超高效液相色譜法同時測定頸舒顆粒中4種皂苷類成分含量

李天佑，何 羽

（貴州省畢節市市場監督管理局檢驗檢測中心，貴州 畢節551700）

頸舒顆粒由三七、川芎、當歸、紅花、肉桂、天麻、人工牛黃7味中藥組方[1]，具有活血化瘀、溫經通竅止痛功效，治療頸椎病效果較好[2－4]。方中三七為君藥，功能散瘀止血、消腫定痛，用于治療出血、瘀滯腫痛、跌打損傷、胸腹刺痛等癥。2015年版《中國藥典（一部）》收載的頸舒顆粒[1]，含量測定項下僅對三七中人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1成分進行指標控制。超高效液相色譜（UPLC）法靈敏度高，分離效果好，檢測快速，可快捷、全面控制頸舒顆粒中三七的質量。本研究中采用UPLC法同時測定頸舒顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量[5－9]，可為該制劑的檢測、開發及質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY Classs型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；PS－G60A型超聲波清洗機（東莞市潔康超聲波設備有限公司，功率為360 W，頻率為40 kHz）；ATSmol 1850C型超純水機(天津市泰斯特儀器有限公司)；MSE3.6P－OCE－DM型電子天平(賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為百萬分之一)；AY120型電子天平(日本島津公司，精度為萬分之一)。

1.2 試藥

頸舒顆粒(國藥集團精方＜安徽＞藥業股份有限公司，批號分別為200212，200403，191206)；三七皂苷R1對照品（批號為110745－201921，純度為93.1%），人參皂苷Rb1對照品（批號為110704－201827，純度為93.1%），人 參 皂 苷Rg1對 照 品（批 號 為110703－201933，純度為93.4%），人參皂苷Re對照品（批號為110754－201827，純度為93.4%），均購于中國食品藥品檢定研究院；肉桂(批號為170501)，當歸(批號為190403)，紅花(批號為190701)，天麻(批號為180601)，川芎(批號為190401)，均購于貴州達靈藥業有限公司；人工牛黃（四川菲德力制藥有限公司，批號為170101）；乙醚、甲醇為分析純，乙腈為色譜純，均購于美國Tedia試劑公司；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersBEHC18柱（50mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.6 mL／min；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃；進樣量：1 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase

2.2 溶液制備

分別取三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Re對照品2.281，2.737，4.103，1.220 mg，精密稱定，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品（批號為200212）1.0 g，混勻，研細，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，水浴微沸回流提取1 h，濾過，濾紙及藥渣揮干后置同一具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，取甲醇20 mL，分2次洗滌濾渣，濾液置同一蒸發皿中，蒸干，加水20 mL使殘渣溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取肉桂、當歸、紅花、天麻、川芎、人工牛黃，按頸舒顆粒處方及制備工藝煎煮、濃縮制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、空白溶劑(甲醇)及陰性對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件分別進樣分析，色譜圖見圖1。結果供試品溶液4個主成分色譜峰與混合對照品溶液的4個主成分色譜峰保留時間一致，且在10 min內完全分離，分離度均大于1.5，陰性對照無干擾。

圖1 超高效液相色譜圖1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Re 4.ginsenoside Rb1A.Blank solvent（methanol）B.Mixed reference solution C.Negative reference solution D.Test solutionFig.1 UPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液0.1，0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、各化學成分含量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸。結果見表2。

表2 4種化學成分線性關系考察結果(n＝7)Tab.2 Results of linear relation test of four chemical constituents（n＝7）

精密度試驗：精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定6次。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re峰面積的RSD分別為0.29%，0.63%，0.12%，0.83%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密量取2.2項下供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0，4，6，8，12，16，24 h時進樣測定。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參 皂 苷Re峰 面 積 的RSD分 別 為1.08%，1.44%，0.96%，1.87%（n＝7），表明供試品溶液中4種皂苷成分在室溫下24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為200212）適量，精密稱定，共5份，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人 參 皂 苷Re峰 面 積 的RSD分 別 為0.34%，0.41%，0.19%，0.84%（n＝5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為200212）1.0 g，精密稱定，共6份，加入混合對照品溶液（三七皂苷R10.406 mg／mL、人參皂苷Rg10.907 mg／mL、人參皂苷Re 0.229 mg／mL、人參皂苷Rb10.466 mg／mL）3 mL，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表3。

表3 頸舒顆粒中4種皂苷成分的加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery test of four saponins in Jingshu Granules（n＝6）

2.4 高效液相色譜(HPLC)法比較

取2.2項下混合對照品溶液和供試品溶液，按頸舒顆粒含量測定三七項下的色譜條件[1]進樣分析。色譜柱采用CAPCELL PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，3 μm）。結果供試品溶液中4個主成分色譜峰與混合對照品溶液中4個主成分色譜峰保留時間一致，且在70 min內完全分離，分離度均大于1.5。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖（203 nm）1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Re 4.ginsenoside Rb1A.Mixed reference solution B.Test solution Fig.2 HPLC chromatograms(203 nm)

2.5 樣品中皂苷類成分含量測定

取 樣 品3批(批 號 分 別 為200212，191206，200403)，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下和2.4項下色譜條件測定樣品中4種皂苷類成分的含量，再與2015年版《中國藥典（一部）》頸舒顆粒三七含量測定項下的色譜條件和供試品溶液前處理方法測定結果進行比較。結果見表4。

表4 3種方法測定頸舒顆粒中4種皂苷類成分的含量（mg）Tab.4 Content determination of four saponins in each bag of Jingshu Granules determined by three methods（mg）

3 討論

原標準中乙醚脫脂靜置12 h時間過長。參考文獻[10－16]，曾對比乙醚靜置、超聲和加熱回流脫脂后甲醇提取方法，綜合考慮采用甲醇超聲處理。結果人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的提取效率均高于2015年版《中國藥典（一部）》頸舒顆粒三七含量測定項下的樣品前處理方法。

用甲醇超聲提取后直接進樣分析，在三七皂苷R1峰處和人參皂苷Rb1峰處雜質峰太多，影響分離度。將甲醇提取液蒸干，加水溶解，再用水飽和正丁醇提取，蒸干，甲醇溶解后進樣分析。結果在三七皂苷R1峰處和人參皂苷Rb1峰處雜質峰均減少，達到完全分離（R＞1.5）。

HPLC法和UPLC法同時測定頸舒顆粒的含量，結果各成分測定值的RSD均小于1.5%，故可用UPLC法代替HPLC法測定頸舒顆粒中4種皂苷類成分的含量。

參考文獻[1]中的方法，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1完全分離至少需要70 min，采用UPLC法在10 min內就可同時完全分離人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re4種成分，比原標準增加2個皂苷類成分的質量控制，同時極大地縮短了分析時間，減少了試藥的用量。