攪拌結合pH控制10L發酵罐條件下乳酸菌發酵胡柚汁研究

李玉彤 吳祖芳 翁佩芳 陳 功

(1寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800；2四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 610000)

胡柚(Citrus paradisicv. Changshan Huyou)是柚和橙的天然雜交種，原產于浙江省常山縣，現今衢州、龍游等地均有種植[1]。胡柚營養豐富，富含氨基酸、糖類、維生素和無機元素[2]，以及酚類化合物和黃酮類化合物——柚皮苷、橙皮苷和檸檬苦素等功能性物質，這些功能物質具有較強的自由基清除能力，且具有防衰、抗癌、抗心血管病的作用[3]。總黃酮又稱作黃酮類化合物，是一類廣泛存在于果蔬等植物中的多酚類化合物[4]。近年來，以果蔬為基礎的發酵果汁受到了消費者、功能性食品生產商和研究人員的極大關注[5－6]。乳酸菌屬(Lactobacillus Beijerinck)是水果和蔬菜發酵最常用的菌屬[7]，它由一群性質相似的有益菌群組成，能降解乳糖、葡萄糖、己糖等[8]化合物，主要產生乳酸和能量[9]。乳酸菌可以降低糖或抗營養化合物含量，并將酚類化合物轉化為具有附加生物價值的分子[10]，提高營養物質的生物利用度[11]，促進維生素的合成[12]，豐富感官品質[13]。研究表明乳酸菌發酵能夠將蔬菜蛋白質降解為氨基酸、多肽等小分子物質，釋放多酚、黃酮等功能因子[14]。

發酵罐發酵是在實驗室搖瓶基礎上的放大發酵試驗，在試驗中常常會出現“放大效應”[15]。乳酸菌在發酵過程中能夠產生乳酸，導致培養體系pH 值下降，從而抑制乳酸菌的生長[16]。發酵罐可以通過控制溫度、pH 值、攪拌轉速、溫度等發酵參數有效控制整個發酵過程，同時還可以控制在發酵過程中由于溶氧、溫度等參數及營養物質傳遞等不穩定而導致發酵效果不佳的情況[17]。例如王立梅等[18]通過在7.5 L 發酵罐中控制發酵液的pH 值，緩解了乳酸菌的“酸脅迫”作用，提高了副干酪乳桿菌W2 的菌體濃度。張孝楊[19]在副干酪乳桿菌的小試試驗中發現，一定程度的攪拌可以加速菌體的生長，提高菌體的繁殖速度和菌體濃度。王昊鵬等[20]研究發現，在發酵罐放大試驗中可以通過攪拌來解決菌絲體結團現象。

目前關于乳酸菌發酵果蔬飲料的研究主要集中在實驗室水平的發酵工藝研究，而對其放大試驗方面的研究尚鮮見報道。因此本研究利用實驗室前期篩選獲得的適用于水果汁發酵的2 株優良乳酸菌植物乳桿菌L1 和發酵乳桿菌L2[21]，在搖瓶條件下考察不同裝液量及初始pH 值對細胞生長、總酚和總黃酮含量的影響及發酵過程中菌體細胞的凝聚性，并進一步通過溶氧和pH 控制研究10 L 發酵罐放大條件下胡柚汁的發酵效果，以期為益生菌發酵胡柚汁的工業化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡柚，產自浙江省常山縣，單顆重約350 g；食用小蘇打，購自山東樂暢調味品有限公司；白砂糖，購自云南阿鵬哥商貿有限公司；植物乳桿菌L1(Lactobacillus plantarumL1)、發酵乳桿菌L2(Lactobacillus fermentumL2)均為實驗室保藏菌種。

福林酚，購自北京索萊寶科技有限公司；蘆丁，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；MRS 瓊脂(man rogosa sharpe agar)，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；MRS 肉湯(MRS broth)，購自杭州微生物試劑有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、沒食子酸、碳酸鈉，均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

DK-S22 型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；HUZK24WNM 型多功能榨汁機，余姚惠人電器有限公司；5417R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；5417R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；PHS－3C 型pH 計，上海儀電科學儀器有限公司；LDZX－40B 型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；DKJ－10D 乳酸菌發酵系統，上海杜科自動化設備有限公司；HX－7.5D 全自動小型電加熱蒸汽鍋爐，上海華征特種鍋爐制造有限公司；BL7501 空氣發生器，百煉機械設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理 挑選新鮮無蟲害的胡柚，去皮，去囊衣，去籽，得胡柚果肉。按料液比2 ∶1(胡柚果肉∶水)加水榨汁，過濾，得胡柚汁。在胡柚汁中添加白砂糖(8%)并攪拌均勻，于85℃水浴鍋中巴氏滅菌15 min，冷卻至室溫。

