干酪乳桿菌發酵制備酸奶味香精基料的研究

任文彬，李玉坤，汪薇，白衛東

(仲愷農業學院 食品輕工業學院，廣州 510225)

奶味香精，也可以稱作乳香香味劑或乳香香精，是食品工業中應用最為廣泛的食品香精之一[1]，主要應用于乳制品、糖果、冷食、飲料、烘焙食品等的增香。香基也稱基香劑或主香劑，因其不直接用于加香產品中，只作為香精的香氣主要組分，所以是配制香精的基礎，故稱它為香精的半成品[2]。

奶味香精的乳風味主要來源于乳脂肪的分解。其次，蛋白質和乳糖通過化學反應、酶水解和微生物發酵作用產生的風味物質也是奶味香精乳風味的重要來源[3]。制備奶味香精的方法主要有化學法和生物法。化學法主要是根據已確認的香味物質,采用化學合成的方法制備單體香原料。

生物法制備奶味香精采用成本較低的奶作為原料，原料的利用率將近100%，整個生產過程對環境不會造成污染。生物法制備奶味香精又包括酶法和微生物發酵法[4-9]。

本研究利用干酪乳桿菌，對黃油在不同發酵體系中進行發酵，催化生成酸奶味香精基料，探討工藝過程及合適的工藝條件，篩選出酸奶香味最好的酸奶味香精基料，為天然奶味香精的微生物法工業化生產提供了參考。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酪乳桿菌凍干粉：廣東省微生物研究所；無鹽黃油：上海樂廚食品有限公司；乳清粉：河南萬邦實業有限公司；脫脂奶粉：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；乳糖：上海源葉生物科技有限公司。

石油醚、異丙醇、氫氧化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞指示劑等均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設備

數顯恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZQZY-75CS振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；DSX-280手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

稱取一定量的脫脂奶粉加入蒸餾水配制成濃度為10%的牛奶培養基，在高壓滅菌鍋中用115 ℃滅菌15 min，冷卻至40 ℃左右，在無菌條件下，接種干酪乳桿菌的凍干粉，再在37 ℃，150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，經2～3次活化使其活力充分恢復后,放置于冰箱中備用。

1.2.2 發酵方法

稱取一定重量的黃油添加一定配比的輔底物，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入適量活化好的干酪乳桿菌，于37 ℃，150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，得到成品。

1.2.3 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取黃油與乳清粉比例、底物濃度、菌種接種量、發酵時間4個因素設計成4因素3水平進行試驗，選用 L9(34)正交表。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 感官評價

隨機選取感官評價小組成員中5人，組成本試驗香精基料感官評價小組，對發酵所得的香精基料從奶香味強度、酸味強度、香氣協調度和留香時間4個方面進行評分，評分結果為四者之和，總分為10分。香精基料感官評價標準見表2。

表2 酸奶味香精基料感官評價標準表Table 2 The sensory evaluation standard table for yogurt-flavor essence basic material

1.2.5 酸價的測定

根據國標GB 5009.229-2016《食品中酸價的測定》[10]中冷溶劑指示劑滴定法測定。

1.2.6 酥性餅干的制作1.2.6.1 工藝流程

原材料預處理→調制面團→輥軋→成型→烘烤→ 冷卻→成品→感官評價。

1.2.6.2 餅干的制作

按照一定的比例稱取配料(低筋小麥粉100 g、油33 g、糖33 g、鹽0.5 g、水20 g、小蘇打0.32 g、香基1 g)，先將糖和鹽溶解在水中，然后加入油和香基，攪拌均勻，最后將小麥粉和小蘇打一起篩入，和成光滑的面團。將面團分成15 g左右一個的小面團，搓圓、壓扁，擺在烤盤上。170 ℃預熱5 min，放入餅干烘烤20 min左右，取出冷卻，得到成品。同時做一批不添加香基的空白試樣。

1.2.7 數據分析

采用Excel和SPSS 16.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同輔底物對制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，在此基礎上添加不同的輔底物(乳清粉、奶粉、乳糖)，黃油與輔底物的質量比為2∶1，空白樣品僅以黃油為底物，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對發酵產物進行感官評分，結果見圖1。

圖1 不同輔底物對制備酸奶味香精基料的影響Fig.1 Effect of different auxiliary substrates on yogurt-flavor essence basic material

由圖1可知，添加乳清粉所制得的香精基料感官評分值是最高的，此時酸奶風味較濃郁、宜人，略帶甜香味，留香時間較長；以奶粉作為輔底物時，有明顯的奶香味，但是酸味較淡，留香時間不長；而以乳糖為輔底物時，奶味淡而且略帶有異味；空白樣品則只具有極淡的奶香味。此外，添加乳清粉的樣品與空白樣品對比，添加乳清粉后得到的產物口感變得更加細膩、香滑，更加適口。因此，選擇以乳清粉為輔底物進行后續研究。

