陽光毛白楊帶芽莖段再生體系的構建

石進朝 陳博 陳蘭芬 李彥俠

摘要：以陽光毛白楊帶芽莖段為材料，探討適宜的外植體、消毒方法及6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和赤霉素（GA3）對增殖生長和吲哚乙酸（IBA）、NAA對生根的影響，并對適宜的瓶苗移栽生根長度、煉苗時期進行研究，構建陽光毛白楊帶芽莖段再生體系。結果表明：（1）適宜的外植體為嫩枝帶芽莖段及半木質化帶芽莖段，發芽率分別達86.7%、63.3%。（2）嫩枝帶芽莖段消毒方法是先用90%乙醇（C2H5OH）溶液消毒60 s，再用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液消毒 4 min;半木質化帶芽莖段消毒方法是先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min。（3）適宜的增殖培養基為MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L，適宜的生根培養基為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。（4）煉苗移栽時，適宜的瓶苗根長為1.5～3.5 cm，適宜的煉苗時期為每年的3月，能夠獲得87.50%的成活率。本再生體系為快速繁育優質陽光毛白楊苗木奠定了基礎。

關鍵詞：帶芽莖段;增殖;生根;成活率;陽光毛白楊

中圖分類號： S722.3+7 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0050-05

毛白楊（Populus tomentosa）是楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus L.）白楊派落葉大喬木，是我國北方特有的造林綠化樹種。陽光毛白楊是筆者于2015年在北京地區1株雄性毛白楊上發現的芽變體，它的特點是雄性不飛絮，新生葉在整個生長季節為金黃色，老葉漸變綠，為毛白楊的一個彩色變異體。我國北方地區鄉土彩色大喬木樹種不多，陽光毛白楊的誕生，為我國北方地區城鄉綠化，特別是治理飛絮、增彩延綠等提供了新樹種。陽光毛白楊扦插成活率低，繁殖系數不高，影響了它的推廣與應用。關于毛白楊組織培養快速繁殖，許多學者進行了相關研究，提高了毛白楊的繁殖系數[1-7]。如何在短期內繁殖出優質陽光毛白楊苗木，把這一鄉土彩色樹種早日應用到首都園林綠化中去，本研究于2019年2月至2020年8月對陽光毛白楊進行帶芽莖段再生體系構建的研究，建立陽光毛白楊快繁體系，以期為規模化繁育優質陽光毛白楊苗木奠定基礎。1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為一年生陽光毛白楊（Populus tomentosa Sunny）芽變枝條。試驗選取陽光毛白楊半木質化帶芽莖段、嫩枝帶芽莖段作為外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體采集與消毒

1.2.1.1 外植體的采集 嫩枝帶芽莖段的采集：參照花葉毛白楊外植體培養方法[8]。2019年2月18日從陽光毛白楊芽變枝條，采集芽體飽滿、未萌發，生長健壯的一年生枝條，剪成10～12 cm枝段，放入1 000 mL燒杯中水培，置于20～30 ℃有直射光的室內，當其芽萌發長度達到4～5 cm，長出4～6張葉片時，選取其嫩枝帶芽莖段作為外植體材料。

半木質化帶芽莖段的采集：2019年5月16日在室外露地選取當年生陽光毛白楊枝條上端半木質化帶芽莖段作為外植體材料。

1.2.1.2 外植體的消毒 把采集到的陽光毛白楊外植體先用毛刷蘸取少許洗滌靈液，反復輕輕刷洗 5～6次，用蒸餾水充分沖洗干凈后，把半木質化枝條及嫩枝剪切成長為1.0～1.2 cm的帶芽小段，再用蒸餾水沖洗30 min，在洗滌靈溶液中振蕩15 min。先用90%乙醇（C2H5OH）溶液消毒60 s，再用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液分別消毒3、4、5、6、7 min，共計設置5個處理。每個處理30個樣品。清毒后蒸餾水沖洗6～8次，再用無菌濾紙吸干水分后備用。

