Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化余甘子總多酚超聲提取工藝

林長(zhǎng)彬 趙旭珠 李晚誼 于麗娟 陳建 李宏 夏陳 鄧俊琳 李智敏

摘 要：以余甘子中總多酚的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法，研究乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)余甘子中總多酚提取工藝的影響，并優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明：影響余甘子總多酚提取的因素主次為乙醇濃度>超聲溫度>超聲時(shí)間，最佳提取工藝為乙醇濃度64%、超聲時(shí)間39 min、提取溫度43 ℃。驗(yàn)證試驗(yàn)中總多酚提取量為186.17 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值190.33 mg/g較接近。Box-Behnken響應(yīng)面回歸方程擬合度良好，適合用于余甘子總多酚提取工藝的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

關(guān)鍵詞：余甘子;總多酚;Box-Behnken響應(yīng)面法;超聲提取

余甘子在我國(guó)主要分布于廣西、云南、貴州等地區(qū)[1-2]，被列為“藥食兩用”原料。余甘子含有豐富的多酚、超氧化物歧化酶（SOD）、多糖、維生素、氨基酸、黃酮等活性成分[3-4]，具有保肝、降壓、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛等功效[5-7]，藥用和食用價(jià)值較高[8-9]。研究表明，余甘子抗氧化性是其生理功能的基礎(chǔ)，而余甘子多酚是主要的抗氧化物質(zhì)[10]。目前已有大量的研究對(duì)余甘子中多酚提取進(jìn)行了研究。楊冰鑫等[11]通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了余甘子中總多酚的提取工藝為提取時(shí)間135 min、浸提溫度70 ℃、乙醇濃度45%。曹雄等[12]利用正交設(shè)計(jì)對(duì)余甘子多酚提取進(jìn)行工藝篩選，確定最佳提取工藝為50%甲醇、料液比1∶10、提取次數(shù)1次、浸提時(shí)間90 min。吳丹玲等[13]研究不同濃度的丙酮、甲醇、乙醇提取溶劑對(duì)余甘子中多酚提取的影響，發(fā)現(xiàn)70%丙酮提取3次為最佳工藝。雖然目前對(duì)余甘子中總多酚的提取工藝進(jìn)行了大量的優(yōu)化研究，但鮮有研究利用響應(yīng)面對(duì)超聲輔助提取余甘子中總多酚工藝進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)研究乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度等3個(gè)工藝參數(shù)對(duì)余甘子總多酚提取量的影響，并用響應(yīng)面法優(yōu)化余甘子總多酚超聲輔助提取工藝，為余甘子產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

余甘子，2018年3月采收于云南省大理市賓川縣，挑選出新鮮無(wú)損的余甘子果，于100 ℃干燥20 min后80 ℃烘干（干燥過(guò)程中每隔1 h稱重，當(dāng)相隔2次重量之差≤2%時(shí)即認(rèn)定為已烘干），樣品經(jīng)粉碎、過(guò)60目篩密封裝袋備用。

1.2 試劑與儀器

福林酚、沒(méi)食子酸、乙醇等，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。Synergy HTX酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司;FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司;TD-4Z型臺(tái)式低速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司;KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總多酚提取 稱取1.00 g余甘子粉末，加入8 mL 80%乙醇溶液，40 ℃超聲提取40 min，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)提取2次，合并3次上清液并定容到25 mL，此為待測(cè)液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1）乙醇濃度對(duì)總多酚提取的影響：稱取1.00 g余甘子粉末分別加入15 mL 20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液，40 ℃超聲提取40 min，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)提取2次，合并3次上清液并定容到25 mL，測(cè)定其多酚含量。

（2）超聲時(shí)間對(duì)總多酚提取的影響：稱取1.00 g余甘子粉末加入15 mL 80%乙醇溶液，分別40 ℃超聲提取20、30、40、50、60 min，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)提取2次，合并3次上清液并定容到25 mL，測(cè)定其多酚含量。

