花生黑腐病抗病品種篩選及抗病相關酶活性測定

袁匯濤 張云霞 向梅梅 羅 梅 董章勇

(1仲愷農業工程學院植物健康創新研究院，廣東 廣州 510225；2仲愷農業工程學院農業與生物學院，廣東 廣州 510225)

花生黑腐病(peanut black rot)是由花生黑腐病菌(Calonectria ilicicola，冬青麗赤殼，無性階段為寄生柱帚霉Cylindrocladium parasiticum)引起的花生毀滅性病害。該病于1966年首次在美國喬治亞州的花生產區被發現[1]，隨后擴散到日本、韓國和澳大利亞等國家[2－6]。2009年，我國首次發現花生黑腐病，部分花生產區發病率高達50%[7]；隨后，還發現了由花生黑腐病菌引起的大豆紅冠腐病，該菌對華南地區的優質大豆品種具有極強的侵染力，個別地塊發病率高達80%[8]。潘汝謙等[9]根據國際植物檢疫措施標準規定的有害生物風險性分析程序，評估得出花生黑腐病菌在中國屬于高度風險性有害生物，對花生和大豆等作物的生產構成嚴重威脅。我國修訂的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》將花生黑腐病菌列為新外來入侵檢疫性病菌[10]。

花生黑腐病菌的侵染力強，寄主范圍廣，能以微菌核的形式在土壤中存活很長時間，可通過種子、帶菌土壤、病殘組織等多種途徑傳播[9，11－12]。一旦侵染發病，可引起花生的果針、莢果和根系變黑腐爛，最終導致患病植物萎焉和死亡，造成損失一般在10%以上，受害嚴重時損失率高達50%[1，6]。殺菌劑雖然可以有效減少苗期病害的產量損失[6，13－14]，但篩選和培育抗病品種是防治病害最為經濟、有效和環保的途徑[15－19]。藍國兵等[20]用苗期接種法對廣東推廣種植的15 個主要花生品種的花生黑腐病抗性水平進行了鑒定，篩選到2 個抗病品種，1 個高感品種。但該研究篩選的花生品種數量較少，且未對其抗性機制進行探究。

本研究擬通過幼芽水培接種方法對128 個花生品種進行花生黑腐病的抗性鑒定，通過盆栽接種方法進行檢驗，并測定花生接種病原菌后抗病相關酶活性的變化，以期為花生黑腐病抗病育種及品種的田間應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生黑腐病菌菌株Ci14017 分離自廣東省梅州市花生田間病株，由仲愷農業工程學院植物病理重點實驗室保存。128 個供試花生品種(或材料)由仲愷農業工程學院鄭奕雄教授惠贈。

1.2 抗病性評價標準

根腐等級參照Dong 等[21]的方法劃分為5 級，分級標準描述如下:0 級:沒有癥狀；1 級:莖基部輕微變褐；2 級:莖基部變黑，主根變黑長度小于50%；3 級:莖基部變黑，主根變黑長度大于50%，有少許次生根存在；4 級:主根完全變黑并開始腐爛，次生根腐爛掉落；5 級:主根完全變黑腐爛，植株萎蔫甚至死亡。

病情指數＝∑(各級發病株數×各級代表數值)/(調查總數×最高病情級數)×100。

免疫(Ⅰ):病情指數＝0；高抗(HR):0<病情指數≤10；中抗(MR):10<病情指數≤20；中感(MS):20<病情指數≤30；高感(HS):病情指數>30。

1.3 水培花生的抗病性測定

選取健康的花生種子放入培養皿中，加無菌水放置于30℃培養箱中黑暗催芽2 d。每隔12 h 換一次水。選取胚根1～2 cm 長的幼芽用于試驗。

將花生黑腐病菌接種于馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose，PD)培養液中，25℃、180 r·min－1培養5 d。用滅菌紗布過濾菌液，刮取菌絲，吸干水分后稱取5 g 菌絲加入1 L 無菌水中勻漿備用。幼芽以0.5%菌絲懸浮液浸泡10 min 接種，保濕2 d 后水培，25℃光照培養室中生長10 d 后觀察。對128 份花生品種進行抗病性鑒定，以無菌水為對照，每個品種3 次重復，每個重復10 株。

