杞歸八味口服液對魚藤酮誘導PC12細胞損傷的防護作用*

傅若秋，李 斌，王顯鳳，張 琳，王林麗，陳劍鴻

（中國人民解放軍陸軍軍醫大學大坪醫院藥劑科，重慶400042）

神經退行性疾病是中老年人的常見疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化、多發性硬化等[1]，發病原因較復雜，大多機制不明，其共同點為大腦和脊髓的神經元細胞發生病變，出現損傷，常用的治療策略為對神經元細胞進行保護[2]。中藥及中藥單體在調節神經系統、保護神經細胞方面有獨特作用，如半夏瀉心湯、天麻鉤藤飲、槲皮素、花青素等多種中藥復方制劑或中藥單體均可防護神經細胞免受損傷[3－6]。杞歸八味口服液（曾用名益精靈口服液）為我院特色自制制劑，由何首烏、枸杞子、菟絲子、牛膝、當歸、補骨脂、茯苓、陳皮8味中藥組方，具有健腦安神、滋補肝腎功效，用于治療失眠多夢、健忘、腰膝酸軟、神疲乏力等癥，療效顯著，已在臨床使用近30年。其組方中所含甜菜堿、β蛻皮甾酮、異鼠李素等活性成分具有神經保護作用[7－9]。前期研究證實，其具有神經系統調節作用，可抗抑郁和增強小鼠的學習能力[10]。本研究中探討了杞歸八味口服液對魚藤酮誘導PC12細胞損傷的防護作用及其作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：3111型CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）；GS－15KGS型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；CKX41型光學倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；165－8001型蛋白電泳儀、轉膜槽、Chem I Doc型超高靈敏度化學發光成像系統（美國Bio－Rad公司）；HR30－11A2型生物安全柜（青島海爾股份有限公司）；C6型流式細胞儀（美國BD公司）；STNERGYH1型酶標儀（美國Agilent公司）。

試藥：杞歸八味口服液（醫院制劑，批號為200413）；魚藤酮（美國Selleck公司，批號為S2348）；PRIM培養基（美國Hyclone公司，批號為SH30809.01）；胎牛血清（天津康源生物技術有限公司，批號為20200408）；Western細胞裂解液（批號為P0013），BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號為P0009），胰酶消化液（批號為C02010），均購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號為556547）；CCK－8試劑盒（美國MCE公司，批號為HY－K0301）；辣根酶標記山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號為ZB2305）；預染蛋白Marker（美國Thermo公司，批號為26619型）；蛋白激酶B（AKT）抗體（批號為ab200195），磷酸化AKT（p－AKT）抗體（批號為ab192623），哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗 體（批 號 為ab2723），磷 酸 化mTOR（pmTOR）抗體（批號為ab137133），c－Jun氨基端蛋白激酶（JNK）抗體（批號為ab179461），磷酸化JNK（p－JNK）抗體（批號為ab124756），均購自美國Abcam公司；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（美國CST公司，批號為21185）；聚腺苷二磷酸－核糖多聚酶（PARP）抗體（批號為13371－1－AP），cleaved－Caspase3（c－Caspase3）抗體（批號為19677），均購自武漢三鷹生物技術有限公司）。

細胞：鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤PC12細胞株（美國ATCC細胞庫，批號為CRL－1721）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

PC12細胞用PRIM培養基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO2條件下恒溫培養箱中培養，隔天傳代，取對數生長期細胞進行試驗。

1.2.2 CCK－8試驗檢測

取對數生長期的PC12細胞，經胰酶消化后得細胞懸液，按（5 000個細胞，90 μL）／孔接種于96孔板中，于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，加入受試藥物10 μL。藥物分組：1)杞歸1組、2組、3組、4組、5組（以杞歸八味口服液原液濃度為100%計，作用濃度分別為0.1%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%），藥物作用24 h；2)魚藤酮1組、2組、3組、4組、5組（相當于魚藤酮0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 μmol／L），藥物作用24 h；3)杞歸八味口服液聯用魚藤酮：空白對照組（水）、魚藤酮4組，以及杞歸1，2，3，4，5（0.2%，0.4%，0.6%，0.8%）＋魚藤酮4組，先給予杞歸八味口服液預處理2 h，再給予魚藤酮作用24 h。藥物處理結束后，每孔加入CCK－8試劑10 μL，置培養箱中孵育1 h，用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度，并計算細胞存活率。

