基于戊糖片球菌發酵酶解鯽魚基料的工藝研究

張蕓，汪蘭，章蔚，高瓊，熊光權,王靜

(1.湖北經濟學院 旅游與酒店管理學院，武漢 430205；2.湖北省農業科學院農產品加工 與核農技術研究所，武漢 430064；3.中國農村技術開發中心，北京 100045)

鯽魚(Carassiusauratus)屬鯉科，鯉亞科，鯽屬，是淡水魚類中食用價值較高的魚類，其肉嫩味美，營養價值極高[1]。但由于鯽魚骨刺較多，不便于食用，其經濟價值大大降低。傳統的鯽魚加工產品種類較為單一，主要包括軟罐頭、干制品等[2]，同時傳統的鯽魚加工技術會產生大量的下腳料，這些下腳料通常會被直接廢棄，從而造成資源浪費和環境污染[3]。水產調味品通常采用魚肉或水產品加工后的下腳料為原料，利用水產品自身的酶或結合微生物產生的酶在一定條件下發酵制成[4]。在利用微生物制作發酵魚制品中，通常使用的發酵劑有戊糖片球菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、米曲霉等[5-8]。戊糖片球菌是工業肉制品發酵中常用的一種發酵菌，是一種潛在的生物防腐劑[9,10]。戊糖片球菌在耐鹽性和耐亞硝酸鹽性方面的能力都很強；而且戊糖片球菌能降解產品中的蛋白質，對致病菌的抑菌效果相對也較好[11,12]。

水產調味品具有鮮美的風味和口感，具有極大的開發價值，但我國淡水水產品加工所占的比重還比較低，在水產調味品領域僅有魚肉醬類產品，品種單一。本研究以去頭、去鰓、去內臟的鯽魚整魚為原料，先將魚肉采用風味蛋白酶(Flavourzyme)和復合蛋白酶(Protamex)酶解，在酶解基料中接種戊糖片球菌發酵劑，縮短發酵時間，研究戊糖片球菌在發酵鯽魚酶解產物過程中的作用以及理化指標的變化規律，優化發酵工藝，開發新型淡水魚調味品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料

新鮮鯽魚：購于武商量販農科城店；戊糖片球菌凍干粉：廣東省微生物菌種保藏中心；風味蛋白酶和復合蛋白酶：諾維信中國生物技術有限公司；福林酚試劑、MRS培養基和其他化學試劑：購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器及設備

PL2002電子分析天平、FE20實驗室pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DF-101S恒溫磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；722G可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；7890A/5975C氣質聯用儀 Agilent儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯽魚酶解基料的制備

新鮮鯽魚宰殺后除去魚鱗、魚鰓和內臟，其余部分清洗干凈，用骨泥磨粉碎，得到魚泥。將魚泥按照每包100 g進行分裝，-18 ℃冷凍備用。實驗前取出在流水下解凍約1～2 h。按2∶1的比例取魚泥和水置于燒杯中，攪拌均勻，放入微型磁力攪拌子，開動磁力攪拌器，85 ℃的溫度下預處理30 min。調節溫度降至50 ℃，加入風味蛋白酶，酶解時間240 min，加酶量(酶料比)6‰，酶解pH值調為7.0；再加入復合蛋白酶，酶解時間240 min，加酶量(酶料比)5‰，酶解pH值調至7.0。待反應完成后，升溫至90 ℃進行滅酶，滅酶時間30 min，得到產物即為鯽魚酶解基料。

1.2.2 鯽魚酶解基料發酵單因素實驗

在其他因素不變的條件下，分別研究接種量、食鹽添加量、發酵溫度和發酵時間對鯽魚酶解基料發酵的影響，酶解后的鯽魚基料發酵實驗條件：戊糖片球菌發酵劑接種量6%，食鹽添加量7%，發酵溫度35 ℃，發酵時間4 d，分別研究發酵時間1，2，3，4，5 d；食鹽添加量4%、5%、6%、7%、9%；發酵溫度25，35，40 ℃；接種量0%、3%、6%、9%等對發酵后液體的總酸(以乳酸計)、多肽、氨基酸態氮、I+G含量的影響。