1.3.2 培養方法及培養條件 菌種活化:分別吸取0.1 mL 由甘油管保藏的植物乳桿菌L1、發酵乳桿菌L2，置于50 mL 新鮮MRS 肉湯中37℃培養24 h。斜面培養:用移液槍分別吸取0.2 mL 活化后的菌種于凝固的MRS 瓊脂培養基上涂布，37℃培養24 h，之后用接種環分別從MRS 瓊脂上挑取一環菌落于斜面上畫線，37℃培養24 h。種子液培養:用接種環分別從斜面培養基上挑取一環菌落接種于裝有種子培養基的三角瓶中(三角瓶體積為100 mL，種子培養基體積為50 mL)，置于37℃恒溫培養箱中培養24 h。搖瓶發酵培養:將上述種子液按照3%的接種量1 ∶1(植物乳桿菌L1 種子培養液∶發酵乳桿菌L2種子培養液)接入發酵培養基中，37℃發酵28 h。發酵罐發酵條件:將種子液按照3%的接種量接種于10 L 發酵罐中，裝液量為6 L，于37℃，最適初始pH 值6.5 條件下發酵28 h。

1.3.3 試驗設計 在胡柚汁發酵過程中每隔4 h 分別從試管的上部、中部和下部取樣測定發酵胡柚汁中的活菌數考察細胞的凝集性，發酵試驗管高度為18 cm，搖瓶的上部為0～1 cm 處，中部為9～10 cm 處，下部為17～18 cm 處。

分別設定搖瓶的裝液量為70、140 和210 mL，自然pH 值，在搖瓶中發酵胡柚汁，每隔4 h 取樣測定其活菌數、總酚含量和總黃酮含量，確定適宜裝液量。

分別設定發酵初始pH 值為5.5、6.0、6.5、7.0 在搖瓶中發酵胡柚汁，裝液量為210 mL 并每隔4 h 從發酵胡柚汁中取樣測定其活菌數、總酚含量和總黃酮含量，確定適宜的初始pH 值。

在發酵罐中發酵胡柚汁并設定發酵罐恒定轉速為100 r·min－1[22]，每隔4 h 從混合菌發酵胡柚汁中取樣測定其活菌數、總酚含量和總黃酮含量，比較10 L 發酵罐中靜置發酵與攪拌發酵下的發酵效果。

以pH 控制結合攪拌為條件的10 L 發酵罐發酵:設定發酵罐恒定轉速為100 r·min－1，在菌體生長對數期的最后(發酵20 h)通過食用小蘇打調節發酵液pH值為6.0，并延長發酵時間為40 h，以延長發酵的對數期。并每隔4 h 從發酵胡柚汁中取樣測定其活菌數、總酚含量和總黃酮含量，與搖瓶發酵(發酵溫度37℃，發酵初始pH 值6.5，裝液量為140 mL，接種量3%)過程對比。

1.3.4 乳酸菌生長的測定 采用稀釋倒平板法測定樣品中乳酸菌的生長量。

1.3.5 總酚和總黃酮的測定 采用福林酚比色法測定樣品中總酚含量[23]；采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法測定樣品中總黃酮含量[24]。

1.4 數據處理

每個樣品平行測定3 次，采用SPSS 22.0 軟件進行差異顯著性(P<0.01)分析，使用OriginPro 9.1 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 胡柚汁發酵過程中菌體凝聚性

細胞自動聚集是指菌體在發酵過程中，大量、快速的繁殖從而導致其自行成團的現象[25]。由表1 可知，植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁發酵過程中菌體的凝聚性隨發酵時間的延長而逐漸增大，菌體發酵8 h 后開始凝聚，12 h 開始大量凝聚，說明乳酸菌發酵胡柚汁過程中有自凝聚能力。占萌等[26]研究表明植物乳桿菌有較強的自凝聚能力，郝露露等[27]研究表明植物乳桿菌自聚集能力超過85%，這與本研究結果基本一致。

表1 植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁發酵過程菌體的凝聚性Table 1 Aggregation of bacterial cells during Huyou fermentation of Lactobacillus plantarum L1 and Lactobacillus fermentum L2 by mixed