（3）超聲溫度對(duì)總多酚提取的影響：稱取1.00 g余甘子粉末加入15 mL 80%乙醇溶液，分別用30、40、50、60、70 ℃超聲提取40 min，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)提取2次，合并3次上清液并定容到25 mL，測(cè)定其多酚含量。

1.3.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以時(shí)間（A）、溫度（B）、乙醇濃度（C）為自變量，以余甘子總多酚提取量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平表（表1）。

1.3.4 總多酚的檢測(cè) 參照Chu等[14]方法略做修改，取10 μL待測(cè)液于96孔板中，加入20 μL福林酚，放置反應(yīng)5 min，再加入160 μL 5%碳酸鈉溶液，避光反應(yīng)1 h，用酶標(biāo)儀在765 nm處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為136.25、68.125、34.062、17.031、8.516、4.258、2.129、1.064 μg/mL為橫坐標(biāo)（X），以吸光值為0.599、0.334、0.194、0.115、0.075、0.061、0.05、0.049為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程：Y=0.004X+0.045（R2=0.999）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)余甘子總多酚提取量的影響

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，總多酚提取量在乙醇濃度為20%時(shí)含量較高，為155.37 mg/g，之后隨著濃度增加提取量反而下降，40%時(shí)提取量降至最低，繼續(xù)增加乙醇濃度，提取量逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，提取量達(dá)到最大172.85 mg/g，此后又明顯降低。當(dāng)20%乙醇作溶劑時(shí)，提取液中可能含有大量的水溶性多酚，隨著溶劑濃度增加，水溶性多酚的溶出逐漸減少。由于多酚類物質(zhì)在植物體內(nèi)通常與蛋白質(zhì)、多糖等以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的復(fù)合物，各物質(zhì)之間的氫鍵和疏水鍵在低濃度條件下很難被破壞[15]，因此乙醇濃度為40%和60%時(shí)總多酚含量相對(duì)較低;當(dāng)濃度在60%～80%時(shí)，由于氫鍵和疏水鍵等被破壞，提高多酚類物質(zhì)的溶出，使得總多酚提取量迅速增加;當(dāng)乙醇濃度超過(guò)80%，水分含量逐漸減少，部分水溶性多酚不能充分溶解，而其他脂溶性成分浸出率較高，對(duì)多酚類物質(zhì)的提取不利[16]。因此，80%乙醇溶液作為余甘子總多酚的提取溶劑將進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 超聲時(shí)間對(duì)余甘子總多酚提取量的影響

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總多酚提取量先增大后減小，時(shí)間為30 min時(shí)，提取量達(dá)最大（184.78 mg/g），這可能是由于延長(zhǎng)超聲時(shí)間，增大了總多酚溶出，當(dāng)細(xì)胞中有效成分基本全部溶出時(shí)，提取量將不再增加。隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，總多酚提取量明顯下降，這可能與余甘子中多酚類化合物的穩(wěn)定性差有關(guān)，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)增大氧化變形發(fā)生的可能使得多酚類化合物結(jié)構(gòu)遭到破壞從而使得多酚提取量下降。因此，超聲時(shí)間30 min將進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。甘瑾等[17]也發(fā)現(xiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，余甘子中多酚的提取量反而顯著降低。

2.3 超聲溫度對(duì)余甘子總多酚提取量的影響

由圖3可見(jiàn)，隨著提取溫度的升高，總多酚提取量逐漸增加，當(dāng)提取溫度到達(dá)50 ℃時(shí)，提取量達(dá)最大值191.62 mg/g，溫度升高能夠增加溶劑分子和溶質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)促進(jìn)擴(kuò)散，增加提取物的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，利于多酚類化合物的溶出;但溫度繼續(xù)升高至60 ℃時(shí)，總多酚提取量明顯下降，可能由于溫度過(guò)高降低了溶劑的黏度，從而引起多酚化合物的降解而導(dǎo)致提取量下降[18]。

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.4.1 回歸模型方程的建立 結(jié)合單因素，響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，采用Design expert 8.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到余甘子中總多酚提取率（Y）對(duì)超聲時(shí)間（A）、超聲溫度（B）和乙醇濃度（C）的回歸方程：

