不同產地蒙紫草中左旋紫草素和β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧含量測定及質量標準研究*

呂曉潔，渠 弼，劉德旺，程丹丹，那生桑

（1.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特010110；2.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院，內蒙古 呼和浩特010110）

蒙紫草為紫草科植物疏花軟紫草Arnebia szechenyiKanitz.的干燥根，蒙文植物名塔日漠格－希日－伯日漠格。據《內蒙古植物藥志（第二卷）》[1]《內蒙古植物志（第四卷）》[2]記載和蒙醫用藥情況考證，屬蒙醫自采自用的常用藥材。本課題研究的藥材為新起草品種，紫草收載于2020年版《中國藥典（一部）》[3]，為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.或內蒙紫草Arnebia guttataBunge的干燥根，二者來源不同。本品藥材蒙名和中文名根據《中國蒙藥名詞規范（2016年版）》紫草名前冠“蒙”而成，植物屬名加藥用部位自擬拼寫了藥材品種拉丁名，根據《內蒙古蒙藥炮制規范（2015年版）》命名方法確定品名，與藥材名一致。疏花軟紫草為礫石生旱生植物，生于石質山坡及山坡溝地，見于巴彥淖爾市、阿拉善市、賀蘭山等地。蒙紫草根部入藥，性涼，味甘、微苦，有清熱、涼血、止血、透疹功效。該藥雖入味多種蒙醫藥傳統復方制劑，但現代研究甚少，與其他屬紫草混用嚴重。本研究中參考2020年版《中國藥典（一部）》紫草項下規定，從藥材的性狀、顯微特征、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、含量測定等方面進行研究，建立其質量標準，為蒙紫草的進一步應用提供了科學依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（美國Thermo公司)，包括四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、二極管陣列（DAD）檢測器、Chromeleon 7色譜工作站；AL204型電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司，精度為十萬分之一）；TU－1901型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；SX2－4－10型馬弗爐（天津市中環實驗電爐有限公司）；SB5－12DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

左旋紫草素對照品（批號為110769－200506，含量為98%），β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧對照品（批號為111689－201504，含量為98%），均購自中國食品藥品檢定研究院）；GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純（美國Fisher公司）；其他試劑均為分析純，水為超純水。蒙紫草藥材信息見表1。采摘地點A，內蒙古自治區巴彥淖爾市烏特拉前旗；采摘地點B，內蒙古自治區巴彥淖爾市烏特拉后旗；采摘地點C，內蒙古自治區烏海拉僧廟；采摘地點D，內蒙古自治區烏海老石旦洗煤廠；采摘地點E，內蒙古自治區烏海烏巴公路41 km；采摘地點F，內蒙古自治區阿拉善右旗阿貴廟。經內蒙古醫科大學渠弼教授鑒定為紫草科植物疏花軟紫草Arnebia szechenyiKanitz.的干燥根。

表1 蒙紫草藥材信息Tab.1 Information of Arnebiae Szechenyi Radix

2 方法與結果

2.1 藥材性狀

本品呈圓錐形或圓柱形，稍扭曲，長6～15 cm，直徑0.5～3.0 cm。根頭部略粗大，頂端有殘莖多個，被短硬毛；表面紫紅色或灰紫色，皮部常數層相疊，易剝離。質硬而脆，易折斷，斷面較整齊，皮部紫紅色，木部黃白色；氣特異，味微甘、微澀。

2.2 藥材鑒別

2.2.1 顯微鑒別

橫切面：木栓層1至多層，將皮層及韌皮部分隔呈層狀，外側皮層及韌皮部多頹廢呈裂隙狀。內側皮層狹窄，由2～3層薄壁細胞組成，細胞多切向延長。韌皮部寬廣，射線細胞多列放射狀，韌皮束內側細胞常木栓化。束間形成層明顯，木質部放射狀，外側導管多徑向排列，老根中心具木栓層環，環內組織除導管外多頹廢呈裂隙狀。木栓細胞和部分薄壁細胞含紫色素。詳見圖1。

