魷魚眼中透明質酸的提取工藝

沈蘭 王婷婷

摘要：透明質酸是一種存在于生物體內的大分子聚合物，化學成分為粘多糖，廣泛存在于動物和人體結締組織及細胞外基質中，具有特殊的生理作用和極強的保濕能力。可廣泛應用于醫藥、臨床醫學等領域。本文對魷魚眼透明質酸的提取方法進行了研究，實驗采用水提醇沉、等電點法脫蛋白質與超濾相結合的加工工藝，運用正交試驗法對提取工藝參數進行了優化，并對產品的質量指標進行了檢驗。

關鍵詞：透明質酸;魷魚眼;提取工藝;鑒定

1 前言

透明質酸（Hyaluranic acid，簡稱HA），廣泛存在于動物結締組織，是一種由β-D-N-乙酰基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸為結構單元以β-1，4-糖苷鍵縮合而成的一種酸性粘多糖，屬于糖胺聚糖。1934年，Meyer 和Palmer [1]從牛眼中最先分離出此種物質，發現透明質酸是由相同的二糖單體重復排列而形成的無支鏈的直鏈多聚物，無定型固體，無臭、無味，溶于水而不溶于有機溶劑，水溶液比旋度為-70°～80°[2]。

透明質酸兼具有高分子和大分子體積的特性，由葡萄糖醛酸-乙酞氨基葡萄糖為雙糖單位組成的直鏈高分子多糖，除了親水性外，透明質酸較強的保濕性和粘彈性，在眼科、外科手術中有特殊的功效和較高的醫學臨床價值，。經過半個多世紀的研究，人們對透明質酸的結構、理化性質和生理功能已有了明確的認識，其研究領域不斷擴展，透明質酸已成為細胞生物、病理、免疫學等領域的研究熱點[3]。

本研究以魷魚（illex argentinus）加工下腳料--魚眼為原料，研究了魷魚眼透明質酸的提取工藝，并對產品的理化性質進行了初步分析鑒定，使魷魚資源得以合理開發利用，利于提高其加工的綜合效益及經濟附加值，變廢為寶。

2 實驗方法

2.1 工藝流程

魷魚眼→預處理→浸提→鹽析→脫蛋白質→離心→濃縮→乙醇沉淀→超濾→干燥→成品

2.2 操作要點

魷魚眼預處理

將冷凍著的魷魚眼睛放置在實驗容器中溶解。

浸提

準確稱取50 g魷魚眼置于DS-1型高速組織搗碎機中進行組織搗碎，用去離子水浸提1-3次，將浸提液合并貯存于容器內待用。

鹽析

向浸提液中加入去離子水配制成500 mL溶液，再加入5.85 g氯化鈉攪拌至溶解，使其溶液最終NaCl濃度為0.2 mol/L，靜置半小時。

脫蛋白質

根據等電點法除蛋白質法，用1：10的稀鹽酸加入溶液中，并輕微攪拌，使溶液pH調節至4.0左右，達到沉淀量最大。

脫蛋白工藝確定：等電點法、三氯乙酸法[4]、Sevage法[4]

離心

脫蛋白的溶液通過DL-5低速大容量離心機離心，轉速5000 r/min，離心時間為45 min，去沉淀取上清液。

濃縮

上清液通過A-1000S水循環真空泵進行真空濃縮，溫度控制在40～50℃最后使溶液濃縮到適宜濃度即可。

乙醇沉淀

在濃縮后的溶液中加入其3倍體積的無水乙醇進行醇沉，然后離心取沉淀，復溶置于容器中。

超濾

用截留分子量為10000 Da的millipore labscale TFF system 超濾膜裝置超濾。

干燥

將超濾后的溶液進行冷凍后，通過LGJ-10冷凍干燥機進行真空冷凍干燥得到的白色粉末即為透明質酸粉末。

3 透明質酸的分析

3.1 理化分析

3.1.1葡萄糖醛酸含量的測定[5]

實驗步驟：

標準曲線繪制：精確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1 mL葡萄糖醛酸標準溶液于帶塞試管中，各管加水至1 mL，在冰水浴中各管加入3 mL試劑A，搖勻后，于沸水浴中保持10 min，取出后冷至室溫，各管加0.2 mL試劑B，于沸水浴中保持15 min，取出冰水浴中冷卻。在室溫下，測定光吸收值（530 nm），以濃度對光吸收作標準曲線。

樣品測定：準確稱取15.0mg的樣品，定量于50 mL的容量瓶中，取1 mL樣品溶液于帶塞試管中，在冰水浴中各管加入3 mL試劑A，其余步驟同標準曲線制備操作。由所測得的光吸收值通過標準曲線求出相應葡萄糖醛酸量。