2.2 裝液量對胡柚汁發酵過程的影響

搖瓶裝液量是影響發酵培養基溶氧量的重要因素，故可以采用不同的裝液量來控制發酵過程中的溶氧水平[28]。由圖1-A 可知，隨著發酵時間的延長，活菌數先增加后稍有下降，且隨著裝液量的增加，植物乳桿菌L1與發酵乳桿菌L2混合發酵胡柚汁中的活菌數先增加后下降，當裝液量為140 mL 時活菌數最大，且在發酵24 h 時達到最大(1.99×1010CFU·mL－1)，當裝液量大于140 mL 時，活菌數反而降低，當裝液量低于140 mL 時，由于乳酸菌是兼性厭氧菌，所以不利于菌體的生長，這與趙靜[29]的研究結果基本一致。由圖1-B 可知，總酚含量隨著發酵時間的延長先增加后減少，裝液量為140 mL 時，植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2混合發酵胡柚汁中所含的總酚含量最高，且在發酵20 h 時含量達到最大(251 μg·mL－1)。由圖1-C 可知，總黃酮含量隨著發酵時間的延長先增加后減少，在發酵20～24 h 時植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌混合發酵胡柚汁中所含的總黃酮含量最高，當裝液量為140 mL時，發酵24 h 胡柚汁中所含的總黃酮含量高于其他裝液量，為655 μg·mL－1。故裝液量對胡柚汁發酵過程中的活菌數、總酚含量和總黃酮含量有影響，且適宜的裝液量有利于菌體細胞的生長，裝液量過高或者過低都不利于菌體的生長。

圖1 裝液量對植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁發酵過程中活菌數(A)、總酚含量(B)和總黃酮含量(C)的影響Fig.1 Effect of volume on viable bacteria population(A)、total phenol content(B)and total flavonoids(C)during Huyou juice fermentation of Lactobacillus plantarum L1 and Lactobacillus fermentum L2 by mixed

2.3 初始pH 值對胡柚汁發酵過程的影響

由圖2-A 可知，隨著發酵時間的延長，活菌數先增加后稍有下降，且在24 h 時活菌數達到最大。當發酵初始pH 值為6.5 時，植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2混合發酵胡柚汁中的活菌數達到最大為2.23×1010CFU·mL－1；當pH 值為7.0 時，菌體生長明顯受到抑制。說明植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁時菌種生長最適pH 值為6.5。洪梅等[30]研究也表明發酵乳桿菌發酵最佳初始pH 值為6.5。由圖2-B 可知，植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁中總酚含量隨著發酵時間的延長呈先增加后下降趨勢，且不同初始pH 值對總酚含量影響顯著(P<0.01)。當發酵初始pH 值為6.5 時，發酵胡柚汁中總酚含量在發酵20 h 達最大值(262 μg·mL－1)。由圖2-C 可知，植物乳桿菌L1與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁中總黃酮含量隨著發酵時間的延長呈先增加后稍有下降的趨勢，且不同初始pH 值對總黃酮含量影響顯著(P<0.01)。當發酵初始pH 值為6.5 時，混合發酵胡柚汁的總黃酮含量在發酵24 h 時最高(694 μg·mL－1)。

圖2 初始pH 值對植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁發酵過程中活菌數(A)、總酚含量(B)和總黃酮含量(C)的影響Fig.2 Effect of initial pH value on viable bacteria population(A)、total phenol content(B)and total flavonoids(C)during Huyou juice fermentation of Lactobacillus plantarum L1 and Lactobacillus fermentum L2 by mixed

2.4 攪拌發酵對10 L 發酵罐發酵效果影響

由圖3 可知，與10 L 發酵罐靜置發酵相比，100 r·min－1攪拌發酵條件下，植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁中所含的活菌數、總酚含量和總黃酮含量更高。由圖3-A 可知，攪拌發酵使得發酵對數期提前，菌體自發酵4 h 進入對數期，發酵過程中胡柚汁中的最大活菌數為2.64×1010CFU·mL－1，而靜置發酵8 h 后才進入對數期，發酵過程中的胡柚汁最大活菌數為1.95×1010CFU·mL－1。說明攪拌發酵有利于菌體的生長。由圖3-B 可知，靜置發酵與攪拌發酵的變化規律類似，總酚含量均隨發酵時間的延長呈先增加后減小趨勢，且在菌體生長的對數期，總酚含量不斷增加。攪拌發酵條件下發酵胡柚汁中的總酚含量最大值為250 μg·mL－1，而靜置發酵條件下發酵胡柚汁中的總酚含量最大值為239 μg·mL－1。由圖3-C 可知，攪拌發酵條件下發酵胡柚汁中的總黃酮含量最大值為701 μg·mL－1，而靜置發酵條件下發酵胡柚汁中的總黃酮含量最大值為665 μg·mL－1。說明攪拌有利于提高植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁中的總酚含量與總黃酮含量。

圖3 10 L 發酵罐靜置與攪拌發酵對植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁活菌數(A)、總酚含量(B)和總黃酮含量(C)的影響Fig.3 Effect of stirring and static fermentation on viable bacteria population(A)、total phenol content(B)and total flavonoids(C)of fermented Huyou juice by Lactobacillus plantarum L1 and Lactobacillus fermentum L2 in 10 L fermenter

