黃芩提取物對人體腸道菌群及短鏈脂肪酸的影響

劉世鋒 羅玉霜 劉佩琳 康信聰 王蕾伍 睿宇 劉東波

摘 要：目的：通過人體腸道微生物生態模擬系統（SHIME），探究黃芩提取物對人體腸道菌群中的厭氧菌菌群豐度和短鏈脂肪酸（SCFA）的影響。方法：采用體外模擬系統模擬人體腸道微生態。大腸模擬罐中接種人體糞便樣本，待糞便中的微生物維持穩定后，添加黃芩提取物（3.2 g/d）連續干預7 d，使用平板計數法分析模擬系統中的總厭氧菌及乳酸菌的菌群豐度變化，分別使用腦心浸液培養基（BHI）、MRS培養基（MRS）接種菌液，并在厭氧箱中倒置培養48 h。使用氣相色譜分析黃芩提取物干預前后的腸道菌群代謝產物SCFA（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸和己酸）的含量變化。結果：與第6天取樣結果相比，第14天的取樣結果黃芩提取物增加了乳酸菌在內的厭氧菌菌群豐度。SCFA中的丁酸含量顯著上升（P<0.01），而異戊酸含量顯著下降（P<0.01）。乙酸沒有顯著差異。結論：黃芩提取物可能通過改善乳酸菌及總厭氧菌的菌群豐度，提高丁酸含量，達到治療腸道疾病的功效，為中草藥黃芩提取物的體內研究奠定基礎。

關鍵詞：人體微生物生態系統模擬器;黃芩提取物;腸道菌群;短鏈脂肪酸

腸道菌群與宿主相互依存、共同進化，在維持機體免疫和代謝穩態以及抵御病原體方面發揮著至關重要的作用[1]。腸道菌群組成的改變（生態失調）與肥胖、糖尿病以及心腦血管等疾病的發生密切相關[2]。短鏈脂肪酸（SCFA）是人體腸道菌群代謝的主要終產物，主要由厭氧微生物發酵難消化的碳水化合物產生。SCFA包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸和己酸等，其中乙酸、丙酸、丁酸占比最高，達到總SCFA的90%以上。SCFA可以降低結腸內 pH 值，提高其酸性環境從而抑制有害菌的生長;維持水電解質平衡[3];抑制組蛋白去乙酰化酶和激活G蛋白偶聯受體GPR41、GPR43和GPR109α[4]，調節腸道、神經、內分泌和血液等不同系統的功能，成為調節代謝紊亂和免疫的關鍵因子。另外，SCFA還可以通過激活核轉錄因子-κB（NF-κB）來抑制細胞因子的產生（如IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）[5]從而減少炎癥反應的發生;炎癥過程中，SCFA通過激活GPR43[6]，調節中性粒細胞產生活性氧和吞噬作用來刺激中性粒細胞遷移[7]，從而促進粘膜炎癥的修復，降低結腸病變的發生。因此，越來越多的證據支持SCFA在形成局部和外周免疫系統中發揮了關鍵作用，并通過炎癥途徑影響宿主的代謝。

現代藥理學研究發現，黃芩具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗抑郁等作用[8]。劉曉曦等[9]研究發現，黃芩水提液可以緩解腸炎小鼠的炎癥反應來促進腸道的損傷修復。然而，目前針對人體腸道菌群的干預研究尚欠缺。人體腸道微生物生態模擬系統（SHIME ），是由比利時根特大學Verstraete研制出來的一套包含胃、小腸以及大腸的完整模擬消化系統。SHIME系統的設計著重于模擬結腸微生物群落，因其穩定性好、采集樣品方便、節省時間等優點，是研究體外胃腸道不同部位營養對腸道菌群組成影響的有效工具[10]。本研究應用SHIME模擬人體胃腸道系統，通過使用黃芩提取物對模擬腸道微生態進行干預，對系統產出的消化液進行檢測與分析，分析黃芩水提物對腸道菌群及其代謝產物SCFA的影響，探究黃芩對預防與治療腸道炎癥的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 LABOROTA 4001旋轉蒸發儀，德國Heidolph公司;XS205十萬分之一分析天平，德國METTLER TOLEDO公司;PL403分析天平，METTLER TOLEDO;LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;雙列六孔水浴鍋、DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;冰箱，海爾;KQ-52008超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司;SHIME系統，北京佳德精密科技有限公司;YQX-II型厭氧培養箱，金壇區白塔安瑞實驗儀器廠;SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;PYX-300G-B光照培養箱、QL-901 Vortex渦混儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;2-16R高速冷凍離心機，湖南恒諾儀器設備有限公司;GC-2010氣相色譜儀，日本島津公司;RE-52A旋轉蒸發器，上海雅榮生化儀器設備有限公司。