2.2 黃油與乳清粉比例對制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，添加不同比例的乳清粉作為輔底物，比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，于37 ℃，150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對發酵產物進行感官評分以及酸價的測定，結果見圖2。

圖2 黃油與乳清粉比例對制備酸奶味香精基料的影響Fig.2 Effect of ratio of butter to whey powder on yogurt-flavor essence basic material

黃油中的主要成分是脂肪，此外，還含有酸類、內酯類、酮類、醛類等揮發性物質，形成黃油的獨特香氣和香味[11]。而乳清粉中的成分主要含有乳糖以及少量的乳清蛋白。脂肪和揮發性成分中的酯類和內酯類物質可被干酪乳桿菌分解生成少量的中短脂肪酸，乳糖可被轉化為葡萄糖、半乳糖甚至是乳酸，乳清蛋白也可被水解成肽或氨基酸等物質，從而豐富產物的香味成分，同時改善口感[12]。由圖2可知，隨著黃油與乳清粉質量比的增加，香精基料的酸價變化平緩，通過數據分析，黃油與乳清粉的質量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1制備的香精基料所測得的酸價兩兩之間并沒有顯著性差異(p>0.05)。可能的原因是黃油與乳清粉的混合物經干酪乳桿菌分解后，所得到的游離脂肪酸總含量并無太大區別。

由感官評分曲線可知，當黃油與乳清粉的質量比為1∶1時，香精基料的感官評分最高，酸奶風味濃郁，奶香味濃厚，協調性最好，留香時間最長；然而隨著黃油與乳清粉的質量比增大，感官評分逐漸降低，增加至5∶1時，所制得的香精基料感官評分最低，奶味與酸味的協調性差且有刺鼻的氣味產生；質量比再繼續升高至7∶1時，感官評分又逐漸升高，此時由于黃油的量增加，乳清粉的量減少，香精基料的奶香味濃厚但是酸味淡，出現甜奶味，無其他異味。綜合考慮黃油的價格比較昂貴，因此最適的黃油與乳清粉的比例為1∶1。

2.3 底物濃度對制備酸奶味香精基料的影響

在6個50 mL的三角瓶中添加適量的黃油作為底物，使黃油濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%，控制黃油與乳清粉的比例為1∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對發酵產物進行感官評分以及酸價的測定，結果見圖3。

圖3 底物濃度對制備酸奶味香精基料的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on yogurt-flavor essence basic material

由圖3可知，隨著底物濃度的增加，香精基料的酸價變化平緩，通過數據分析，黃油濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%制備的香精基料所測得的酸價兩兩之間并沒有顯著性差異(p>0.05)。可能的原因是黃油與乳清粉的混合物經干酪乳桿菌分解后，所得到的游離脂肪酸總含量并無太大區別。

由感官評分曲線可知，當底物濃度低于20%時，隨著底物濃度的不斷遞增，所制得的香精基料感官評分明顯提高。這可能是因為隨著底物濃度的增加，黃油和乳清粉的含量增加，其被干酪乳桿菌分解后所產生的香味物質的量也逐漸增加，使酸奶味的濃郁度和純度也隨之提高。然而當底物濃度高于20%時，隨著底物濃度的進一步增加，所產生的酸奶味香氣強度并沒有進一步提高，帶有干酪的風味，掩蓋了酸奶風味。可能是由于底物濃度過高對干酪乳桿菌產生了抑制作用。綜合成本價格考慮，最佳的底物濃度為20%。

2.4 接種量對制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，黃油與乳清粉比例為1∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下選擇不同的干酪乳桿菌接種量，其接種量分別為5%、10%、15%、20%、25%，于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對發酵產物進行感官評分以及酸價的測定，結果見圖4。

圖4 接種量對制備酸奶味香精基料的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on yogurt-flavor essence basic material

由圖4可知，隨著干酪乳桿菌接種量的增加，測定的香精基料的酸價逐漸提高，當接種量為5%和10%時，所測得的酸價沒有顯著性差異(p>0.05)；當接種量為15%時，樣品的酸價與接種量為10%的樣品酸價存在顯著性差異(p<0.05)，而當接種量大于15%后差異開始減小。可能的原因是相同質量的黃油與乳清粉混合物隨著干酪乳桿菌菌數的增加被分解得越徹底，得到的游離脂肪酸含量越高，所測得的酸價也就越高。

由感官評分曲線可知，當干酪乳桿菌接種量為15%時，所制得的香精基料的感官評分最高，此時，酸奶風味濃郁，奶香味濃厚，協調性最好，留香時間最長；當接種量低于15%時，隨著接種量的增加，感官評分也隨之提高，這可能是因為接種量少時，黃油與乳清粉的混合物被利用分解的少，導致香氣成分的含量少，此時制備的香精基料保留較多黃油本身的香味，酸味不夠；當接種量大于15%時，隨著接種量的進一步增加，香精基料的酸味加重，與奶香味協調性差，甚至有異味產生，導致感官評分降低。綜合考慮，選擇干酪乳桿菌接種量為15%為宜。

