[噻唑基－2－14C]－毒氟磷在產蛋雞體內的分布

駱沛文 張素芬 張晗雪 胡 成 余志揚 李秦衎柴立紅 葉慶富

(1浙江大學原子核農業科學研究所/農業農村部和浙江省核農學重點實驗室，浙江 杭州 310058；2 上海啟甄環境科技有限公司，上海 201403)

毒氟磷(Dufulin，N－[2－(4－甲基苯并噻唑基)]－2－氨基－2－氟代苯基－O，O－二乙基膦酸酯)是貴州大學自主創制的新型植物抗病毒劑，對煙草、黃瓜、番茄、水稻病毒病具有良好的防治效果[1－3]。毒氟磷通過觸發煙草水楊酸信號傳導通路誘導作物的抗病毒能力，還可以干擾病毒的蛋白表達[4－6]，且施用毒氟磷對作物生長有促進作用[7]。此外，毒氟磷具有低毒的特點，對蜂、鳥等環境生物均不構成危害[8]，有良好的應用前景。

近些年，針對毒氟磷環境行為的研究逐步開展，Zhu 等[9]、Zhang 等[10]及鄭坤明等[11]分別研究了毒氟磷在不同作物－土壤體系中的殘留消解規律。Shi等[12]研究了毒氟磷手性異構體在玉米中的降解動態；Zheng 等[13]發現在西瓜露地條件下(R)－毒氟磷比(S)－毒氟磷消解相對更快；Al-shaalan 等[14]研究了毒氟磷在水－沉積物體系中的手性選擇性降解。Wang等[15]推測毒氟磷在土壤中會發生降解，芐基與氨基相連的C-N 鍵斷裂形成2－氨基－4－甲基苯并噻唑。值得關注的是，農藥施用后會在農作物中殘留，通過食物鏈的傳遞在動物體內富集，一方面會危害動物健康，影響產能，另一方面會造成動物源食品安全問題，從而威脅到人類健康[16－17]，在我國不同地區及其他國家都曾發現動物源食品農藥污染的情況[18－21]。美國環境保護局(United States Environmental Protection Agency，EPA)、經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)等規定，在農藥登記時必須提供擬登記農藥在禽畜中殘留分布與代謝的研究資料。Chen 等[22]研究了不同構型的毒氟磷母體在大鼠體內的殘留分布，結果表明，不同劑量下毒氟磷母體在大鼠血液中均呈先上升后下降的變化趨勢，(R)－和(S)－毒氟磷在血液中的半減期相似但明顯低于其外消旋體的半減期；毒氟磷在組織中的殘留主要分布在肝臟中。然而，有關毒氟磷在畜禽中分布代謝相關研究鮮見報道，尚不明確其在畜禽中的殘留分布特征及代謝規律。因此，研究毒氟磷在家禽體內的殘留分布特征對全面評價其安全性具有重要意義。

本研究采用14C 示蹤方法，通過口服灌胃的方式單劑量連續多次給藥，將[噻唑基－2－14C]－毒氟磷引入產蛋雞體內，研究其在產蛋雞體內的吸收分布特征與排泄規律，旨在為全面、科學評價毒氟磷在家禽中的安全性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標記化合物[噻唑基－2－14C]－毒氟磷和[芐基－14C]－毒氟磷由浙江大學和上海啟甄環境科技有限公司共同合成[23－24]。標記化合物的質量指標分別通過高效液相色譜－質譜聯用技術(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)、高效液相色譜－液閃測量聯用技術(high performance liquid chromatography-liguid scintillation counting，HPLC-LSC)、 高效液相色譜紫外檢測法(high performance liquid chromatography-ultraviolet，HPLCUV)測得:比活度分別為20.45 和19.91 mCi·mmol－1；放射性化學純度均大于97%；化學純度均大于99%；質荷比m/z 為409.115(ESI＋)。2 種標記化合物結構式如圖1 所示。