1.2.3 正交實驗

根據單因素實驗結果，在最佳發酵溫度(35 ℃)條件下，以總酸(以乳酸計)、多肽、氨基酸態氮、I+G的含量作為評價指標，設計三因素(發酵時間、接種量、加鹽量)三水平的正交實驗，確定戊糖片球菌發酵的最佳工藝。正交實驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 鯽魚發酵產物理化成分分析

鯽魚魚肉中總氮含量的測定參考李河等的蛋白質測定方法[13]；總酸含量的測定參考鄒大維等的方法[14]； 氨基酸態氮含量的測定參考甲醛滴定法[15]；呈味核苷酸二鈉(I+G)的測定參考SB/T 10371-2003；多肽的測定參考魯偉等的方法[16]。

1.2.5 揮發性風味物質分析方法

參考李夢茹的方法加以修改[17]，采用PDMS/DVB涂層的固相微萃取對鯽魚基料及發酵料進行萃取，萃取條件：添加NaCl至飽和后，在40 ℃下萃取30 min。色譜柱：DB-5MS系列彈性毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：柱初溫40 ℃，以1.5 ℃/min升至70 ℃，然后以2 ℃/min升至100 ℃，再以6 ℃/min升至230 ℃，最后以15 ℃/min升至280 ℃，保持 2 min；進樣口溫度250 ℃；載氣(He)柱流量：恒壓 12 psi；不分流；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z 40～400。

2 結果與討論

2.1 發酵時間對發酵效果的影響

發酵時間對發酵效果的影響見圖1。

圖1 發酵時間對發酵過程的影響Fig.1 The effect of fermentation time on the fermentation process

注：a為總酸及I+G含量；b為多肽及氨基酸態氮含量。

由圖1可知，鯽魚酶解基料接種戊糖片球菌發酵劑后總酸(以乳酸計)、氨基酸態氮、I+G、多肽含量的變化均隨發酵時間的延長呈上升趨勢，發酵4 d后，發酵趨于穩定，4 d后增長不多。因此后續實驗發酵時間選擇4 d。

2.2 發酵溫度對發酵效果的影響

發酵溫度對發酵效果的影響見圖2。

圖2 發酵溫度對發酵過程的影響Fig.2 The effect of fermentation temperature on the fermentation process

注：a為總酸及I+G含量；b為多肽及氨基酸態氮含量。

由圖2可知，鯽魚酶解基料接種戊糖片球菌發酵劑后在不同的發酵溫度下，總酸(以乳酸計)、I+G、氨基酸態氮含量在40 ℃時最高，但與35 ℃時差別不大，而多肽含量在35 ℃時達到最大值。而通過感官分析40 ℃發酵后得到的產物有脂肪氧化的味道，綜合考慮，后續實驗發酵溫度選擇35 ℃。

2.3 接種量對發酵效果的影響

接種量對發酵效果的影響見圖3。

圖3 接種量對發酵過程的影響Fig.3 The effect of inoculation amount on the fermentation process

注：a為總酸及I+G含量；b為多肽及氨基酸態氮含量。

由圖3可知，鯽魚酶解基料以及接種不同劑量戊糖片球菌后，總酸(以乳酸計)隨著接種量的增加而增加，接種量達到6%后趨于平穩，而氨基酸態氮和多肽含量在接種量為3%時增加，增加接種量后發酵趨于平穩，I+G隨接種量增加不斷增加。綜合考慮，后續實驗接種量選擇6%。

2.4 加鹽量對發酵效果的影響

加鹽量對發酵效果的影響見圖4。

由圖4可知，鯽魚酶解基料以及接種戊糖片球菌發酵劑后在不同的加鹽量下，總酸(以乳酸計)、氨基酸態氮、I+G、多肽含量均呈先上升后下降的趨勢，總酸、I+G、氨基酸態氮隨加鹽量的上升而上升，加鹽量為7%時達到最大值，而多肽含量在加鹽量為6%時達到最大值。推測可能是由于在鯽魚酶解基料中，加入適量的食鹽可以抑制雜菌的生長，而戊糖片球菌可以在一定的鹽度中生長，但是當鹽濃度過大時，戊糖片球菌的生長也受到抑制。因此后續實驗加鹽量選擇7%。

圖4 加鹽量對發酵過程的影響Fig.4 The effect of additive amount of salt on the fermentation process