2.5 以控制pH 結合攪拌為條件的10 L 發酵罐發酵

結合2.3 節中pH 值對搖瓶發酵的試驗結果，在攪拌發酵的基礎上，增加pH 控制發酵，結果如圖4 所示。由圖4-A 可知，pH 控制發酵胡柚汁的活菌數在發酵28 h 達到最大值(2.86×1010CFU·mL－1)，之后未經穩定期而直接進入衰亡期，這與馮慧杰[31]的研究結果相一致。由圖4-B 可知，pH 控制發酵胡柚汁的總酚含量在發酵32 h 達到最大值(268 μg·mL－1)，高于搖瓶過程中總酚含量的最大值(262 μg·mL－1)。由圖4-C可知，pH 控制發酵胡柚汁的總黃酮含量在發酵32 h達到最大值(752 μg·mL－1)，高于搖瓶發酵過程中總黃酮含量的最大值(738 μg·mL－1)。說明10 L 發酵生產時，控制pH 值并結合攪拌可提高胡柚汁發酵的活菌數、總酚含量與總黃酮含量。

圖4 10 L 發酵罐攪拌結合pH 控制對植物乳桿菌L1 與發酵乳桿菌L2 混合發酵胡柚汁活菌數(A)、總酚含量(B)和總黃酮含量(C)的影響Fig.4 Effect of pH control combined with stirring fermentation on viable bacteria population(A)、total phenol content(B)and total flavonoids(C)of fermented Huyou juice by Lactobacillus plantarum L1 and Lactobacillus fermentum L2 in 10 L fermenter

3 討論

酚類物質分為游離態和結合態兩種形式，其中游離酚主要存在于植物細胞液泡中，結合態酚分為不可溶性共價結合酚和可溶性共價結合酚[32]。本研究發現發酵后胡柚汁中的總酚含量與總黃酮含量增加，可能是由于乳酸菌在發酵過程中分泌的糖苷酶(如β－葡萄糖苷酶[33])和酚酸酯酶(如阿魏酸酯酶[34])，將不溶性膳食纖維結合的酚類物質釋放為可溶的游離態，同時也釋放不溶性膳食黃酮為水溶性黃酮苷[35]。

搖瓶發酵試驗結果顯示，胡柚汁發酵過程中，乳酸菌菌體細胞有較強的凝聚能力。少量的氧氣有利于乳酸菌菌體細胞的生長，原因可能由于乳酸菌一般是兼性厭氧，其中的乳酸脫氫酶活性直接影響乳酸菌的增殖[36]，乳酸脫氫酶活性受供氧量的影響，在好氧情況下，乳酸脫氫酶活性較低，發酵胡柚汁中的活菌數減少，且李志華[37]研究表明β－葡萄糖苷酶的產量隨活菌數的增多而增加，在生長穩定期和衰亡期β－葡萄糖苷酶含量逐漸減少，所以發酵胡柚汁中活菌數的減少也影響到總酚及總黃酮的含量。pH 值影響菌體的生長、總酚及總黃酮含量的原因可能是由于pH 值影響菌體細胞膜電荷狀況，可引起膜滲透性的變化并影響營養物離子化程度，從而影響菌體對養分的吸收[38]；pH 值也影響酚、黃酮類代謝相關酶的活性，余奕宏等[39]研究表明發酵液中初始pH 值的變化，可影響β－葡萄糖苷酶的活性，從而影響總酚和總黃酮的含量。

本研究在搖瓶發酵的基礎上進行10 L 發酵罐試驗，研究表明通過建立補料pH 控制策略，即選擇在發酵的對數期的最后即發酵20 h 開始流加小蘇打至發酵液pH 值為6.0，并延長發酵時間為40 h，胡柚汁發酵過程中活菌數、總酚含量、總黃酮含量的最大值均高于搖瓶發酵下的水平。但有關10 L 發酵罐發酵胡柚汁的風味有待進一步研究。

4 結論

本研究通過分析搖瓶發酵裝液量、初始pH 值對L1 與L2 混合發酵胡柚汁中活菌數、總酚含量與總黃酮含量的影響以及發酵過程中的菌體凝聚性，確定胡柚汁飲料10 L 發酵罐發酵的條件為，攪拌速度100 r·min－1，在發酵20 h 調節發酵胡柚汁的pH 值6.0 并延長發酵時間為40 h。在此條件下發酵的胡柚汁中活菌數、總酚含量與總黃酮含量的最大值分別為2.86×1010CFU·mL－1、 268 μg·mL－1和752 μg·mL－1，此結果均高于搖瓶發酵的最高值。本研究結果為乳酸菌發酵果蔬飲料的工業化規模生產奠定了一定的基礎。