圖1 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷(a)和[芐基－14C]－毒氟磷(b)結構式Fig.1 Structure of [thiazyl－2－14C]－Dufulin(a) and[benzyl－14C]－Dufulin(b)

1.1.2 試驗動物 大羽白肉雞(Gallus gallus domesticus，以下簡稱“白羽雞”)，購于上海玉章禽蛋專業合作社，均處于25～40 周齡，即處于穩定產蛋期。喂養飼料為市售產蛋雞配合飼料，購自石家莊正大有限公司；口服灌胃液溶劑為市售金龍魚非轉基因葵花籽油。

1.1.3 試劑 甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二甲苯、乙二醇乙醚，均為分析純，購自北京國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇、閃爍純試劑:2，5－二苯基惡唑(PPO)、1，4－雙[2－(5－苯基惡唑)](POPOP)，均為色譜純，購自上海TCL 公司。閃爍液A、閃爍液B(堿性閃爍液)自配。

1.2 試驗設計

1.2.1 口服灌胃液配制 根據OECD《畜禽中農藥代謝試驗準則》中的建議，家禽代謝試驗的給藥量不低于10 mg·kg－1diet。本 試 驗 設 計 的 給 藥 量 按10 mg·kg－1diet，每只雞日食量110 g 計算，即每只雞每天給藥1.1 mg，每只雞每天放射性標記物引入量為25 μCi，連續7 d 給藥累計引入175 μCi。以市售葵花籽油作為溶劑配制灌胃液，具體配制方法如下:

稱取15.0±0.1 mg 比活度為20.45 mCi·mmol－1的[噻唑基－2－14C]－毒氟磷，并稱取40.0±0.1 mg 化學純度為99.1%的非放射性毒氟磷原藥，用葵花籽油溶解并定容至10 mL 容量瓶，上下顛倒混勻后，轉入樣品瓶中，獲得濃度為1.1 mg·mL－1、比活度為8.73 mmCi·mmol－1的灌胃液。于4℃條件下保存備用。[芐基－14C]－毒氟磷口服灌胃液的配制方法同上。

1.2.2 試驗動物培養及給藥 試驗設置6 個重復，隨機選擇6 只健康白羽雞。試驗開始前一周，移入代謝籠進行適應飼養，每只雞單獨飼養于一個代謝籠內，試驗前禁食12 h，期間自由飲水。試驗期間，每日定時定量投喂飼料。

試驗采用單劑量多次給藥方式。試驗開始后，連續7 d，每日同一時間點分別向每只產蛋雞經口灌服1 mL 1.2.1 中配制的灌胃液。每次給藥前后稱量給藥器械質量，以質量差計算實際給藥量。每日給藥后將產蛋雞放回代謝籠，自由飲水進食。最后一次給藥6 h 后用乙醚麻醉，然后將6 只產蛋雞處死解剖。[芐基－14C]－毒氟磷的培養及給藥方法同上，也設6 個重復。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 血樣采集與處理 第1 天給藥后1、3、6、12 h及第2～第6 天每日給藥后6、12 h 分別進行1 次翅靜脈采血，每次采集約1 mL 于1.5 mL 抗凝離心管；解剖時從心臟采血。然后立即對采集的血樣進行分析，剩余樣品于4℃冷藏保存。

吸取200 μL 血樣于1 mL 離心管，4 000 r·min－1離心10 min，吸取上清液50 μL 于閃爍瓶中，加入10 mL閃爍液A，設置3 個平行，于Tricarb－4910 TR 型液體閃爍測量儀(liquid scintillation counter，LSC)(美國PerkinElmer 公司)測量其放射性。另取50 μL 血樣于燃燒船，設置3 個平行，進行氧化燃燒，10 mL 閃爍液B 收集14CO2并用LSC 測量其放射性。

1.3.2 蛋樣采集與處理 根據實際情況，每日給藥后的12、24 h 進行2 次采集。蛋樣采集后稱重處理，用開蛋器將蛋殼開口，小心將蛋液倒入蛋液分離器將蛋清和蛋黃分開，分別稱重，于－25℃冷凍保存。

