茶樹花青素形成分子機理的研究進展

龐丹丹 韋康

摘要：花青素是由類黃酮合成途徑產生的次生代謝產物，含量高時會使茶樹新梢呈現紅色或紫色。同時，花青素相比兒茶素等具有更明顯的抗氧化、預防腫瘤等藥理保健作用。文章就茶樹花青素合成途徑、轉錄及轉錄后調控等方面進行綜述，以期更好地為高花青素茶樹的育種研究提供理論依據。

關鍵詞：茶樹;花青素;形成;調控

Research Advance on Molecular Mechanism of

Anthocyanin Formation in Tea Plants

PANG Dandan1， WEI Kang2*

1. Tea Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Provincial Key Laboratory for Tea Science/Yunnan

Technology Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Supporting Cultivation， Menghai 666201， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of

Tea Biology and Resources Utilization， Ministry of Agriculture， Hangzhou 310008， China

Abstract： Anthocyanins are crucial secondary metabolites produced by the flavonoid synthesis pathway. Their accu-mulations result in the formation of red or purple shoots in tea plants. Meanwhile， anthocyanins have many health?effects such as anti-oxidation and cancer prevention. In this paper， anthocyanin biosynthesis pathway， transcription?and post-transcriptional regulation in tea plants were reviewed， which would provide a better theoretical basis for theresearch of hype accumulation of anthocyanins in tea plants.

Keywords： tea plant （Camellia sinensis）， anthocyanins， formation， regulation

茶葉中含有大量具有保健功能的多酚類物質，其中花青素是茶樹次生代謝產生的類黃酮化合物的一種，是天然食用色素的重要來源[1]?；ㄇ嗨赜兄谌梭w消除自由基，具有抗氧化、預防心腦血管疾病及抗癌等藥理保健作用[2-4]，因此，富含花青素的紫娟、紫嫣和紅芽佛手等紫芽茶越來越受人們的關注。茶樹芽葉紫化性狀是特色茶樹品種改良的重要內容，探明茶樹芽葉花青素合成的分子機理在理論和應用中均具有重要意義。

一、茶樹中花青素的種類

花青素，又名花色素，是一種重要的水溶性色素，為性質穩定的色原烯衍生物[5]。自然狀態下，花青素主要以花色苷的形式存在，通過形成糖苷鍵的方式與葡萄糖、半乳糖或鼠李糖等結合。紫化茶樹種質資源中花青素含量相對常規的茶樹品種高，一般茶葉中花青素含量約占干物重的0.01%，紫芽茶中的含量可高達0.5%～1.0%。目前，對于紫娟、紫嫣等特異紫色芽葉茶樹花青素組分的研究已開展較多。紫娟的花青素成分主要是飛燕草-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷和矢車菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷，且新梢紅紫化程度較高，主要集中于幼嫩芽葉，成熟葉片花青素含量較少[6]。紫嫣的花青素成分主要是矢車菊素和飛燕草素等[7]。在上述2個茶樹品種中，飛燕草素及其糖苷衍生物是最主要的色素組分，此外還有少量的天竺葵色素及其糖苷。

二、花青素在茶樹中的生物合成與轉運

植物花青素生物合成途徑已被很好地鑒定，并且這一代謝途徑在不同物種中是高度保守的。茶樹中花青素的合成途徑主要包括苯丙烷途徑、類黃酮合成途徑（圖1）[8]，其生物合成需要經過一系列的酶促氧化反應，其中涉及到多種酶類：苯丙氨酸脫氨酶（PAL）、肉桂酸羥化酶（C4H）、4-香豆酰CoA連接酶（4CL）、查爾酮合成酶（CHS）、查耳酮異構酶（CHI）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）、類黃酮3'-羥化酶（F3'H）、類黃酮3'，5'-羥化酶（F3'5'H）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）等[9]。首先，苯丙氨酸作為花青素合成途徑的前體物質，在PAL、C4H和4CL的作用下合成4-香豆酰CoA[10];然后，香豆酰CoA進入類黃酮合成途徑，CHS催化香豆酰CoA和丙二酰CoA生成查爾酮，進而在CHI和F3H的作用下合成柑橘素和二氫山柰酚（DHK），DHK被F3'H或F3'5'H進一步催化產生二氫楊梅素（DHM）或二氫槲皮素（DHQ），其中F3'H和F3'5'H是花青素合成途徑的兩個關鍵酶，兩者通過決定花青素B環羥基化類型從而決定花青素的種類[11];之后，底物DHK、DHM及DHQ可在DFR、ANS等酶的催化下生成不同顏色穩定的花色苷;最終，花青素經過各種修飾被轉運至液泡中儲存。目前，NCBI已登錄的茶樹中花青素合成途徑的基因搜索結果見表1，尚沒有登錄花青素糖基化修飾及轉運相關酶的編碼基因。