3.1.2 氨基葡萄糖含量的測定[6，7，8]

實驗步驟：

氨基葡萄糖的鑒定

精取樣品加適量4 moL/L鹽酸使成為8 mg/mL封安瓶中于100℃烘箱中水解14 h。取0.75 mL稀釋至10 mL。

低溫乙酰丙酮反應：測光吸收（530 nm）為AL。

高溫乙酰丙酮反應：測吸光度（530 nm）為AH。

AH/AL≈1，為半乳糖胺 AH/AL﹥1，為葡糖糖胺

標準曲線繪制：分取鹽酸葡萄糖胺0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于帶塞試管中，各加水至5mL，加1 mL乙酰丙酮試液（B），置沸水中25 min，用迅速冷卻后，各管加無水乙醇3 mL及對二氨基苯甲醛試液1 mL，強力振搖，20～25 ℃下放置1 h，以0 mL為空白，測吸光度（530 nm）。

樣品測定：取樣品2 mg左右，置50 mL容量瓶中，加6 moL/L鹽酸1.5 mL，沸水浴中水解1 h，冷卻后用NaOH中和至中性，用水稀釋至刻度，取2 mL樣液，加水至5 mL其他操作同上。

3.2 光譜分析

3.2.1紫外光譜分析[9]

樣品配成1 mg/mL透明質酸溶液，UV-240紫外可見分光光度計掃描，掃描范圍為190～300 nm。

3.2.2紅外光譜分析[10]

透明質酸微量樣品KBr壓片后，用Nicolet Nexus 5DXC FT-IR紅外光譜儀在4000-500 cm-1區域內進行紅外掃描。

3.3 透明質酸提取率和得率的計算

透明質酸提取率=透明質酸含量（g）/魷魚眼睛質量（g）×100%，以干基（扣除魷魚眼睛原料水含量）計。葡萄糖醛酸測量值除以46.32%[13]，即可得到HA的含量。

透明質酸得率=提取的透明質酸質量（g）/魷魚眼睛質量（g）×100%，以干基計。

4 結果與分析

4.1透明質酸提取的正交實驗及結果

根據上述單因素實驗結果，選擇浸提次數、浸提時間、料液比三因素，采用L9（33）正交表進行正交實驗，結果見表1。

在實驗設定的范圍內，最佳方案為A2B3C2，即提取3次，浸提時間3 h，料水比1：6。

在以上得到的優化工藝參數條件下，重復多次，透明質酸的平均提取率為3.58%，。

4.2脫蛋白工藝的確定

實驗中發現，從魷魚眼睛中提取的透明質酸溶液含有較多的蛋白質雜質，因此，脫蛋白成為整個提取工藝的關鍵之處。當pH值為4時脫蛋白效果最好，同時，在實驗過程中，也發現pH值=4時上清液澄清。所以，用等電點法除蛋白質，適宜pH值應取4。

4.3透明質酸的質量指標

根據上述工藝，所制備的產品主要為透明質酸，每千克魷魚眼睛干原料可獲29.6g產品，產品的總得率達2.96%，產品純度為72.21%。

4.4紫外光譜分析

從紫外吸收光譜（見圖1）分析得，樣品在201～207 nm有很強的多糖吸收峰，而在280、260 nm處無強烈的吸收峰，說明制品透明質酸中蛋白質和核酸含量極少。

4.5紅外光譜分析

如圖2的紅外光譜圖譜所示，3407.95 cm-1出現強烈的O-H伸縮振動，表明存在多羥基結構;在2922.72 cm-1處出現的-CH伸縮振動，1613.19 cm-1和1409.33 cm-1強銳峰為羧基的反對稱及對稱伸縮振動峰;1409.33 cm-1和1322.42 cm-1有-C-O-的伸縮振動和-OH的彎曲振動偶合產生的兩個吸收峰，表明存在著糖醛酸上解離羧基和多羥基結構;1148.79 cm-1、1043.86 cm-1、945.52 cm-1左右的吸收峰為糖的特征吸收峰。以上情況與文獻[11]報道的標準品譜圖相吻合，表明產品樣呈較典型的透明質酸紅外光吸收。

5 結論

魷魚眼睛中透明質酸的最佳提取工藝參數：浸提次數為3次，浸提時間為3 h，料液比為1：6;等電點除蛋白質的最佳pH值為4。在此提取條件下，產品的總得率為2.96%，純度為72.21%。

本實驗采用等電點法脫雜蛋白，操作簡單，污染較少，成本較低，效果較佳。

參考文獻：

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[11] 史鵬. 發酵法生產透明質酸下游提取工藝方法的研究[D].西北大學，2005.

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