Y=169.90+0.22A-14.20B-28.30C-9.50AB+4.96AC+19.35BC+4.03A2-33.84B2-15.20C2。

2.4.2 模型及回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn) 對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，表3結(jié)果表明，模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)為1.32，P=0.385 4>0.05，差異不顯著，說(shuō)明該模型可用于余甘子總多酚提取試驗(yàn)的預(yù)測(cè)，試驗(yàn)方案可行[19]。此外該模型的變異系數(shù)為10.48%，為測(cè)試結(jié)果接受范圍內(nèi)。結(jié)果表明，C和B2對(duì)余甘子中多酚提取的影響極顯著，B和BC對(duì)余甘子中多酚提取的影響顯著，而其他系數(shù)均不顯著影響。在所選取的各影響因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)余甘子多酚提取的影響排序?yàn)镃（乙醇濃度）>B（超聲溫度）>A（超聲時(shí)間）。

2.4.3 總多酚提取的響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸模型所得響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，分析各因素的交互作用，其中僅乙醇濃度和超聲溫度的交互作用是顯著。等高線的形狀可以反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表明交互作用顯著，而圓形則與之相反。通過(guò)方差分析及響應(yīng)面分析可知，乙醇濃度是影響余甘子總多酚提取量的主要因素，超聲溫度次之，超聲時(shí)間影響最小。并通過(guò)軟件分析計(jì)算得出超聲提取總多酚的最佳理論提取值，同時(shí)余甘子總多酚最佳工藝條件為乙醇濃度64.37%、時(shí)間39.22 min、溫度42.93 ℃。考慮到試驗(yàn)條件的可操作性，將工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇濃度64%、時(shí)間39 min、溫度43 ℃，在此條件下，預(yù)測(cè)余甘子總多酚提取量達(dá)190.33 mg/g。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值，在最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算得到余甘子總多酚的提取量為186.17 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差2.18%，表明建立的模型可以較好地模擬和預(yù)測(cè)余甘子總多酚的提取效果（圖4）。

3 結(jié)論

以余甘子為原料，利用超聲輔助提取總多酚，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化工藝發(fā)現(xiàn)影響余甘子多酚提取的因素主次為C（乙醇濃度）>B（超聲溫度）>A（超聲時(shí)間），并得到余甘子最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度64%、時(shí)間39 min、溫度43 ℃，在此條件下驗(yàn)證余甘子總多酚提取量為186.17 mg/g，證明了響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取余甘子總多酚最優(yōu)工藝可行。◇

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Ultrasonic Extraction of Total Polyphenols from Phyllanthus emblica Fruit by Box-Behnken Response Surface Method

LIN Chang-bin1，ZHAO Xu-zhu1，LI Wan-yi2，YU Li-juan3，CHEN Jian1，LI Hong3，XIA Chen1，DENG Jun-lin1，LI Zhi-min2

（1Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China;2Medicinal Plants Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，China;3Agro-products Processing Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650221，China）

Abstract：Taking the extraction yield of total polyphenols in Phyllanthus emblica as an indicator， we investigated the effects of factors as ethanol concentration， ultrasonic time and ultrasonic temperature on the extraction process of total polyphenols from Phyllanthus emblica and obtained the optimal extraction process conditions through the single factor test combined with Box-Behnken Response Surface Method. The results showed that the order of factors affecting the extraction yield of total polyphenols of Phyllanthus emblica was ethanol concentration > ultrasound temperature > ultrasound time. The optimal extraction conditions were ethanol concentration 64%， ultrasonic time 39 min， and extraction temperature 43 ℃. The verified test proved that the extraction yield of total polyphenols was 186.17 mg/g， which was closed to the model predicted value of 190.33 mg/g. The regression equation of response surface had a good fit and was suitable for regression analysis and parameter optimization of the extraction process of total polyphenols from Phyllanthus emblica.

Keywords：Phyllanthus emblica;total polyphenol;Box-Behnken Response Surface Method;ultrasonic extraction