氣相色譜－質譜法測定葛根和丹參提取回收乙醇中5種揮發性雜質含量

辜俊鑫，史謝飛，李 斌，張學霞

（1.北京同仁堂科技發展成都有限公司，四川 成都610100；2.中國測試技術研究院，四川 成都610021）

藥品和藥用溶劑中有機揮發性雜質的潛在危害已逐漸被重視，控制其含量是目前國內新藥研發的關鍵制約因素[1]。藥用乙醇為常見溶劑，常用于藥品有效成分的提取。使用新乙醇提取時，用量大，藥材提取成本高；連續使用回收乙醇又可能致殘留的揮發性雜質對提取產品造成污染風險。藥品及藥用輔料中揮發性雜質多采用溶解后直接進樣分析[2－5]或頂空進樣分析[6－10]?；厥找掖贾袚]發性雜質的種類及含量受影響因素較多，存在較多不確定性，氣相色譜－質譜聯用(GC－MS)[11－12]法更有利于成分定性和定量分析。本研究中建立了測定葛根和丹參提取回收乙醇中揮發性雜質甲醇、苯、乙醛、乙縮醛、4－甲基－2－戊醇含量的方法，以期為確定回收乙醇的使用周期或循環使用次數提供客觀依據，達到既降低成本又能確保藥品質量的目的?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

R501型旋轉蒸發器（鞏義市英峪儀器廠）；6890N－5973inert型氣相色譜質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；XW－80A型渦旋混合儀（上海馳唐電子公司）。

1.2 試藥

乙醇（藥用級，新鄉市先豐醫藥新材料有限公司，批號為F－01－190301）；乙醛對照品（美國Fluka公司，純度為99.5%）；苯對照品（天津市化學試劑研究廠，純度為99.9%）；乙縮醛對照品（天津市光復精細化工研究所，純 度 為98.0%）；乙 腈、甲 醇 對 照 品（Sigma－ALDRICH，純度為99.9%）；4－甲基－2－戊醇對照品（北京壇墨質檢科技有限公司，純度為99.5%）；丹參（批 號 為Z－24－190201），葛 根（批 號 為Y－01－190301），均購于北京同仁堂科技發展成都有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentDB－624UI柱（60m×250μm，1.4μm）；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；流速：1.0 mL／min；分流比：10∶1；進樣口溫度：230℃；檢測器：質譜儀；離子化能量：70 eV；溶劑延遲時間：4.4 min；柱溫：程序升溫，40℃保持10 min，以5℃／min的速率升至120℃，再以40℃／min的速率升至220℃并保持3 min；掃描方式：離子監測，乙醛選擇離子比（豐度比）為44∶42∶43（100∶20∶52），苯選擇離子比（豐度比）為78∶51∶77（100∶14∶22），乙縮醛選擇離子比（豐度比）為45∶73∶103（100∶79∶28），甲醇選擇離子比（豐度比）為31∶30∶32（100∶20∶52），4－甲基－2－戊醇選擇離子比（豐度比）為45∶69∶87（100∶33∶10）。

2.2 樣品及溶液制備

樣品制備：實驗室分別用藥用乙醇模擬提取葛根和丹參藥材，提取溶劑倍數、提取時間、提取溫度、提取乙醇濃度均與生產工藝一致，只是同比例縮小提取量。提取完全后過濾、減壓濃縮得回收乙醇，再使用回收乙醇作為下次藥材的提取溶劑，回收乙醇在回收過程會有損失，在提取下次的藥材時按回收乙醇的體積同比例縮小，如此反復操作至回收乙醇體積過少無法進行提取為止。

對照品單標貯備液：取乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇對照品各適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，保存于－4℃冰箱中備用。

對照品混標貯備液：分別移取適量乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇單標貯備液，置10 mL容量瓶中，制成乙醛質量濃度為200 mg／L，苯質量濃度為40 mg／L，乙縮醛質量濃度為200 mg／L，甲醇質量濃度為4 000 mg／L，4－甲基－2－戊醇對照品質量濃度為6 000 mg／L的對照品混標貯備液，保存于－4℃冰箱中備用。

供試品溶液：取5 mL回收乙醇樣品，置10 mL容量瓶中，加乙腈定容，混勻，即得。

混合對照品溶液：取對照品混標貯備液250 μL，加乙腈定容，混勻，作為對照品溶液，即乙醛質量濃度為5 mg／L，苯質量濃度為1 mg／L，乙縮醛質量濃度為5 mg／L，甲醇質量濃度為100 mg／L，4－甲基－2－戊醇質量濃度為150 mg／L。