花青素合成后的運輸主要包括囊泡運輸及連接蛋白運輸兩種模式，過程較復雜，細胞質中合成的花色素苷通過幾種與轉運蛋白相關的途徑轉移到液泡中，如ABC轉運蛋白、谷胱甘肽轉移酶（GST）等[12]。GST是目前研究最為深入的花色苷轉運蛋白，其中GSTF和GSTU型是植物特有的，且GSTF是研究發現最多的與類黃酮物質積累相關的家族，其直接作為配體蛋白，參與花青素、原花青素的轉運[8]。前期，研究人員主要是利用轉錄組測序的手段篩選獲得茶樹中花青素轉運相關的候選基因。通過對正常光照和遮陰處理的不同茶樣的轉錄組測序，張亞真等[13]發現CsGSTF1的基因表達量隨著芽葉的發育顯著下降，且與擬南芥中負責轉運花青素和原花青素的AtGSTF12高度相似，推測CsGSTF1可能與茶樹中花青素的轉運有關，進而造成花青素的積累。Wei等[14]對遺傳群體中分化的綠芽或紫芽茶樹的一芽二葉進行轉錄組分析，發現相對于綠芽茶樹，紫芽茶樹中花青素晚期生物合成基因3GT（3.2倍和2.1倍）、ANS（1.6倍）和轉運相關的基因CsGSTF1（4.6倍）的表達量相對較高，推測茶樹中花青素的積累與后期修飾、轉運能力的強弱息息相關。Wei等[15]進一步基于代謝組學、轉錄組學及QTL定位等方法，驗證了CsGSTF1表達與紫芽性狀的關聯性;在擬南芥tt19-8突變體（AtGSTF12缺陷型突變體）中過表達CsGSTF1發現，CsGSTF1能夠恢復tt19-8突變體的花青素缺失表型，但不能恢復其透明種皮的表型（與原花青素累積有關），證實了CsGSTF1是專一性參與花青素累積的關鍵基因，其表達水平直接決定茶葉中花青素的積累量。Liu等[16]通過體外重組試驗也發現3個重組CsGSTs中，只有CsGSTF1對花青素表現出較高的親和力，進一步說明了該基因的重要性。

三、茶樹中花青素合成的轉錄調控

雖然類黃酮的合成途徑已經清晰，合成途徑的相關酶類基因也基本明確，但由于花青素類化合物種類復雜，涉及到多個代謝途徑，如苯丙烷途徑、類黃酮合成途徑等，并形成多種產物，它們的合成途徑存在許多交叉點，也意味著合成調控的復雜性?；ㄇ嗨氐拇x途徑的關鍵酶類決定了最終形成的花青素種類，而轉錄因子則被認為是調控花青素積累的主要因素之一。以往大量的研究表明，MYB、bHLH、WD40這3類蛋白是參與花青苷合成的主要轉錄調控因子，上述3種轉錄因子自身特殊結構的調控或者協同形成轉錄激活復合物（MBW復合物），與花青苷生物合成的結構基因的啟動子相結合，達到激活或抑制不同基因的表達，參與生物合成的多個酶促步驟，進而調控花青素的合成[17-19]。