圖1 蒙紫草藥材橫切面特征（×40）A.Cross sectional characteristics of Arnebiae Szechenyi Radix B－C.Cork layer and cortex D－E.Phloem，cambium and xylem F.Decadent xylem in the center of old root G.Interfascicular cambiumFig.1 Cross section characteristics of Arnebiae Szechenyi Radix（×40）

粉末：呈深紫紅色；非腺毛單細胞，直徑13～36μm，直立或稍彎曲，壁光滑或具壁疣，部分胞腔內含紫棕色色素；栓化細胞紅棕色，表面觀呈多角形或圓多角形，含紫紅色色素；薄壁細胞較多，淡棕色或無色，大多充滿紫紅色色素；導管主為網紋導管，少有具緣紋孔導管，直徑9～60 μm。纖維紋孔明顯，直徑7～15 μm。詳見圖2。

圖2 蒙紫草藥材粉末特征（×400）A.Non－glandular hair B.Vessels C.Cork cells D.Fiber E.Parenchyma cellsFig.2 Powder characteristics of Arnebiae Szechenyi Radix（×400）

2.2.2 薄層鑒別

取本品粉末0.5 g（過3號篩），精密稱定，加石油醚（60～90℃）20 mL，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）20 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取左旋紫草素和β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧對照品適量，用乙醇配成質量濃度為1 mg／mL的對照品溶液。照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各4 μL，分別點于同一硅膠板上，以環己烷－甲苯－乙酸乙酯－甲酸（5∶5∶0.5∶0.1，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同紫紅色斑點，再噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，斑點變為藍色，且斑點均分離清晰。詳見圖3。

圖3 蒙紫草薄層色譜圖A.before color development B.after color development1－7.Samples of batches 1－7a.L－shikonin reference substance b.β，β′－dimethylacrylalkannin reference substanceFig.3 TLC chromatograms of Arnebiae Szechenyi Radix

2.3 水分、灰分、浸出物檢查

本品屬根類藥材，根皮失水后較脆且薄，根據前期研究，有效成分中含有水溶性物質，不適合用水清洗，處理和采集過程中易帶入泥土等雜質而影響藥材質量，故參考2020年版《中國藥典（四部）》通則2302檢查其總灰分和酸不溶性灰分。此外，藥材含水量反映其干燥程度，影響有效成分的穩定性和批量加料時的準確性，合適的水分含量可防止儲存過程中的蟲害與霉變，避免有效成分分解、酶解變質等，故進行水分檢查（通則0832第二法）。同時，參考通則2201水溶性浸出物測定法的冷浸法、醇溶性浸出物測定法，對收集藥材的水溶性和醇溶性浸出物進行了含量測定。結果見表2。考慮試驗主要在秋冬干燥季節進行，故規定蒙紫草水分含量不得過12.00%；其余項目的含量，結合具體情況，初步制訂質量標準為：總灰分含量不得過8.00%，酸不溶性灰分含量不得過2.00%，水溶性浸出物含量不得低于30.00%，醇溶性浸出物含量不得低于10.00%。

表2 樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物及醇溶性浸出物平均含量測定結果（%，n＝3）Tab.2 Results of content determination of water，total ash，acid insoluble ash，water－soluble extract and alcohol soluble extract in the sample（%，n＝3）

2.4 左旋紫草素含量測定

2.4.1 測定波長選擇

參照2020年版《中國藥典（四部）》通則0401紫外分光光度法，將對照品溶液進行全波長掃描，在516 nm波長處有最大吸收，供試品在相應波長也有最大吸收，陰性對照無干擾，故選擇516 nm為紫外測定波長。