分離后的蛋殼粉碎后混勻，稱取0.10±0.01 g 于燃燒船，進行氧化燃燒分析，設置3 個平行；蛋清、蛋黃分別渦旋混勻后，稱取0.10±0.02 g 于燃燒船，設置3個平行，進行氧化燃燒，10 mL 閃爍液B 收集14CO2并用LSC 測量其放射性。

1.3.3 排泄物樣品采集與處理 每日給藥后12 和24 h 分別采集一次排泄物，記錄鮮重，然后置于－25℃預凍2 h 后，置于－86℃真空冷凍干燥機干燥，干燥時長48 h，凍干后稱量記錄樣品凈重。冷凍干燥樣品置于－25℃冷凍保存。

冷凍干燥處理后的排泄物樣品磨碎混勻，稱取0.10±0.01 g 于燃燒船，設置3 個平行，進行氧化燃燒分析，10 mL 閃爍液B 收集14CO2并用LSC 測量其放射性。

將排泄物中累計放射性占累計引入量的比值定義為累計排泄率(cumulative excretion，CE)，根據公式計算每日累計排泄率:

式中，ai為第i天給藥后0～24 h 排泄物的放射性活度，Ai為第i天引入的標記化合物放射性活度。

1.3.4 組織樣品采集與處理 解剖后采集腿肌、胸肌、翅、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、膽囊、胃(嗉囊、腺胃、肌胃)、大小腸(包括小腸、十二指腸、大腸)、盲腸、脂肪、卵巢、皮、腦。其中，胃、腸中內容物取出單獨保存；膽囊切開后，膽汁轉移至50 mL 離心管中保存，剩余部分另裝袋保存。以上所有樣品稱重并記錄，于－25℃冷凍保存。

膽汁樣品解凍后，渦旋混勻取約0.1 g(稱重并記錄)于閃爍瓶中，加入10 mL 閃爍液A，設置3 個平行，LSC 測量其放射性。其余樣品均質處理，稱取0.10±0.01 g 于燃燒船，設置3 個平行，進行氧化燃燒，10 mL閃爍液B 收集14CO2并用LSC 測量其放射性。

1.3.5 膳食風險評估方法 參考國際糧農組織(The Food and Agriculture Organization，FAO)及世界衛生組織(World Health Organization，WHO)對食品中化學品膳食暴露的評估指導準則[25]，以每日膳食暴露量(estimated daily intake，EDI)與農藥最大允許日攝入量(acceptable daily intake，ADI)比較作為風險描述，計算安全限值(margin of safety，MOS)進行風險評估。具體計算方式如下:

式中，C 為殘留物濃度，Q 為食物品日攝入量，bw為體重。若MOS≤1 則表明待評估殘留物對食品安全的風險是可以接受的。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0、Origin 9.0 對試驗數據進行統計處理與分析，采用單因素方差分析(One-way analysis of variance，ANOVA)檢驗差異的顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在產蛋雞體內的物料平衡

口服給藥7 d 后，[噻唑基－2－14C]－毒氟磷的物料平衡概況如圖2 所示。[噻唑基－2－14C]－毒氟磷總回收率為90.10%。其中，排泄物占主要部分，占引入量的82.24%，其次是組織(3.81%) 和腸內容物(2.90%)，胃內容物(1.15%)最少。根據OECD 動物代謝試驗準則，動物體物料平衡試驗中，放射性回收率介于90%～110%即符合要求。考慮到實際試驗過程中，處置后的籠具存在清洗損失，上述回收率是合理的。

圖2 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷的放射性回收率Fig.2 The recovery of radioactivity of[thiazyl－2－14C]-Dufulin

2.2 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在產蛋雞體內排泄率動態變化

[噻唑基－2－14C]－毒氟磷累計排泄率隨給藥時間變化規律如圖3 所示。[噻唑基－2－14C]－毒氟磷進入產蛋雞體內后，會直接或經過生物轉化后隨排泄物排出體外。連續給藥1～6 d，[噻唑基－2－14C]－毒氟磷累計排泄率總體呈上升趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，最高達到87.04%。由于7 d 給藥后6 h 即處置解剖，累計排泄率有所下降。7 d 累計排泄率為82.24%。