MYB是研究較多的茶樹中花青素、兒茶素等類黃酮化合物調控轉錄因子，同時也是花青素生物合成中MBW復合體的主要決定因子[20]。例如，擬南芥中MYB75（PAP1）、MYB90（PAP2）、MYB113（PAP3）和MYB114（PAP4）均可與TT8/GL3及TTG1（WD40）形成相應的4種MBW復合物，激活晚期花青素生物合成基因AtDFR、AtANS/LDOX和AtUF3GT的表達，進而導致野生型植株中花青素的大量積累[18];蘋果中MdMYB1、MdMYBA和MdMYB10等多個MYB家族基因被克隆與鑒定，并且相關研究表明上述基因是控制果皮花青苷合成的關鍵因子，它們的轉錄水平總是與果實花青苷的積累呈正相關[21-23]。在茶樹中，通過轉錄組測序的方式，篩選得到多個與調控花青素積累相關的MYB候選基因。Wei等[14]對茶樹芽葉顏色分化遺傳群體中紫芽與綠芽單株進行轉錄組分析，其中CsMYB75與擬南芥中調控花青素合成的AtPAP1高度相似。近期，CsMYB75被證實可以作用花青素轉運CsGSTF1基因的啟動子，促進紫芽茶花青素的積累[15]。He等[24]發現CsMYB75的表達與AtMYB113最為相似，并且在調控花青素合成方面一致，特異性地使得CHS和花青素3-O-葡糖糖基轉移酶基因（A3T）顯著上調表達，從而促進紫色芽葉中類黃酮物質的積累。Sun等[25]研究認為1個與擬南芥MYB75同源的CsAN1（即CsMYB75）是紫娟茶樹芽葉紫化的關鍵因子，CsMYB75瞬時轉入本氏煙草，促進了其花青素的積累;酵母雙雜及雙分子熒光互補等試驗表明，該基因能夠與CsGL3、CsEGL3互作，通過形成MBW復合物調控花青素合成基因CsLDOX的表達;同時CsAN1的表達水平也受表觀遺傳的調控，CsAN1的表達量與啟動子的低甲基化水平呈正相關。該研究從轉錄水平上初步闡明了茶樹花青素合成的分子機制。近期，王留彬等[26]發現CsMYB75基因與前期控制茶樹新梢顏色的QTL實現共定位，該研究從遺傳學角度進一步證實了CsMYB75參與茶樹花青素合成過程的調控。

除MYB之外，bHLH轉錄因子是植物中類黃酮相關的第二大轉錄因子家族，WD40則屬于被認識的較少的轉錄因子。茶樹中bHLH和WD40這2種轉錄因子在調控茶樹花青素生物累積方面的研究也較少。相關研究主要是利用基因芯片、茶樹基因組及轉錄組測序鑒定得到了多個與茶樹中花青素富集的候選基因bHLH和WD40[27-28]，其具體的調控機制有待進一步驗證。

四、茶樹中花青素合成的轉錄后水平的調控

隨著現代分子生物學技術的快速發展，除了參與植物生長發育和脅迫反應外，miRNA對于初級和次級代謝也發揮著重要的作用。研究表明，在轉錄后水平上miRNA對植物花青素的合成具有不可替代的調控作用。植物中已報道的與花色素生物合成調控相關的家族有miR156、miR828、miR858和miR165/166等，不同miRNA家族對花色素生物合成的調控機制各異。miR828可誘發TAS4轉錄本的剪切，調節擬南芥和蘋果中MYB家族轉錄因子的表達[29-30];miRNA156通過靶向SPL轉錄因子，影響MYB-bHLH-WD40復合體的轉錄激活活性，從而抑制ANS和DFR等基因的表達，參與調控花青素的生物合成[31];miRNA858通過靶向MYB12轉錄因子基因參與調控CHS和FLS的表達影響黃酮醇的合成，間接影響花青素的含量[32];miRNA165/166主要是通過其靶基因負向調控花青素的生物合成來影響植物色澤[33]。

目前，關于茶樹花青素代謝的研究主要集中在MYB/bHLH/WD對花青素生物合成途徑轉錄水平的調控，與其他植物相比，茶樹中miRNA的研究起步較晚，主要是利用高通量測序、生物信息學鑒定、植物芯片等技術篩選得到茶樹中大量miRNA，并發現其在生物、非生物脅迫及兒茶素、萜類物質合成方面起著調控作用，而對于探究miRNA在紫化芽葉茶樹花青素積累中的作用的研究較少。陳林波等[34]對紫芽茶樹紫娟、綠芽茶樹云抗10號和福鼎大白茶進行miRNA測序，發現miRNA828a在紫娟葉片中差異表達，基于測序數據對miRNA828a的靶基因進行預測，結果發現miR828a靶向MYB轉錄因子的多個基因，推測miR828a靶向MYB類轉錄因子參與調控茶樹花青素的生物合成。