1.1.2 試劑 黃芩，購自九芝堂股份有限公司長沙店;阿拉伯半乳聚糖、木聚糖、淀粉、葡萄糖、碳酸氫鈉、酵母提取物、蛋白胨、半胱氨酸、吐溫80、氯化鈉、果膠、一水硫酸錳、七水硫酸鐵、七水硫酸鈷、七水硫酸鋅、五水硫酸銅、磷酸氫二鉀、氯化鈣、七水硫酸鎂、血紅素、對-氨基苯甲酸、氯化鈉、胃蛋白酶、36.5%濃鹽酸、氫氧化鈉、胰蛋白酶、硫酸鋁鉀、硼酸、鉬酸鈉、氯化鎳、亞硒酸鈉、生物素、泛酸鹽、煙酰胺、維生素B12、硫胺、甲萘醌、豬膽鹽、碳酸氫鈉、PBS固體粉末、無菌蒸餾水。

標準品：乙酸、丙酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸、己酸、2-乙基丁酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;正丁酸，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃芩的處理 稱量85 g黃芩，以10倍量的沸水提取1.5 h，分離料液與殘渣，殘渣再以8倍量的沸水繼續提取1 h，合并料液，減壓濃縮，再冷凍干燥，得黃芩提取物凍干樣品 28.45 g。

1.2.2 模擬消化方法 系統模擬實驗方法包括系統時間、速度及其他參數設定，糞便接種液制備，腸道微生態的增殖和穩定，胃和小腸消化液、營養液制備，以及模擬消化步驟均借鑒于暨南大學邵鑫[11]的試驗方法。為使系統內菌群增殖并達到穩定狀態，設定周期內的第1～6天為穩定期，穩定期內每日9∶00、15∶00、21∶00 給予260 mL混合營養液。第7～14天為加入黃芩提取物的干預期，干預期內9∶00的喂料需混入3.2 g黃芩提取物凍干粉，其余操作均與穩定期相同。

1.2.3 菌種的培養計數 每天第1次喂食前對大腸消化液取樣，取樣的樣品分別存放于4 ℃和-80 ℃冰箱。消化液中菌群豐度采用平板菌落計數法進行菌群數量的測定，分析總厭氧菌、乳酸菌群落數量的變化。（1）菌種的培養：分別取同一天存儲于4 ℃冰箱的大腸消化液樣品1 mL，用無菌PBS緩沖液進行梯度稀釋?？倕捬蹙?、乳酸菌的每個稀釋度分別涂布3個平板，每皿1 mL稀釋樣品，分別做好標記。接種結束后及時分別將15～20 mL BHI、MRS瓊脂培養基傾注到相應標記的每個平板中。其中，總厭氧菌采用BHI瓊脂培養基計數，乳酸菌采用MRS瓊脂培養基計數，將總厭氧菌、乳酸菌轉移到厭氧培養箱中倒置培養（48±2）h。（2）菌種的計數：培養（48±2）h后，計數每個平板上的菌落數，計數時選取菌落數在30～300 之間的平板（SN標準要求為25～250個菌落），若有二個稀釋度均在30～300 之間時，按國家標準方法要求應以二者比值決定，比值≤2取平均數，比值>2則取其較小數字。在記下各平板的菌落總數后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數，計算出原始樣品每毫升中的菌落數。到達規定培養時間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置于0～4 ℃處儲存，但不得超過24 h。

1.2.4 GC檢測SCFA （1）GC分析條件：DB-FATWAX UI（30 m×0.250 mm×0.25 μm）毛細管色譜柱，載氣為高純氮氣，柱流量1.5 mL/min，升溫程序為：初始溫度70 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至160 ℃，保持6 min，再以30 ℃/min升至210 ℃，保持5 min;進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，分流比19∶1，進樣量0.5 μL。（2）標準品溶液制備：對8個SCFA混合標準溶液的制備，稱量乙酸20.9 mg、丙酸20.5 mg、異丁酸9.9 mg、丁酸12.0 mg、異戊酸9.5 mg、戊酸9.2 mg、己酸9.0 mg、2-乙基丁酸9.6 mg，并用含有1%甲酸水定容至10 mL，制成混合標準品母液，分別移取該母液稀釋1、2、5、10、100、500、100倍，配制成不同濃度的混標，用一次性0.45 μm水膜過膜后，在4 ℃冰箱存放備用。（3）樣品溶液制備：取穩定期、干預期最后一天的大腸消化液2 mL至離心管中，加入1%甲酸水，渦混儀上混勻30 s，加入內標2-乙基丁酸1 μL，混勻1 min，再以8 000 r/min離心10 min，移取上清液過0.45 μm水膜進行氣相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 黃芩提取物對腸道菌群豐度的影響