圖3 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷的累計排泄率動態變化Fig.3 The dynamics of cumulative excretion of[thiazyl－2－14C]－Dufulin

1 d 口服給藥后0～12 h 及12～24 h 的排泄物放射性活度占1 d 引入量比值如圖4 所示。毒氟磷在產蛋雞體內消除速度快，給藥后12 h 內，引入量的63.42%即隨糞尿排出體外；12～24 h 內，排泄水平相對變低，排出引入量的18.62%；給藥24 h 后累計的排泄率為82.04%。

圖4 1 d 給藥后[噻唑基－2－14C]－毒氟磷的排泄概況Fig.4 Excretion profiles of [thiazyl－2－14C]－Dufulin after 1 d oral administration

上述結果表明，毒氟磷在產蛋雞體內的殘留物主要通過糞尿排泄出體外消除。因此，有必要進一步關注雞糞還田后毒氟磷及其代謝產物對環境造成的影響。

2.3 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在產蛋雞組織中的殘留分布

連續給藥[噻唑基－2－14C]－毒氟磷7 d，最后一次給藥6 h 后對產蛋雞解剖并檢測各組織的放射性活度以闡明其在產蛋雞組織中的殘留分布特征。不同組織中放射性殘留分布情況如圖5 所示。在蛋、皮、血樣、腦、脾、心、卵巢以及肌肉組織如腿肌、翅肌、胸肌中均未檢出放射性。上述結果表明，14C－毒氟磷及其14C 代謝物不易在上述組織中形成殘留。放射性殘留主要集中在胃、膽汁、大小腸、膽囊壁、盲腸、肝中。組織中的殘留量均不超過引入量的2.50%；胃中放射性殘留相對最高(占引入量的1.36%～2.47%)；肝中的放射性殘留占引入量的0.07%～0.11%。毒氟磷不易在肺、腎、脂肪、胰腺中殘留蓄積，各組織放射性總殘留量均不超過引入量的0.006%。

圖5 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在產蛋雞組織中的殘留分布Fig.5 The residual distribution of [thiazyl－2－14C]－Dufulin in laying hen tissues

將14C 殘留量按母體的相對分子質量折算可得不同組織中[噻唑基－2－14C]－毒氟磷的殘留濃度，如表1 所示。膽(包括膽囊壁、膽汁)殘留濃度相對最高，其次是胃、盲腸、大小腸、肝。肺、腎、胰腺、脂肪中放射性殘留水平比較低(<0.05 mg·kg－1)。

表1 不同組織中[噻唑基－2－14C]－毒氟磷的殘留濃度Table 1 The residual concentration of [thiazyl－2－14C]－Dufulin in different tissues

上述結果中，血樣未檢出放射性，而肝、膽等組織中檢測到放射性殘留，可能是由于首關效應[26]，進入全身循環的毒氟磷含量減少，在翅靜脈采集的血樣中難以檢測到放射性。但通過多次給藥的累積作用，毒氟磷會在肝臟、膽等代謝、排泄組織中形成殘留。

3 討論

3.1 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在產蛋雞體內的膳食風險評估

已有研究表明[27－28]，部分含磷有機物農藥通過食物鏈富集在肉類食物中，人類食用后會造成癌癥以及免疫系統和激素功能異常等問題。雞是人類日常食用的肉類食物之一，毒氟磷在其可食用組織中的殘留分布特征對毒氟磷安全性評價有重要參考價值。

《GB 2763－2019 食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[29]規定毒氟磷 ADI 為 0.54 mg·kg－1bw·d－1。根據國家衛健委《中國居民膳食指南(2016)》[30]推薦中國居民畜禽肉攝入量75 g·d－1、蛋及其制品50 g·d－1、動物內臟每次25 g，成人體重以60 kg 計算可得成人膳食產蛋雞組織中[噻唑基－2－14C]－毒氟磷殘留暴露評估結果如表2 所示。