五、展望

花青素是一種具有保健功能的多酚類物質，對人體具有較好的降壓、減肥、降脂、預防心腦血管疾病和改善視力、預防眼部疲勞等功效;同時，花青素作為一種天然抗氧化劑，在茶樹抵御過高光強、低溫等逆境脅迫中具有一定的保護作用。因此，人們對選育特異紫色芽葉茶樹品種、開發富含花青素的功能性茶產品越來越關注[35]。

近年來，茶樹中花青素生物合成途徑較為清晰，相關的大部分結構基因已得到分離與鑒定，茶樹紫化芽葉形成的調控研究已經取得了較大進展，但仍不足以揭示其復雜的調控機理。因此，借助功能基因組學、蛋白組學、代謝組學及表觀遺傳學等技術手段，進一步挖掘調控花青素合成的新基因，并對其功能和表達調控的內在機理進行探究，有助于為富含花青素的茶樹品種的培育及高花青素保健茶產品的開發利用提供更為堅實的理論基礎。

參考文獻

[1] 宛曉春. 茶葉生物化學[M]. 北京： 中國農業出版社， 2003： 8-15.

[2] BHATTACHARYA U， ADAK S， MAJUMDER N， et al. Antimutagenic and anticancer activity of Darjeeling tea in multiple test systems[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine， 2014， 14（1）： 1-10.

[3] KATSUHIKO F， TADASHI I， YUKIHIKO H. Antibacterial activity of tea polyphenols against phytopathogenic bacteria[J]. Agricultural and Biological Chemistry， 1991， 55（7）： 1895-1897.

[4] MATSUO N， YAMADA K， SHOJI K， et al. Effect of tea polyphenols

on histamine release from rat basophilic leukemia （RBL-2H3） cells： the structure-inhibitory activity relationship[J]. Allergy， 2010， 52（1）：58-64.

[5] HOLTON T A， CORNISH E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Cell， 1995， 7（7）： 1071-1083.

[6] 蔣會兵， 孫云南， 李梅， 等. 紫娟茶樹葉片不同發育期花青素積累及合成相關基因的表達[J]. 茶葉科學， 2018， 38（2）： 174-182.

[7] LAI Y S， LI S， TANG Q， et al. The dark-purple tea cultivar 'Ziyan' accumulates a large amount of delphinidin-related anthocyanins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2016， 64（13）： 2719-2726.

[8] 張亞真， 張芬， 王麗鴛， 等. 植物谷胱甘肽轉移酶在類黃酮累積中的作用[J]. 植物生理學報， 2015， 51（11）： 1815-1820.

[9] SCH?FFNER A R. Flavonoid biosynthesis and arabidopsis genetics： more good music[J]. Journal of Experimental Botany， 2016， 67（5）： 1203-1204.

[10] 李莉， 趙越， 馬君蘭. 苯丙氨酸代謝途徑關鍵酶： PAL、C4H、4CL研究新進展[J]. 生物信息學， 2007（4）： 187-189.

[11] SCHWINN K， MIOSIC S， DAVIES K， et al. The B-ring hydroxylation pattern of anthocyanins can be determined through activity of the flavonoid 3'-hydroxylase on leucoanthocyanidins[J]. Planta，? ? 2014， 240（5）： 1003-1010.

[12] ALFENITO M R， SOUER E， GOODMAN C D， et al. Functional ? complementation of anthocyanin sequestration in the vacuole by ?widely divergent glutathione S-transferases[J]. The Plant Cell，? ? 1998， 10（7）： 1135-1149.

[13] 張亞真， 韋康， 王麗鴛， 等. 基于轉錄組測序對茶樹GST基因表達的研究[J]. 茶葉科學， 2016， 36（5）： 513-522.

[14] WEI K， ZHANG Y Z， WU L Y， et al. Gene expression analysis of bud and leaf color in tea[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2016， 107： 310-318.

[15] WEI K， WANG L Y， ZHANG Y Y， et al. A coupled role for CsMYB75 and CsGSTF1 in anthocyanin hyperaccumulation in purple tea[J]. Plant Journal， 2019， 97（5）： 825-840.

[16] LIU Y J， JIANG H， ZHAO Y， et al. Three Camellia sinensis glutathi- ? one S-transferases are involved in the storage of anthocyanins， fla- ? vonols， and proanthocyanidins[J]. Planta， 2019， 250（4）： 1163-1175.