1.2.3 流式細胞儀檢測

取對數生長期的PC12細胞懸液，按2.0×105個／孔接種于6孔板中，每孔培養基體積2 mL，于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，給予杞歸八味口服液及魚藤酮藥液作用24 h。胰酶消化后收集于15 mL離心管中，800 r／min離心5 min，棄上清液，用2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）混懸細胞，800 r／min離心5 min，棄上清液，加入凋亡檢測染色液（含Annexin V－FITC染液2 μL，PI染液5 μL，Binding buffer 100 μL），混勻，室溫避光染色15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并計算凋亡率。

1.2.4 蛋白質印跡（Western blotting）法檢測

取對數生長期的PC12細胞懸液，按2.0×106個／孔接種于100 mm培養皿中，每孔培養基10 mL，于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，給予杞歸八味口服液預處理2 h，然后給予魚藤酮作用24 h。提取全細胞蛋白，用BCA法測定蛋白含量。蛋白液中加入5×loading buffer混勻，于98℃加熱使蛋白變性。變性后的蛋白樣品用聚丙烯凝膠電泳進行分離，分離后的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗孵育過夜。次日回收一抗，TBST漂洗后于室溫下孵育二抗1 h。TBST漂洗后加入發光底物，用凝膠成像系統進行曝光。WB條帶用Image J 1.37C軟件測量其灰度值，以目的蛋白與內參蛋白的灰度比值作為蛋白表達水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對PC12細胞存活率的影響

與空白對照組比較，杞歸3組、4組、5組的細胞存活率均顯著升高，且呈量效依賴趨勢（P＜0.05）；魚藤酮1組、2組、3組、4組、5組的細胞存活率均顯著降低，且呈量效依賴趨勢（P＜0.01）。詳見表1。

表1 杞歸八味口服液及魚藤酮對PC12細胞存活率的影響Tab.1 Effects of Qigui Bawei Oral Liquid and rotenone on the survival rate of PC12 cells

2.2 對魚藤酮降低PC12細胞存活率的影響

與魚藤酮4組比較，杞歸3，4，5＋魚藤酮4組的細胞存活率均顯著升高，且呈量效依賴趨勢（P＜0.01）。可見，聯用杞歸八味口服液可明顯減弱魚藤酮導致的細胞存活率下降。詳見表2。

表2 杞歸八味口服液對魚藤酮降低PC12細胞存活率的影響Tab.2 Effect of Qigui Bawei Oral Liquid on rotenone reducing the survival rate of PC12 cells

2.3 對魚藤酮誘導細胞凋亡的影響

與空白對照組比較，魚藤酮組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與魚藤酮組比較，杞歸4＋魚藤酮4組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。可見，魚藤酮能明顯誘導PC12細胞凋亡，但杞歸八味口服液能阻止魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡。詳見圖1和表3。

圖1 流式細胞儀檢測PC12細胞凋亡情況A.Blank control group B.Rotenone group 4 C.Qigui group 4 D.Qigui group 4＋rotenone group 4Fig.1 The apoptosis of PC12 cells detected by flow cytometry

2.4 對魚藤酮激活凋亡相關蛋白和AKT／mTOR及JNK信號通路的影響

與空白對照組比較，魚藤酮4組PARP蛋白表達水平顯著降低，c－Caspase3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與魚藤酮組比較，杞歸4＋魚藤酮4組PARP蛋白表達水平顯著升高，c－Caspase3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。可見，魚藤酮能明顯激活凋亡相關蛋白，但聯用杞歸八味口服液可明顯減弱魚藤酮對凋亡蛋白的激活。與空白對照組比較，魚藤酮4組p－AKT和p－mTOR蛋白表達水平均顯著降低，p－JNK蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與魚藤酮4組比較，杞歸4＋魚藤酮4組p－AKT和p－mTOR蛋白表達水平均顯著升高，p－JNK蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。可見，魚藤酮抑制了AKT／mTOR信號通路，并激活了JNK信號，但聯用杞歸八味口服液可明顯減弱魚藤酮對AKT／mTOR及JNK信號通路的影響。詳見表3和圖2。

表3 細胞凋亡率及蛋白表達水平比較(±s)Tab.3 Comparison of apoptosis rate and protein expression level(±s)

表3 細胞凋亡率及蛋白表達水平比較(±s)Tab.3 Comparison of apoptosis rate and protein expression level(±s)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與魚藤酮4組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Compared with those in the blank control group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with those in the rotenone group 4，△P＜0.05，△△P＜0.01.

