高效液相色譜法同時測定黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量

王云龍，劉春生，陳立柱，房 岐

（1.黑龍江省雞西市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江 雞西158100；2.北京中醫藥大學中藥學院，北京100102）

黃芩為大宗藥材，源于唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，用于治療各種熱證和濕證[1]，采收時僅保留地下主根作為藥用部位，地上部分莖、葉、花往往當作廢棄物處理，造成大量資源浪費。野黃芩苷是黃芩地上部分的主要成分[2－3]，具有抗腫瘤[4]、神經保護[5]、抗炎[6－7]等藥理作用，目前尚無同時測定黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量的研究。本研究中建立了同時測定黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量的高效液相色譜法，為其質量標準的制訂和進一步開發利用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC2010 A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；XPE205型電子天平（德國Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；XM－300UVF型智能靜音超聲波清洗機（小美超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

野黃芩苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為Y24F11Y16967，純度為98.0%）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；黃芩莖、葉、花3批樣品均采自黑龍江省雞西市黃芩栽培基地，采集時根據種植面積平均分為3個區域，每個區域隨機采取2株，共6株。樣品采集后，每株分別摘取葉和花，除去雜質，干燥，得干燥葉和花；莖切段，干燥，得干燥莖。所得樣品經雞西市食品藥品檢驗檢測中心楊立志主任藥師鑒定為黃芩的干燥莖、葉和花。樣品來源及相關信息見表1。

表1 樣品來源及相關信息Tab.1 Sources and related information of the samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）－0.4 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min時35%A，15～25 min時35%A～80%A，25～32 min時80%A～35%A，32～35 min時35%A）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：335 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取野黃芩苷對照品24.88 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，即得質量濃度為243.82 μg／mL的對照品貯備液，精密吸取4 mL，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，混勻，即得質量濃度為97.53 μg／mL的對照品溶液。分別取3號樣品的莖、葉、花，研成細粉，過4號篩，取莖粉末0.50 g、葉粉末0.13 g、花粉末0.25 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，密塞，靜置30 min，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。取缺黃芩莖、葉、花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照藥材溶液各適量，按2.1項下色譜條進樣測定。結果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰出現，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.scutellarinA.Test solution（stem）B.Test solution（leaf）C.Test solution（flower）D.Reference solution E.Negative reference medicinal material solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.2項下對照品貯備液1，2，4，6，8，10 mL，分別置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻，得系列質量濃度的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、對照品溶液質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝25 881X＋93 582(r＝0.999 9，n＝6）。結果表明，野黃芩苷質量濃度在24.38～243.80 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取黃芩葉(3號樣品)，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次。結果野黃芩苷峰面積的RSD為0.31%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取黃芩葉（3號樣品）0.13 g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果野黃芩苷含量的RSD為1.53%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取黃芩葉（3號樣品），依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24，48 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。結果野黃芩苷峰面積的RSD為0.92%（n＝7），表明供試品溶液在48 h內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的黃芩葉（3號樣品）粉末65 mg，精密稱定，共6份，分別置50 mL容量瓶中，精密加入2.2項下對照品貯備液10 mL，用70%乙醇定容，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 黃芩葉中野黃芩苷加樣回收試驗結果(n＝6)Tab.2 Results of the recovery test of scutellarin in the leaves of Scutellaria baicalensis(n＝6)

2.4 樣品含量測定

分別取3批黃芩莖、葉、花，各3份，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算野黃芩苷的含量，結果見表3。可見，黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量由高至低依次為葉、花、莖，葉中野黃芩苷的含量為莖或花的2～3倍。3批樣品中野黃芩苷含量差異不大，表明生長年限對黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量的影響不顯著。

表3黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量測定結果（%，n＝3）Tab.3 Content determination of scutellarin in the stems，leaves and flowers of Scutellaria baicalensis（%，n＝3）

3 討論

在前期試驗中發現，采用高效液相色譜法測定時，黃芩莖、葉、花中野黃芩苷色譜峰的信號較強，故選擇野黃芩苷為檢測指標。考察了不同提取方法（70%乙醇超聲提取、70%乙醇回流提取、甲醇超聲提取、甲醇回流提取）對含量測定結果的影響，結果以70%乙醇為提取溶劑時，先靜置30 min，再超聲處理30 min，黃芩莖、葉、花中野黃芩苷的含量最高，考慮超聲提取法簡便，故選擇70%乙醇超聲提取。通過掃描紫外光譜發現，在335 nm波長下有最大吸收，故選擇335 nm為檢測波長。

前期試驗中發現，不同樣品黃芩葉含量差異較大，考慮其化學成分可能受生長時間和不同生長部位等因素影響，故僅選擇黃芩葉樣品進行方法學考察。黃酮類化合物多顯弱酸性，易解離，影響分離效果，采用離子抑制色譜法加入一定量磷酸，通過梯度洗脫，各色譜峰分離較好。

測定樣品含量時發現，葉中野黃芩苷的含量為莖或花的2～3倍，提示今后制訂黃芩莖、葉、花的質量標準時，應充分考慮莖、葉、花的質量比例。生長年限對黃芩莖、葉、花野黃芩苷含量的影響不顯著，其原因可能與每年秋季對莖、葉、花割秧或焚燒處理使次年發新枝葉有關。

綜上所述，本方法操作簡便，專屬性強，準確度高，重復性好，可用于黃芩莖、葉、花中野黃芩苷的含量測定，可為今后黃芩地上部分質量標準的制訂和進一步開發利用提供依據。