[17] MANO H， OGASAWARA F， SATO K， et al. Isolation of a regulatory ? gene of anthocyanin biosynthesis in tuberous roots of purple-fleshed ? sweet potato[J]. Plant Physiology， 2007， 143（3）： 1252-1268.

[18] GONZALEZ A， ZHAO M， LEAVITT J M， et al. Regulation of the ? anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/Myb transcriptional complex in Arabidopsis seedlings[J]. Plant Journal， 2008，53（5）： 814-827.

[19] TAO R Y， YU W J， GAO Y H， et al. Light-induced basic/helix-loop-helix 64 enhances anthocyanin biosynthesis and undergoes ? constitutively photomorphogenic 1-mediated degradation in pear ? [J]. Plant Physiology， 2020， 184（4）： 1684-1701.

[20] HTAY N A， KIL K C. Roles of R2R3-MYB transcription factors in

transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis in horticultural plants[J]. Plant Molecular Biology， 2018， 98（1）： 1-18.

[21] ESPLEY R V， HELLENS R P， PUTTERILL J， et al. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor， MdMYB10[J]. Plant Journal， 2007， 49（3）： 414-427.

[22] BAN Y， HONDA C， HATSUYAMA Y， et al. Isolation and functional ? analysis of a MYB transcription factor gene that is a key regulator ?for the development of red coloration in apple skin[J]. Plant and ? Cell Physiology， 2007， 48（7）： 958-970.

[23] TAKOS A M， JAFFE F W， JACOB S R， et al. Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples[J]. Plant Physiology， 2006， 142（3）： 1216-1232.

[24] HE X J， ZHAO X C， GAO L P， et al. Isolation and characterization of key genes that promote flavonoid accumulation in purple-leaf tea （Camellia sinensis L.）[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 130.

[25] SUN B M， ZHU Z S， CAO P R， et al. Purple foliage coloration in ? tea （Camellia sinensis L.） arises from activation of the R2R3-MYB ? transcription factor CsAN1[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 32534.

[26] 王留彬， 周斌， 彭敏， 等. 茶樹CsAN1基因的表達， 連鎖定位及其與新梢顏色的關系研究[J]. 四川農業大學學報， 2019， 37（6）： 814-820.

[27] 馬春雷， 姚明哲， 王新超， 等. 利用基因芯片篩選茶樹芽葉紫化相關基因[J]. 茶葉科學， 2011， 31（1）： 59-65.

[28] 蔣會兵， 夏麗飛， 田易萍， 等. 基于轉錄組測序的紫芽茶樹花青素合成相關基因分析[J]. 植物遺傳資源學報， 2018， 19（5）： 967-978.

[29] HSIEH L C， LIN S I， SHIH A C C， et al. Uncovering small RNA- ? mediated responses to phosphate deficiency in Arabidopsis by deep ? sequencing[J]. Plant Physiology， 2009， 151： 2120-2132.

[30] CHEN H M， CHEN L T， PATEL K， et al. 22-nucleotide RNAs trigger ? secondary siRNA biogenesis in plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2010， 107（34）： 15269-15274.

[31] GOU J Y， FELIPPES F F， LIU C， et al. Negative regulation of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis by a miR156-targeted SPL transcription factor[J]. The Plant Cell， 2011， 23： 1512-1522.

[32] CHEN Q J， DENG B H， GAO J， et al. Comparative analysis of ? miRNA abundance revealed the function of Vvi-miR828 in fruit ?coloring in root restriction cultivation grapevine （Vitis vinifera L.）[J]. International Journal Molecular Sciences， 2019， 20： 4058.

[33] YAN J， GU Y Y， JIA X J， et al. Effective small RNA destruction by the expression of a short tandem target mimic in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2012（2）： 415-427.

[34] 陳林波， 夏麗飛， 劉悅， 等. 基于高通量測序篩選‘紫娟’花青素合成相關的miRNA[J]. 茶葉科學， 2019， 39（6）： 681-691.

[35] 李強， 項建， 鄭國楊， 等. 我國葉色特異茶樹品種選育推廣與產業化發展探析[J]. 中國茶葉， 2020， 43（9）： 52-57.