表2 成人膳食產蛋雞組織中[噻唑基－2－14C]－毒氟磷殘留暴露評估Table 2 Adults dietary exposure assessment of[thiazyl－2－14C]-Dufulin in laying hen tissues

由表2 可知，毒氟磷在產蛋雞組織中的膳食暴露量低，安全限值遠低于1。實際禽肉攝入是由不同組織共同組成，且殘留物由毒氟磷母體及其代謝產物組成，因此實際毒氟磷暴露量低于表中值。由此可見，在1.1 mg·kg－1diet·d－1的暴露水平下，毒氟磷在產蛋雞體內的殘留不構成膳食風險。

已有研究表明，毒氟磷原藥亞慢性經口毒性試驗未見臟器明顯病理改變[31]，但對其在動物體內代謝產物的結構及毒性尚不明確，后續需對組織殘留物的組成做進一步研究，對毒氟磷代謝產物進行結構鑒定，從而對毒氟磷在產蛋雞體內的殘留分布進行全面、客觀的安全性評價。

3.2 不同標記位置的14C－毒氟磷在產蛋雞體內殘留分布的比較

[芐基－14C]－毒氟磷在產蛋雞體內的累計排泄率及不同組織中的殘留分布如表3、表4 所示。[芐基－14C]－毒氟磷在產蛋雞體內累計排泄率的變化趨勢與[噻唑基－2－14C]－毒氟磷相同，經方差分析兩者在相同時間的累計排泄率無明顯差異(P>0.05)。[芐基－14C]－毒氟磷在組織中的殘留分布同樣主要集中于消化系統中，胃中放射性殘留占引入量比相對最高，其次是膽汁、大小腸、膽囊壁、盲腸、肝。2 種標記的14C－毒氟磷在相同組織中的殘留量占引入量比均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 2 種14C－毒氟磷在產蛋雞體內的累計排泄率Table 3 Cumulative excretion of [thiazyl－2－14C]－Dufulin and [benzyl－14C]－Dufulin in laying hens

表4 2 種14C－毒氟磷在產蛋雞組織的殘留分布Table 4 The residual distribution of [thiazyl－2－14C]－Dufulin and [benzyl－14C]－Dufulin in laying hens tissues

由此可見，[芐基－14C]－毒氟磷與[噻唑基－2－14C]－毒氟磷在產蛋雞體內的排泄、組織分布特征相同，究其原因是毒氟磷在產蛋雞體內會通過羥基化反應和葡萄糖醛酸軛合反應形成極性更大的代謝產物，包括苯并噻唑苯環上甲基的鄰位或間位羥基化的產物，以及該產物與葡萄糖醛酸形成的軛合物，毒氟磷母體及羥基化毒氟磷的膦酸酯鍵脫乙基的產物(本實驗室另外的未發表試驗結果)。上述產物的結構中，噻唑基標記14C 及芐基標記14C 均未丟失，故利用放射性表征兩者在產蛋雞體內的排泄、分布特征時不存在差異是合理的。因此，在僅研究毒氟磷在產蛋雞體內的殘留分布情況而不涉及代謝產物鑒定時，考慮到科研成本只需選擇單一位置標記。

4 結論

本研究以產蛋大羽白肉雞為試驗對象，采用14C示蹤技術以經口多次給藥的方式引入[噻唑基－2－14C]－毒氟磷，研究了毒氟磷在產蛋雞體內的吸收分布及排泄特征，發現毒氟磷在產蛋雞體內主要通過排泄物排出體外；毒氟磷在產蛋雞組織中殘留量低，在胃、腸、膽、肝等組織中的殘留不超過引入量的2.5%；在蛋、肌肉(腿、胸、翅)、腦、脾、卵巢等組織中未檢測到放射性殘留。經膳食風險評估，毒氟磷在產蛋雞體內的殘留不會對人體健康構成危害。