1.4 盆栽花生的抗病性測定

稱取30 g 燕麥粒煮沸30 min，裝入100 mL 組培瓶中滅菌，將花生黑腐病菌接種至燕麥粒培養基上，25℃培養7 d，晾干備用。

將T09、AS09、P562、桂花35、云花生1 號等5 個花生品種催芽，以帶菌燕麥粒拌土接種法進行溫室盆栽抗性試驗，接種濃度為0.5%，每次品種3 次重復，每次重復10 株。25℃恒溫光照培養室中培養30 d 后觀察。

1.5 抗病相關酶的提取和活性測定

以T09 和P562 兩個花生品種為研究對象，采用上述幼芽水培的方法進行病原菌接種。每個處理3 次重復，每次重復15 粒種子。分別于接種后0、0.25、0.5、1、3、5、7、9 d 取樣，提取粗酶液進行酶活性的測定。

過氧化物酶(peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo-nialyase，PAL) 和多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)提取和活性測定參照范蘭蘭等[22]的方法；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的提取和活性測定參照王輝[23]的方法。

1.6 數據處理

數據的統計分析使用Excel 軟件與DPS 進行。

2 結果與分析

2.1 水培花生的抗病性評價

由表1 可知，病情指數大于30 的品種有72 個，病情指數為20～30 的品種有43 個，病情指數為10～20品種有13 個，病情指數在10 以下的品種有1 個。由此可知，128 個花生品種中，對花生黑腐病表現出免疫、高抗、中抗、中感、高感的品種分別有0、1、13、42 和72 個，分別占供試花生品種的0、0.8%、10.2%、33.7%和56.3%。其中，T09 的病情指數最低，為8.0，發病率為36.7%；P562 的病情指數最高，為46.0，發病率為100%。

表1 128 個花生品種抗花生黑腐病的病情統計Table 1 Disease statistics of 128 peanut varieties resistant to peanut black rot

2.2 盆栽花生的抗病性評價

以水培測試后確定不同抗性的T09(HR)、AS09(MR)、P562(HS)、桂花35(HS)、云花生1 號(MS)為研究對象，以帶菌燕麥粒拌土接種法進行花生盆栽抗性試驗。接種30 d 后觀察發現，接種花生黑腐病菌的花生植株全部發病，根部基本變黑或腐爛死亡，而對照花生根莖健康無病癥(圖1)。其中，P562 花生發病最為嚴重，植株死亡率為41.1%，部分植株莖基部已經長出紅色子囊果；桂花35 發病程度次之，植株死亡率為25%，亦有部分死亡植株莖基部長出子囊果；而云花生、AS09、T09 發病程度較輕，死亡率分別為15%、13.3%和11.1%(表2)。由此可見，T09 最抗病，P562最感病。盆栽試驗的結果與幼芽水培接種試驗的結果一致。

2.3 抗病相關酶活性的變化

2.3.1 PAL 活性的變化 由圖2 可知，T09 和P562兩個品種接種花生黑腐病菌后，PAL 活性均升高。其中，高抗品種T09 的PAL 活性在接種后0.5 和5 d 分別出現高峰，而高感品種P562 在接種后1 d 出現高峰。T09最大峰值為451.09 U·g－1·h－1FW，P562最大峰值為318.37 U·g－1·h－1FW。抗病品種在接種病原菌后PAL 活性峰值出現較早，峰值出現的次數也較多；感病品種在接種病原菌后PAL 活性峰值出現較晚，峰值出現的次數較少。

表1(續)

2.3.2 PPO 活性的變化 由圖3 可知，T09 和P562 兩個品種接種花生黑腐病菌后PPO 活性均升高，高抗品種T09 的PPO 活性在接種后0.5 d 出現峰值，最大峰值為271.67 U·g－1·min－1FW；高感品種P562 在接種后1 d出現峰值，最大峰值為160.02 U·g－1·min－1FW。高抗品種接種病原菌后其酶活性出現峰值較早且峰值大，而高感品種接種病原菌后其酶活性出現峰值較晚且峰值較小。

表2 不同花生抗性品種室內盆栽試驗花生黑腐病的發病情況Table 2 Incidence of black rot of peanut in laboratory pot experiment of different peanut resistant varieties