2.4.2 提取方法考察

取粉碎后過3號篩的蒙紫草藥材0.5 g，精密稱定，共3份，分別加入石油醚（60～90℃）和乙醇100 mL，分別浸泡4，5，6 h，不時振搖，濾過。精密量取續濾液5 mL，轉移至25 mL容量瓶中，加溶液至刻度，搖勻，于516 nm波長處測量吸光度，每份重復測定3次。結果同種提取溶劑提取時間越長，提取量越大，乙醇作提取溶劑時，含量增加更快。綜合考慮石油醚和乙醇的提取效果，并考慮時間、提取溶劑的毒性及溶劑的成本問題，參考同屬藥材紫草2020年版《中國藥典（一部）》中的提取方法，結合藥物穩定性綜合考慮，選擇提取溶劑為乙醇，提取時間為5 h。

2.4.3 溶液制備方法

取粉碎后過3號篩的蒙紫草藥材0.5 g，精密稱定，加乙醇100 mL，浸泡5 h，不時振搖，濾過，精密量取續濾液5 mL，轉移至25 mL容量瓶中，加溶液至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取左旋紫草素對照品，精密稱定，加乙醇制成質量濃度為200 μg／mL的對照品溶液。

2.4.4 方法學考察

線性關系考察：將對照品溶液逐級稀釋，于516 nm波長處進樣測定2次，測量吸光度，取平均值，以左旋紫草素質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程Y＝0.024 6X＋0.010 3，R2＝0.999 9（n＝2）。結果表明，左旋紫草素質量濃度在5～50 μg／mL范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：依法制備供試品溶液，于516 nm波長下連續進樣測定6次。結果左旋紫草素吸光度的RSD為0.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為181011）樣品，依法制備供試品溶液，于室溫下放置0，1，2，4，6，8 h時測量吸光度。結果左旋紫草素吸光度的RSD為0.58%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置8 h穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為181011）蒙紫草粉末，精密稱定，依法制備供試品溶液，于516 nm波長下進樣測定6次，記錄吸光度值，并計算含量。結果左旋紫草素的平均含量為2.60%，RSD為1.72%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為181011）已知含量的蒙紫草粉末0.1 g，精密稱定，共9份，依法制備供試品溶液，按50%，100%，150%低、中、高水平加入對照品，測定含量，并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n＝9）Tab.3 Results of the recovery test（n＝9）

2.4.5 樣品含量測定

取1－7號批次樣品，依法制備供試品溶液，分別于516 nm波長處進樣測定3次，并計算含量。結果樣品中左旋紫草素（以干燥品計）的含量介于1.40%～4.09%，平均含量為2.49%。考慮到不同地點、不同時間采集的藥材含量差異較大，故擬訂本品羥基蒽醌總色素（以左旋紫草素計）不得少于1.00%。

2.5 β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧含量測定

2.5.1 提取方法考察

取蒙紫草藥材粉末0.5 g（過4號篩），精密稱定，共4份，分別加入石油醚（60～90℃）和乙醇25 mL，分別超聲（功率為250 W，頻率為33 kHz）處理30 min和45 min，放冷，稱定質量，加相應溶劑補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5 mL，蒸干，殘渣加流動相溶解，轉移至5 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，分別進樣測定3次，記錄峰面積，并計算含量。結果石油醚超聲30 min提取時含量最高。

2.5.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Thermo Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－0.05%甲酸水溶液（70∶30，V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：275 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。理論板數按β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧峰計應不低于5 000。在此色譜條件下，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置處有色譜峰出現，且分離度良好，陰性對照無干擾，表明專屬性良好。詳見圖4。

圖4 β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧高效液相色譜圖1.β，β′－dimethylacrylalkanninA.β，β′－dimethylacrylalkannin reference solution B.Arnebiae Szechenyi Radix test solution C.Negative reference solutionFig.4 HPLC chromatograms of β，β′－dimethylacrylalkannin

2.5.3 溶液制備

取過4號篩的各批次藥材0.5 g，精密稱定，加入石油醚（60～90℃）25 mL，稱定質量，超聲30 min，放冷，補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加流動相溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧對照品，精密稱定，加無水乙醇配制成質量濃度為100 μg／mL的對照品溶液。