1.2.2 初代培養 把經過消毒的陽光毛白楊外植體接種在MS培養基上進行初代培養（圖1-a、圖1-b），培養室溫度為（25±1） ℃，光照度為 2 000～3 000 lx，光照時間為12 h/d。在超凈工作臺上將無菌外植體接種于100 mL廣口瓶中，用封口膜封口。

1.2.3 增殖生長中6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）及赤霉素（GA3）適宜添加濃度的確定 當初代苗高度達到6～8 cm，接近瓶蓋時，以MS為繼代增殖基本培養基，在其中加入不同濃度的6-BA（A）、NAA（B）和GA3（C），設置為3個因素，每個因素3個水平，不考慮交互作用，采用L9（34）均勻水平正交試驗，共計9個處理，方案設計見表1。

將初代苗切成長為2 cm的帶芽小段進行增殖培養，每個處理樣品30個，繼代25 d后，統計增殖倍數、高度（H）為2.5 cm及以上的增殖苗占比等數據，記錄生長勢。確定適宜的6-BA、NAA及GA3添加濃度。

1.2.4 生根培養基中，吲哚乙酸（IBA）及NAA適宜的添加濃度的確定 參照變葉金銀木的方法[9]。當繼代苗生長到高5～6 cm時，以1/2 MS為生根基本培養基，在其中加入不同濃度的IBA及NAA，每個處理30個樣品，切取繼代苗帶芽莖段進行生根培養，25 d 后調查各處理瓶苗的生根數量、根長、根生長勢，依此確定添加IBA及NAA的適宜濃度。

1.3 瓶苗生根長度與移栽時期試驗

在生根培養25 d后，當陽光毛白楊瓶苗生長高度達5～6 cm，有4～6張正常葉片時，將生長健壯的瓶苗打開瓶口3 d，進行不同生根長度（≤1.5 cm、1.5～3.5 cm、≥3.5 cm）及一年中不同時期（3月12日、7月21日、9月15日及次年的1月20日）的移栽試驗。依據移植成活率，確定適宜的移植瓶苗生根長度及一年中適宜的移植時期。

1.4 數據處理

應用SPSS 19.0數據分析軟件，對本試驗中的數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對外植體發芽率的影響

2種陽光毛白楊的外植體先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒處理不同時間。由表2可知，2種陽光毛白楊外植體經不同時間0.1% HgCl2溶液消毒處理后，發芽率差異明顯。半木質化帶芽莖段的發芽率最高（63.3%）時的消毒時間為 5 min，用0.1% HgCl2溶液消毒7 min時，發芽率為0。可見，半木質化帶芽莖段適宜的消毒方法為先用90% C2H5OH溶液處理60 s，再用0.1% HgCl2溶液處理5 min。

嫩枝帶芽莖段作為外植體材料經過3～7 min 0.1% HgCl2溶液消毒處理后，最大發芽率為86.7%，其對應的0.1% HgCl2溶液消毒時間為 4 min;隨著消毒時間的增加，發芽率明顯下降，消毒6～7 min，發芽率降低為0。可見，嫩枝帶芽莖段為外植體時，適宜的消毒方法為先用90% C2H5OH溶液處理60 s，再用0.1% HgCl2溶液處理4 min。

2.2 不同濃度的6-BA、NAA及GA3對陽光毛白楊瓶苗增殖生長的影響

在MS基本培養基中分別加入不同濃度的6-BA、NAA和GA3，設置為3個因素，每個因素3個水平，采用L9（34）的均勻水平正交試驗，共計9個處理。選擇生長健壯，高度≥2.5 cm的初代苗，將其剪切成1.0 cm的帶芽莖段，進行接種，25 d后平均增殖倍數、增殖苗高度（H）≥2.5 cm百分比及生長勢見表3，方差分析結果見表4、表5。