2.3.3 POD 活性的變化 由圖4 可知，兩個品種接種花生黑腐病菌后POD 活性均升高，其中，高抗品種T09的POD 活性在接種后0.5 d 出現高峰，最大峰值為239.23 U·g－1·min－1FW，高感品種P562 均在接種后0.25 d 出現高峰，最大峰值為135.75 U·g－1·min－1FW。高抗品種接種病原菌后其酶活性雖出現峰值較晚但峰值較高，而高感品種接種病原菌后其酶活性雖出現峰值較早但峰值較低。

2.3.4 SOD 活性的變化 由圖5 可知，兩個品種接種花生黑腐病菌后SOD 活性均升高，其中，高抗品種T09 在接種后的第7 天出現高峰，最大峰值為28.08 U·g－1·h－1FW；高感品種P562 在接種后的第3 天出現高峰，最大峰值為16.79 U·g－1·h－1FW。

3 討論

本研究使用幼芽水培接種的方法對128 個花生品種的抗性進行篩選，通過帶菌燕麥粒拌土接種的方法對不同抗性水平的5 個品種進行檢驗，結果與幼芽水培接種鑒定的結果一致。關于花生黑腐病抗性鑒定方法有田間自然誘發鑒定和溫室人工接種鑒定兩種[20]。然而，田間影響花生黑腐病發生的因素有很多，因此田間自然誘發的鑒定結果穩定性不高，試驗重復性較差。溫室人工接種鑒定方法有微菌核拌土接種法和麥粒菌種拌土接種法，但微菌核拌土接種最少需要12 周，麥粒菌種拌土接種最少需要7 周，試驗周期較長[21，24]。本研究所建立的菌絲懸浮液浸泡幼芽，保濕后水培的花生黑腐病抗性鑒定方法簡便、高效，10 d 即可獲得結果，且所得結果穩定性好、重復性高，非常適合應用于苗期抗病品種的大規模篩選。

本研究的128 個花生品種對黑腐病表現出抗病和感病的品種分別為14 和114 個，占11%和89%。藍國兵等[20]對15 個花生品種進行抗性水平鑒定，獲得抗病和感病品種分別為9 和6 個，占60%和40%。抗感品種的比例有較大差別，原因可能有以下三點:首先，使用的花生品種不一樣，難以直接對比；其次，接種方法和抗性標準不同也可能會造成鑒定結果的差異；再次，其他研究選擇的是致病力中等的菌株進行抗病性鑒定，而本研究所用的Ci14017 菌株則是高致病力菌株，雖然沒有直接比較兩者之間的致病力差異，但使用的菌株不同也可能是造成鑒定結果的比例有差異的原因。本研究盡管沒有篩選出對花生黑腐病免疫的品種，但只要擴大篩選范圍，將會繼續豐富抗病品種的數量，為花生品種的推廣和布局提供更充足的依據。

本研究所鑒定的128 份品種多數為農家種和外引材料，未涉及非近緣種和野生種。抗性鑒定結果表明，雖然不同遺傳背景花生品種對黑腐病的抗性存在差異，但大部分為感病品種，高抗花生黑腐病型材料嚴重缺乏。本研究結果表明，表現中抗的品種大部分為農家種，因此應重視和加強對農家種、野生種和非近緣種的篩選鑒定。同時，要特別重視材料水平抗性的鑒定和篩選，確保材料抗病性的穩定和適用范圍。

PAL、PPO、POD 和SOD 被認為和抗病性密切相關[25－28]，在抗病花生品種中酶的活性會顯著升高[22，29]。本研究選用高抗品種T09 以及高感品種P562 測定PAL、PP、 POD 和SOD 活性。在接種花生黑腐病菌之前，T09 的4 種酶活性都比P562 的高，說明這些酶都不同程度地參與了花生的抗病性，并且在抗病品種中參與程度更高。在接種花生黑腐病菌之后，T09 的4 種酶活峰值比P562 的更高，表明在病原菌的脅迫下，抗病品種的防御相關酶得到充分的誘導，更多抗性物質被調用，形成保護屏障，抵抗病原微生物的侵害。

4 結論

本研究128 個花生品種對花生黑腐病表現出抗病和感病的品種分別14 和114 個，占11%和89%；其中T09 為高抗品種，P562 為感病性最高的高感品種。在接種花生黑腐病菌之前，T09 的PAL、PPO、POD 和SOD 四種酶活性都比P562 的高；在接種花生黑腐病菌之后，T09 的四種酶活峰值均比P562 的更高。本研究為后續深入探討花生黑腐病的抗病機制及花生高抗品種的選育奠定了基礎。