2.5.4 方法學考察

線性關系考察：依法制備對照品溶液，逐級稀釋，按擬訂色譜條件進樣測定2次，取平均值，以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝0.208 9X＋0.118 4，R2＝0.999 6（n＝2）。結果表明，β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧質量濃度在10～200 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一批（批號為181011）樣品，依法制備的供試品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣10 μL，測定6次。結果峰面積的RSD為0.21%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為181011）樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，1，2，4，6，8，10 h時按擬訂色譜條件進樣測定。結果峰面積的RSD為0.51%（n＝7），表明供試品溶液室溫下放置10 h內穩定。

重復性試驗：取過4號篩的藥材粉末6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算含量。結果含量的RSD為1.31%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批（批號為20181011）蒙紫草粉末（過4號篩）0.5 g，精密稱定，共9份，依法制備供試品溶液，按50%，100%，150%低、中、高水平加入對照品，按擬訂色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表3。

2.5.5 樣品含量測定

取1－7號批次樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算含量。結果樣品中β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧（按干燥品計）含量介于0.20%～0.33%，平均含量為0.26%。考慮到不同地點藥材含量的差異及阿卡寧的穩定性，擬訂本品含β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧不得少于0.15%。

2.6 蒙紫草質量標準擬訂

綜合考慮成分特征、對照品來源、測量便利，參考同科植物的藥典收載情況[3]、文獻[4－7]報道及預試驗結果，最終采用紫外分光光度法測定羥基蒽醌總色素（以左旋紫草素計）的含量，采用高效液相色譜法測定β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧的含量。雖然該藥材在內蒙古地區多有分布，但成分含量差異很大，入藥效果也有差異。表4列出了8－12號批次藥材的含量測定及檢查各項數據。綜合分析12批次藥材中左旋紫草素和β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧的含量，發現1－7號批次藥材中這2種成分的含量較高。參考文獻[1，5－8]，認為紫草中萘醌類成分為其主要藥效成分，參考2020年版《中國藥典（一部）》中同屬植物紫草項下的含量測定項，根據1－7號批次藥材的產地和采收時間初步擬訂了蒙紫草的質量標準。

表4 8－12號批次樣品中含量測定及檢查項測定結果（%，n＝3）Tab.4 Source of Arnebiae Szechenyi Radix samples of batches 8－12，the results of content determination of L－shikonin and β，β′－dimethylacrylalkannin in the samples，and the results of inspection items（%，n＝3）

3 討論

同科的紫草類植物中，萘醌類是其主要有效成分[4]，主要含紫草素和阿卡寧類[9]，用于治療炎癥、燒傷、麻疹等疾病，可促進傷口愈合[5－7]。紫草素誘導調節氧化應激反應、線粒體功能和細胞骨架形成的信號通路，可作為開發新型抗癌藥的來源化合物[10]，與臨床已有抗癌藥物聯用，可協同抑制腫瘤細胞生長[11]。

從采摘地點來看，烏海拉僧廟、烏海老石旦洗煤廠、烏海烏巴公路41 km處及阿拉善右旗阿貴廟收集的樣品中，β，β′－二甲基丙烯酰阿卡寧和左旋紫草素的含量均遠低于巴彥淖爾市烏拉特前旗、后旗收集的樣品。從采摘時間分析，11月收集的樣品含量普遍低于10月收集的樣品。綜合分析建議，該藥材的最佳采收時間應在初秋，采收地點首選巴彥淖爾市烏拉特前旗、后旗附近。

藥材的質量標準對于其臨床應用、新藥研發、傳統藥物現代化、中蒙藥資源開發，乃至整個中蒙醫藥產業的健康、可持續發展均有重要意義。本課題組采集的藥材是新起草品種，采摘地點位于內蒙古的主要紫草產區，檢測方法為目前普遍認可的藥物質量標準測定方法，制訂的質量標準較完善，可為該藥材的質量控制與藥品品質鑒定提供科學依據，對于該藥材的人工種植、資源擴大有重要意義。后續需進一步對藥材的采收時間、藥理、藥效及不同種屬之間藥材的差異進行更深入的研究。