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圖2 Western blotting法檢測PC12細胞的蛋白表達水平A.Blank control group B.Rotenone group 4 C.Qigui group 4 D.Qigui group 4＋rotenone group 4Fig.2 The protein expression of PC12 cells detected by Western blotting

3 討論

PC12細胞是一種大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞株，具有神經內分泌細胞的普遍特征，且可傳代，廣泛用于神經生理及藥理學研究[11]。魚藤酮是一種從豆科魚藤屬植物中提取的異黃酮化合物，在農業上作為殺蟲劑被廣泛使用，因具有較強的神經毒性，也被作為神經細胞損傷的造模藥物廣泛應用[12]。在構建魚藤酮損傷的PC12細胞模型中，不同研究者所用的魚藤酮劑量及作用時間不一致，作用濃度為0.5～10 μmol／L，作用時間為4～24 h[13－15]，這可能與各實驗室所用培養條件、細胞狀態及細胞對藥物的敏感度不一致有關。通過前期試驗，選擇魚藤酮濃度為4 μmol／L，作用時間為24 h，成功構建了PC12細胞損傷模型，細胞凋亡率可達33%，細胞活性下降約40%。

通過預試驗發現，0.5%及1.0%濃度的杞歸八味口服液可增強PC12細胞的活性，但2.0%濃度的杞歸八味口服液反而使PC12細胞活性降低。進一步考察杞歸八味口服液在0.1%～0.8%濃度范圍內對PC12細胞活性的影響，結果發現0.4%～0.8%濃度的杞歸八味口服液可增強PC12細胞的活性，可明顯減弱魚藤酮導致的PC12細胞活性下降，且0.6%濃度時作用即達到最大，故選擇0.6%濃度作為后續藥理機制研究的作用濃度。

細胞凋亡是細胞死亡的一種常見方式，也是魚藤酮損傷PC12細胞的主要原因[16]。PARP蛋白可特異性地識別DNA斷裂末端并結合，是一種重要的DNA修復酶，當凋亡發生時，可被上游的Caspase－3剪切降解而喪失DNA修復功能[17]。Caspase－3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，通過自身剪切激活后，再催化PARP發生降解[18]。因此，Caspase－3剪切激活及PARP發生降解被認為是凋亡發生的標志[19]。本試驗結果證實，魚藤酮誘導PC12細胞發生凋亡，Wester blotting試驗結果證實，魚藤酮可導致PARP降解（PARP蛋白表達水平降低）和Caspase－3剪切激活（c－Caspase3蛋白表達水平升高）。同時，杞歸八味口服液能減弱魚藤酮誘導的細胞凋亡，并減弱魚藤酮導致的PARP蛋白表達水平的降低及c－Caspase3蛋白表達水平的升高，表明杞歸八味口服液減輕了魚藤酮對PC12細胞的損傷作用。

常見的有PI3K／AKT／mTOR，MAPK（JNK／ERK／P38），STAT3，Wnt／β－catenin，NF－κB等[20]信號通路蛋白參與細胞凋亡的調控。而AKT／mTOR通路的抑制及JNK信號激活是魚藤酮導致神經細胞損傷的常見機制[21－22]。AKT是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，作用廣泛，與細胞內許多信號通路有關；mTRO是AKT的下游分子，屬于一種不典型的絲氨酸／酪氨酸蛋白激酶。AKT／mTOR信號通路對維持細胞存活、促進細胞增殖和生長非常重要。在中樞神經誘導損傷的研究中發現，抑制AKT／mTOR通路可加重神經細胞的損傷作用，而激活該通路則可對神經細胞起保護作用[23]。JNK是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK家族的一員，在細胞凋亡的調控中發揮重要作用，JNK磷酸化激活后能介導多種細胞（如神經、心肌、肝、腫瘤等）的凋亡反應[24]。本試驗結果顯示，魚藤酮可抑制AKT／mTOR信號通路，并激活JNK信號；同時發現杞歸八味口服液可減弱魚藤酮對AKT／mTOR通路的抑制及對JNK的激活作用，表明杞歸八味口服液通過AKT／mTOR及JNK途徑保護了PC12細胞。

綜上所述，杞歸八味口服液可減輕魚藤酮對PC12細胞的損傷作用，可能與其減弱了魚藤酮對AKT／mTOR及JNK信號通路的影響有關。由于杞歸八味口服液成分復雜，其發揮神經保護作用的具體物質基礎（有效單體化合物）還有待進一步研究。