由表3可知，在MS基本培養基中分別加入不同濃度的6-BA、NAA、GA3，培養25 d后均能誘導出繼代增殖苗，增殖倍數為2.39～4.62，增殖苗高度（H）≥2.5 cm的百分比為11.3%～86.3%。結合表4、表5中方差分析結果可以看出，6-BA濃度對陽光毛白楊瓶苗增殖倍數和瓶苗高度均有極顯著影響，而NAA和GA3的濃度變化對其影響不顯著。較高濃度（0.3 mg/L）的6-BA對陽光毛白楊瓶苗的增殖生長有明顯的促進作用，表現為增殖倍數高，苗木生長健壯（圖2）;隨著6-BA濃度的增加，叢生芽顏色有發黃跡象，玻璃化明顯增多，長勢變弱。依據增殖培養25 d后的平均增殖倍數、增殖苗高度（H）≥2.5 cm的百分比及增殖苗生長勢3項指標綜合來看，陽光毛白楊瓶苗增殖生長時，適宜的6-BA、NAA及GA3濃度分別為0.3、0.05、0.5 mg/L。即陽光毛白楊瓶苗增殖生長適宜的培養基為MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L。

2.3 不同濃度IBA及NAA對瓶苗生根的影響

以1/2 MS為陽光毛白楊瓶苗生根基本培養基，在其中添加不同濃度的IBA（0.3、0.5、0.8、1.0 mg/L）及NAA（0.5、0.8、1.0、1.5 mg/L）。當繼代苗生長高度為5～6 cm，接近瓶蓋時，將其剪切成1.0 cm的帶芽莖段接種，進行生根培養，25 d后調查瓶苗單株平均生根數量、生根長度、根生長勢，結果見表6。由表6可知，不同濃度IBA對陽光毛白楊繼代苗生根長度影響差異顯著，在IBA濃度為 0.3～1.0 mg/L范圍內，單株平均生根數量呈正態分布，在0.5 mg/L時達最大值，為8條;平均生根長度與IBA濃度無明顯相關性。根生長勢表現為在IBA濃度為1.0 mg/L時，基部有愈傷組織形成，根少而短;IBA濃度為 0.8 mg/L 時，瓶苗生根少，單株平均3條，根細長，長勢弱;在IBA濃度為0.5 mg/L時，第20天開始生根，生根快，數量多，達8條，根生長勢健壯。IBA濃度為0.3 mg/L時，生根慢，數量少，為2條，根細長。

當NAA濃度為1.0、1.5 mg/L時，陽光毛白楊繼代苗有少量生根，單株平均生根數量分別為2、3條，平均生根長度小，根少而細長。顯示出IBA比NAA更有利于陽光毛白楊瓶苗生根，有促進瓶苗生根的作用。

從瓶苗的平均生根數、根長、根生長勢3項指標綜合來看，陽光毛白楊瓶苗生根時，適宜的IBA添加濃度為0.5 mg/L，即適宜的生根培養基為 1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。

2.4 影響陽光毛白楊瓶苗移栽成活率的因素

植物瓶生根苗煉苗移栽成活率受多種因素影響，如開瓶煉苗時間、生根苗地徑[8-9]、栽培基質及光照、溫濕度等環境控制因子直接決定著煉苗成活率。

2.4.1 不同瓶苗生根長度對生根瓶苗移栽成活率的影響 瓶苗的生根長度及根的健壯程度與移栽成活率密切相關。把經過開口3 d的陽光毛白楊生根瓶苗，選擇基徑≥0.8 mm的苗，洗去培養基，按不同生根長度（≤1.5 cm、1.5～3.5 cm、≥3.5 cm），在智能溫室內移栽到穴盤中，以蛭石與珍珠巖混合物（體積比為3 ∶ 1）作基質。環境控制為初期保持70%～80%的相對空氣濕度，溫度控制在20～30 ℃，適當遮陰，每隔10 d噴1次80%多菌靈800倍液，連噴3次，30 d后調查成活株樹、苗木生長勢，統計成活率，結果見表7。

苗木根系過長，如根長≥3.5 cm時進行移栽，須要對苗木進行修根處理，會造成傷根現象;苗木根系過短，如根長≤1.5 cm時進行移栽，由于苗木根系幼嫩，移栽時也會成傷根，苗木根系過長或過短，都會影響移栽成活率。由表7可知，不同生根長度的陽光毛白楊生根瓶苗移栽到穴盤中的成活率呈現正態分布，根長為1.5～3.5 cm時成活率最高，為87.50%，根長≥3.5 cm的成活率次之（62.22%），根長≤1.5 cm時，成活率最低（45.83%）。可見，在進行陽光毛白楊生根瓶苗移栽時，適宜的瓶苗根長為1.5～3.5 cm。