對照品加供試品溶液：準確移取5 mL回收乙醇樣品，置10 mL容量瓶中，加上述對照品混標貯備液250 μL，再加乙腈定容，混勻，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別取乙腈（作為空白溶劑），2.2項下供試品溶液、混合對照品溶液、對照品加供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣分析。結果空白溶劑和供試品溶液中其他化合物均不干擾待測物的測定，且混合對照品溶液和對照品加供試品溶液中待測物的保留時間一致，定量離子對比例和定性離子對的豐度比例一致，表明方法專屬性符合要求。詳見圖1。

圖1 氣相色譜－質譜圖1.acetaldehyde 2.methanol 3.benzene 4.acetal 5.4－methyl－2－pentanolA.Blank solvent B.Test solution C.Mixed reference solution D.Reference and test solutionFig.1 GC－MS spectrum

線性關系考察：分別移取乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇單標貯備液適量，用乙腈配制成乙醛質量濃度分別為10.0，7.5，6.0，5.0，4.0，2.5，1.0 mg／L，苯 質 量 濃 度 分 別 為2.0，1.5，1.2，1.0，0.8，0.5，0.2 mg／L，乙縮醛質量濃度分別為10.0，7.5，6.0，5.0，4.0，2.5，1.0 mg／L，甲醇質量濃度分別為40，30，24，20，16，10，4 mg／L，4－甲基－2－戊醇質量濃度分別為60，45，36，30，24，15，6 mg／L的系列對照品標準溶液。取溶液適量，注入GC－MS分析儀，每個質量濃度進樣1次，共進7個點。以目標化合物的質量濃度（X，mg／L）為橫坐標、定量離子峰面積（Y）為縱坐標進行性回歸，并計算相關系數（r）。結果見表1。

表1 線性關系考察、檢測限、定量限試驗結果Tab.1 Results of linear relation test，LOD and LOQ

檢測限和定量限確定：將不同質量濃度的對照品標準溶液注入GC－MS儀分析，以信噪比（S／N）為3時對應的質量濃度為檢測限，S／N為10時對應的質量濃度為定量限。結果見表1。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣6次。結果乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇的RSD分別為3.35%，3.43%，4.02%，2.85%，2.19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取2.2項下對照品加供試品溶液6份，分別注入GC－MS儀測定。結果乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇的RSD分別為3.46%，4.97%，4.66%，2.17%，0.55%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取2.2項下對照品加供試品溶液，分別于0，2，5，8，16，24 h時注入GC－MS儀測定。結果對照品加供試品溶液冷藏放置24 h內無其他雜質峰生成，乙醛、苯、乙縮醛的RSD均小于6%（n＝6），甲醇、4－甲基－2－戊醇的RSD均小于3%（n＝6），表明對照品加供試品溶液在24 h內穩定性較好。

加樣回收試驗：取已知各化合物含量的回收乙醇，加入2.2項下混合對照品溶液，各化合物均平行6份，分別注入GC－MS儀測定，計算回收率。結果乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇的平均回收率分別為89.56%，94.71%，94.85%，95.20%，91.41%，RSD分別為4.25%，5.08%，4.45%，2.18%，0.76%（n＝6）。

2.4 樣品含量測定

取樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定各雜質的含量。結果見表2。

表2 回收乙醇樣品中各揮發性雜質含量測定結果（%）Tab.2 Determination of volatile impurities in recyeled ethanol samples（%）

3 討論

由表2可知，回收乙醇中未檢出苯和4－甲基－2－戊醇；檢出乙醛、乙縮醛和甲醇，且隨回收乙醇使用次數的增加而增加，呈富集趨勢。循環使用超過200次的回收乙醇中乙醛、乙縮醛、甲醇均已超過藥典對藥品溶劑殘留限度的規定，不符合藥品質量要求，可能會給藥品質量造成風險。

本研究采用GC－MS法分析，發現除甲醇、乙醛、乙縮醛、苯、4－甲基－2－戊醇5種揮發性雜質外，還有其他多種揮發性雜質。揮發性雜質種類多少和含量高低除與藥材直接相關外，也受生產過程中提取時間、提取溫度、回收溫度等環節影響。因此，回收乙醇中揮發性雜質的種類及含量復雜多變，具有不確定性。為確保藥品質量，應制訂回收乙醇的使用周期或循環使用次數。可先暫定一個使用周期或循環使用次數，期間多次檢測揮發性雜質，收集和積累數據，分析回收乙醇中揮發性雜質的含量和變化趨勢，并結合揮發性雜質在產品中的殘留情況，綜合考慮并最終確定該品種回收乙醇的使用周期或循環使用次數。

方法學考察結果表明，所建立方法的回收率、精密度、重復性試驗結果均符合2020年版《中國藥典(四部)》[13]分析方法驗證指導原則中相關規定，能確?；厥找掖挤治鼋Y果的準確性與客觀性。因本次提供的樣本及測定雜質種類有限，不能全面分析葛根和丹參提取回收乙醇中揮發性雜質的含量和變化趨勢，但對藥品生產中類似回收乙醇的使用具有指導意義。