度影響顯著。沈永昶[26]對鐵皮石斛抗寒品系與不抗寒品系進行相關研究，發現鐵皮石斛抗寒品系的生物堿含量更高。還有報道顯示不同部位的鐵皮石斛中，生物堿含量差異較大，而葉中生物堿含量最高[27]。因此，引種后鐵皮石斛在種植過程中還原其原產地培養的溫濕度條件，可維持植物體內主要活性成分含量水平穩定，進而保證產品質量。

兩地石斛黃酮含量表現為北京地區出峰較安徽延后一個月，可能與兩地氣候差異有關。Rybarczyk-Plonska 等[28]研究發現，植物應對寒冷、干燥等不利環境因素時都會出現黃酮類化合物生物合成上調。北京地區氣候相較于安徽六安地區，氣溫在秋、冬兩季變化更加劇烈，而春季回暖，北京氣溫升高晚于安徽地區，故北京地區黃酮含量出峰更晚，且在冬季累積速度更快。

目前判斷鐵皮石斛質量的方法主要是通過測定多糖含量[29]，結合其他生物活性成分全年變化情況，建議北京地區鐵皮石斛的最佳采摘時間為每年8月份；安徽地區鐵皮石斛最佳采摘時間為每年9月份。這與毛靈芝[30]研究認為秋季為鐵皮石斛最佳采收期的結論較一致。

北京與安徽表現出近乎相同的主要活性成分生長變化曲線，其中，多糖含量峰值出現時期以及生物堿、黃酮含量的變化趨勢均十分接近，說明引種結合設施栽培技術，可獲得北方地區優質鐵皮石斛資源。引種后鐵皮石斛生物活性成分差異產生原因與栽種環境密不可分[20，31－32]，其中，影響鐵皮石斛主要生物活性成分的重要因素包括花期、環境溫度與環境濕度等。鑒于引種后北京地區鐵皮石斛莖主要活性成分總體水平與安徽地區鐵皮石斛無顯著差異，提示適合引用，故引種后可用于鐵皮石斛的生產與深加工。

4 結論

本研究結果表明，北京地區鐵皮石斛的采收最佳時間為每年8月份，安徽原種為9月份。北京引種安徽鐵皮石斛后，其莖中的主要功能成分均得到了保留，未來可用于保健食品的生產，說明引種栽培是現實可行的。但各主要功能成分的含量及比例，發生了一定的變化，是否對藥理作用產生影響，有待進一步研究。