蓋塔病毒E2結(jié)構(gòu)域蛋白的原核表達及抗血清制備

仇相書，史 寧，朱翔宇，任世斌，張海森，李 海，魯會軍，金寧一*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌712100；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春130122；3.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，吉林 長春130122；4.昭蘇縣西域馬業(yè)有限責任公司，新疆 伊犁 835600)

GETV在分類上屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)的單股正鏈RNA病毒，其基因組長度約為11 689 nt，包含2個獨立的開放閱讀框架(open reading frames，ORF)，分別位于基因組5′端2/3部分(約7 407 nt)和后1/3部分(約3 759 nt)。前者負責非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein，NSP)NSP1～NSP4的編碼，NSP參與病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、RNA capping以及多聚蛋白切割等過程；后者則負責編碼結(jié)構(gòu)蛋白，包括Capsid、E3、E2、6K和E1[10]。值得注意的是，由E基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白不僅構(gòu)成了病毒粒子的表面突起，而且是GETV吸附靶細胞及誘發(fā)機體抗感染免疫的關(guān)鍵蛋白[11]。E2蛋白主要由3個結(jié)構(gòu)域(A、B和C)組成，其中A和B包含影響免疫原性、病毒吸附和組織噬性的大部分殘基[12]。

本研究對GETV毒株序列進行比對分析后，選擇結(jié)構(gòu)蛋白E2結(jié)構(gòu)域保守區(qū)段為靶基因，參照實驗室保存的GETV SD17/09株(GenBank登錄號為MH106780.1)E2基因序列，擴增E2d結(jié)構(gòu)域基因，克隆至原核表達載體，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)重組蛋白E2d表達；E2d蛋白經(jīng)純化和透析后，免疫新西蘭兔，以期獲得抗E2d蛋白多克隆抗體，為開展E2蛋白功能研究、GETV檢測方法的建立和病原學研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株與細胞株GETV毒株SD17/09、Vero細胞株由本實驗室保存；感受態(tài)細胞BL21(DE3)、DH5α購自大連TaKaRa公司。

1.2 試劑及其他反轉(zhuǎn)錄試劑盒Vazyme HiS-criptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit購自諾唯贊；Ex Taq PCR酶、T4DNA Ligase、DL5000 DNA Marker、載體pMDTM19-T、載體pET-22b(+)購自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自BioFluX公司；……