注：a為總酸及I+G含量；b為多肽及氨基酸態氮含量。

2.5 正交實驗的結果及分析

表2 正交實驗結果表Table 2 The results of orthogonal test

續 表

由表2可知，綜合總酸、多肽、氨基酸態氮和I+G含量的結果，3個實驗因素對戊糖片球菌發酵鯽魚酶解基料的影響大小主次順序為：C>A>B，即發酵時間>發酵劑接種量>加鹽量。發酵鯽魚蛋白的最佳工藝條件為A3B2C3，即發酵劑接種量為6%，食鹽添加量為7%，發酵溫度為35 ℃，發酵時間為5 d。測得該組戊糖片球菌發酵鯽魚酶解基料的各項理化指標高于正交實驗中的其他組合，驗證了正交設計優化理論的可行性，故該條件可以作為最佳發酵條件。

2.6 不同樣品中揮發性成分分析

表3 鯽魚酶解基料中的揮發性物質Table 3 The volatile substances in crucian carp hydrolyzate

續 表

由表3可知，經GC-MS聯用儀解析，鯽魚酶解基料中風味成分以醇、醛、碳氫化合物為主，醛類含量最高，為35.89%，酯類含量較少(7.03%)。腥味是影響水產品品質的一個重要因素，一般認為醛類、醇類、酮類和少量的呋喃等物質相互協同產生了腥味[18]。現在的研究發現，來源于脂肪氧化降解的醛類物質是引起淡水魚腥味的主要物質，如 2-己烯醛、2,6-壬二烯醛、4-庚烯醛、E,E-2,4-庚-二烯醛、2,4,7-癸三烯醛等，這些醛類物質風味閾值比烷類、醇類、酸類都低且都有異味[19]。但不同品種的水產品中腥味物質含量會因為生長環境、加工方式等不同而有所差異[20]。在鯽魚酶解基料中，含量較高的物質有1-辛烯-3-醇(9.39%)、壬醛(22.20%)、2-癸烯醛(4.78%)、2,4-癸二烯醛(6.72%)。許多研究認為2-癸烯醛、2,4-癸二烯醛是魚腥味的特征物質，1-辛烯-3-醇則表現出類似于蘑菇香味，是形成魚肉風味中的重要氣味物質[21,22]。

表4 戊糖片球菌發酵樣品中的揮發性物質Table 4 The volatile substances in fermentation samples of Pediococcus pentosaceus

續 表

由表4可知，經GC-MS聯用儀解析，鯽魚酶解基料經戊糖片球菌發酵后，揮發性成分以烯類和酯類為主。酯類含量顯著增加33%，主要有棕櫚酸乙酯(奶油香、堅果香)、月桂酸乙酯(花果香)、辛酸乙酯(白蘭地酒香)、肉豆蔻酸乙酯(鳶尾香、油脂香)等，醛類物質只有壬醛1種，且含量僅為5.62%。說明戊糖片球菌使鯽魚酶解基料在發酵過程中產生了明顯的香味物質，同時使腥味物質大大減少，這與付湘晉、黃忠白、吳建中等人的實驗結果基本一致，他們都通過研究發現微生物發酵可以降低水產品中烯醛類、二烯醛等醛類物質的含量，從而減弱腥味[23-25]。另外，本實驗中還檢測出甲氧基苯基肟、2-正戊基呋喃、2-丙基吡啶等呋喃、吡啶等化合物，它們對揮發性風味形成也有一定的輔助作用。

3 結論

戊糖片球菌發酵鯽魚酶解基料的最佳發酵條件：戊糖片球菌發酵劑接種量為6%，加鹽量為7%，發酵溫度為35 ℃，發酵時間為5 d。與鯽魚酶解基料對比，戊糖片球菌發酵后，鯽魚基料中的氨基酸態氮含量增加25.11%，多肽含量增加33.00%，I+G含量增加18.92%，總酸含量增加9.72%。采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術分析，鯽魚酶解基料中的主要揮發性物質為3-甲基-1-丁醇、己醛、1-辛烯-3-醇、2-癸烯醛、2,4-癸二烯醛等；戊糖片球菌在發酵鯽魚酶解基料過程中，能夠顯著增加酯類的含量，增香效果較好。