2.5 發酵溫度對制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，黃油與乳清粉的比例為1∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，放置于不同溫度的恒溫振蕩培養箱中，以150 r/min的轉速培養24 h，其中溫度分別為29，33，37，41，45 ℃，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對發酵產物進行感官評分和酸價的測定，結果見圖5。

圖5 發酵溫度對制備酸奶味香精基料的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on yogurt-flavor essence basic material

由圖5可知，奶味香精基料的酸價隨著溫度的變化而變化，當發酵溫度為37 ℃時，測得的酸價與其他溫度相比均具有顯著性差異(p<0.05)。當發酵溫度小于37 ℃時，隨著溫度的上升，所測得的奶味香精基料的酸價也進一步提高；當發酵溫度大于37 ℃時，隨著溫度的進一步上升，酸價的值反而下降。這可能是因為干酪乳桿菌的最適發酵溫度為37 ℃，低于或高于這個溫度，菌的代謝活力都較差，分解出的游離脂肪酸較少，因此酸價呈現先上升后下降的趨勢。

由感官評分曲線可知，當發酵溫度從27 ℃上升至37 ℃時，干酪乳桿菌的細胞代謝活力隨之增強，所制得的酸奶味香精基料的感官評分明顯提高。當溫度從37 ℃繼續上升時，由于溫度過高，使得菌種細胞內的酶系和細胞器等受到一定的破壞，細胞的代謝功能明顯下降，導致制得的香精基料酸奶風味變差，因此感官評分降低。因此，選擇最適的發酵溫度為37 ℃。

2.6 發酵時間對制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，黃油與乳清粉比例為1∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養一定時間，培養時間分別為12，16，20，24，28 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對發酵產物進行感官評分以及酸價的測定，結果見圖6。

圖6 發酵時間對制備酸奶味香精基料的影響Fig.6 Effect of fermentation time on yogurt-flavor essence basic material

由圖6可知，隨著發酵時間的增長，所測得的奶味香精基料的酸價略微有變化，呈上升趨勢，發酵時間為12 h和16 h所制備的樣品測得的酸價不具有明顯差異(p>0.05)，而當發酵時間超過20 h之后，樣品測得的酸價與16 h時的均具有顯著性差異(p<0.05)。這可能是因為在其他相同條件下，隨著發酵時間的增長，黃油與乳清粉的混合物經干酪乳桿菌發酵分解后得到的游離脂肪酸含量隨之增多。

由感官評分曲線可知，隨著發酵時間的增長，所制得的香精基料的感官評分隨之逐漸提高，當發酵時間達到28 h時，感官評分最高，酸奶風味濃郁，奶香味濃厚，協調性最好，留香時間最長。可能是由于隨著發酵時間的增長，黃油與乳清粉的混合物被干酪乳桿菌發酵分解得越徹底，產生的香氣成分越多，而且大部分乳糖都被分解成乳酸，使得酸味濃郁，與奶味協調性好，沒有產生不良氣味，因此感官評分高。綜合各方面因素考慮，最佳的發酵時間為28 h。

2.7 正交試驗及結果

2.7.1 正交試驗

由表3 可知，最佳的工藝組合為 A3B2C2D2，即當底物濃度為25%，黃油與乳清粉比例為2∶1，菌種接種量為15%，發酵時間為28 h時，該工藝下干酪乳桿菌發酵制得的酸奶味香精基料風味最好。對試驗數據進行方差分析，結果見表4。

表3 正交試驗結果Table 3 The results oforthogonal test

表4 方差分析表Table 4 The variance analysis

由表4可知，各因素對酸奶味香精基料的影響大小順序為B>C>D>A，說明黃油與乳清粉的比例對該試驗的影響最大，其次依次為菌種接種量、發酵時間，底物濃度對試驗的影響最小。

2.7.2 驗證試驗

由于通過正交試驗得出的最佳工藝條件不在正交設計的9個試驗中，因此還需進行驗證試驗。以正交試驗最佳工藝組合 A3B2C2D2進行試驗和感官評價，其結果為8.5。

2.8 以酥性餅干為例的香精基料應用試驗

對烘焙出來的餅干從外觀、色澤、風味和留香等方面進行評價，評價結果見表5。

表5 烘焙餅干感官評價Table 5 The sensory evaluation for baked biscuit

3 結果與討論

本試驗通過以黃油為主要底物，搭配輔底物在不同條件下利用干酪乳桿菌對其進行發酵分解，生成天然酸奶味香精基料，最佳工藝條件：黃油與乳清粉的比例為2∶1，黃油濃度為25%，干酪乳桿菌的接種量為15%，發酵溫度為37 ℃，發酵時間為28 h。通過烘焙試驗驗證本產品能賦予餅干明顯的酸奶味，持香較久。

通過食品級原料制備的天然奶味香精基料，不僅具有更好的香味和口感，賦予產品更加豐富的香氣，而且賦予奶味香精產品豐富的營養成分，對消費者來說不僅安全，更有利于健康。