2.4.2 不同移栽煉苗時期對生根瓶苗移栽成活率的影響 分別在一年中的3月12日、7月21日、9月15日及次年的1月20日，把已打開瓶口3 d，選用基徑≥0.8 mm、根長1.5～3.5 cm的陽光毛白楊生根瓶苗，移栽到裝有蛭石的穴盤中，環境控制同“2.4.1”節，成活率見表8。

一年中不同煉苗時期對苗木成活率的影響，實質上是溫度、濕度等環境條件對苗木成活率的影響。由表8可知，在7月21日移栽煉苗時，成活率較低（48.61%），這時候氣溫高，濕度大，苗木容易染病，成活率低;在1月20日移栽煉苗時，這時候是一年中最冷的時期，成活率最低（38.89%）;在3月12日、9月15日，這時候室外溫濕度適宜，移栽成活率較高（圖3），分別為87.50%、81.94%。在進行陽光毛白楊生根瓶苗移栽時，一年中適宜的煉苗時間為3月和9月。3月煉苗時，培養30 d后，生根苗高度為15～20 cm（圖4），即可移栽到大田繼續培養成大苗，不需要在溫室中越冬;9月煉苗時，需要在溫室中越冬不能露地栽培，從節約成本方面考慮，陽光毛白楊適宜的煉苗移栽時期為3月。

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 提高陽光毛白楊外植體誘導率的途徑 陽光毛白楊腋芽密被白色絨毛，消毒不易，易出現消毒過度或消毒不徹底等現象，尤其是從室外采集的半木質化帶芽莖段，消毒滅菌困難，要么全部殺死，要么污染嚴重。本試驗選擇室內水培陽光毛白楊萌枝上嫩枝帶芽莖段作為外植體，與變葉金銀木組織培養外植體選擇一樣[9]，獲得了較高的誘導成活率，探索出了陽光毛白楊嫩枝帶芽莖段及半木質化帶芽莖段適宜的消毒滅菌方法，為規模化快速繁育優質陽光毛白楊苗木奠定了基礎。

3.1.2 激素對陽光毛白楊組培體系構建的影響 生長調節劑是組織培養中誘導植物形態建成的主要因素[10-11]，細胞分裂素在植物增殖中起著重要的作用，6-BA常與其他調節劑組合誘導不定芽產生和促進植物增殖[12]。本試驗結果顯示，增殖率在一定的 6-BA濃度范圍內呈上升趨勢，較低濃度的 6-BA 促進莖段不定芽的增殖，而達到最佳的濃度后，再增加 6-BA 的濃度則表現為抑制不定芽的誘導，同時外植體玻璃化的趨勢加重。所以在實際操作中6-BA濃度不宜過高，否則會抑制外植體的整體生長。IBA及NAA在生根誘導中使用廣泛，通常較低濃度的生長素有利于外植體生根，濃度過高會產生抑制效果，本研究得出了相似的結果。NAA除了促進生根外還能促進發芽，而IBA誘導生根的作用較強且發根數量較大，根系較粗壯。

3.2 結論

嫩枝帶芽莖段是陽光毛白楊再生體系適宜的外植體材料，發芽率達86.7%。半木質化帶芽莖段也可作為陽光毛白楊外植體材料，誘導出腋芽的發生，發芽率為63.3%。嫩枝帶芽莖段適宜的消毒方法為先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒 4 min;半木質化帶芽莖段適宜的消毒方法為先用90%C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min。陽光毛白楊再生體系適宜的增殖生長培養基為MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L，適宜的生根培養基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L。生根苗移栽煉苗時，適宜的生根瓶苗的根長為1.5～3.5 cm，適宜的煉苗時期為每年的3月，能夠獲得87.50%的成活率。

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