2.1.1 總厭氧菌數量變化 總厭氧菌數量在前6天的穩定期內出現波動，但整體仍維持相對穩定，從第7天開始進入干預期后，總厭氧菌的數量明顯上升，從第9天開始總厭氧菌的數量基本保持穩定，數量約為109.03～109.07CFU（圖1）。

2.1.2 乳酸菌的數量變化 穩定期內，乳酸菌的數量在前3天顯著上升后維持基本穩定，從第7天進入干預期開始，乳酸菌的數量增至最大，并在維持期內基本保持穩定，數量約為106.78～106.90CFU（圖2）。

3 短鏈脂肪酸含量變化分析

取SHIME運行周期中穩定期、干預期最后一天的大腸消化液，對其中的7種SCFA（乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸、己酸）含量進行檢測分析。如圖3所示，消化液中的SCFA以乙酸、丙酸、丁酸為主，占總含量的96.76%。經黃芩提取物干預后，大腸中的丁酸含量上升了650.57%，為0.48 mg/mL;異戊酸含量下降了84.60%，為0.004 mg/mL;其余組分含量的變化不呈現顯著性差異。

4 討論

SHIME系統是基于人體體內消化環境而建立起的人體體外消化模型，可預測食物、藥物在人體內的消化代謝，研究和理解營養物質、藥物和非營養化合物的變化、相互作用以及生物可及性[12]。本研究參考邵鑫[11]的試驗方法，建立胃腸道消化模擬系統，并參照《藥典》記錄的黃芩推薦單日攝入量，給予系統等當量的黃芩提取物進行混合干預，旨在探究黃芩提取物對人體胃腸道消化系統中厭氧菌及菌群產物-短鏈脂肪酸的影響。

本研究結果表明，黃芩提取物增加了大腸發酵罐中總厭氧菌及乳酸菌的豐度，并促進了丁酸的產生。厭氧菌包含了普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）、直腸真桿菌（Eubacterium rectale）、霍氏真桿菌（Eubacterium hallii）、布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）等菌屬，這些菌屬可產生大部分的丁酸[13]。丁酸鹽不僅可以抑制NF-κB，激活巨噬細胞，而且能夠抑制組蛋白去乙?；富钚裕℉DAC）[14]，產生抗炎作用。乳酸菌是腸道內不同于革蘭氏陽性菌的一類細菌的統稱，乳酸菌可以通過分泌各種代謝產物及細菌素抑制腸內腐敗菌的生長，或與腸內致病菌群競爭消化道附著位點和營養等從而維持腸內的菌群微生態平衡[15]。本研究發現，黃芩提取物干預后乳酸菌豐度顯著上升。因此，黃芩常用于治療腸道疾病可能與其增加大腸內乳酸菌、丁酸產生菌的豐度，以及提高丁酸含量有關。

蛋白質發酵可產生支鏈脂肪酸，如分別來自于支鏈氨基酸纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的異丁酸、2-甲基丁酸和異戊酸酯[16]。異戊酸可以通過抑制Na+/K+-ATPase9（一種維持正常神經傳遞所必需的基礎電位膜的關鍵酶）[17]，減少AMPA受體中GluR2亞基的比例，進而減少Na+流入，最終導致抑郁癥的發生。有研究發現，黃芩苷能通過影響AMPA受體的表達，起到抗抑郁的作用[18];前期試驗表明，黃芩苷是黃芩提取物中的主要成分，在本試驗干預期內異戊酸產出量顯著降低，推測黃芩提取物可能通過抑制異戊酸的合成，進而上調AMPA受體的表達，發揮其抗抑郁作用。

本研究建立了黃芩提取物-腸道菌群-丁酸功能軸，從腸道微生物及代謝產物的角度闡述了中藥黃芩干預腸道生態的基本機制。未來本課題組將使用糖尿病人的腸道菌群進行下一步試驗，本研究為進一步開展黃芩提取物的人群試驗奠定基礎。

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