綠蘿離體快繁體系的建立及其甲基磺酸乙酯誘變條件

陸玉建 張永磊

摘要：為了探究綠蘿離體再生的最適條件和甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulphonate，簡稱EMS）誘變綠蘿的合適劑量，首先以綠蘿葉柄為材料進行離體培養。結果表明，用葉柄誘導愈傷組織的最適培養基為MS+0.5 mg/L噻苯隆（TDZ）+0.3 mg/L萘乙酸（NAA），不定芽分化最適培養基為MS+3.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.5 mg/L NAA，生根最適培養基為1/2MS+0.05 mg/L NAA。然后設置不同劑量的EMS誘變綠蘿葉柄愈傷組織，并對其存活率、致死率進行統計，初步獲得EMS誘變綠蘿愈傷組織的半致死條件：0.6%EMS誘變處理4 h或0.8%EMS誘變處理2 h。研究結果對于今后利用EMS誘變綠蘿愈傷組織、篩選性狀優良的突變體具有重要意義。

關鍵詞：綠蘿;葉柄;愈傷組織;甲基磺酸乙酯（EMS）;誘變

中圖分類號： S687.904+.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0055-06

綠蘿（Eipremnum aureum）為天南星科綠蘿屬多年藤本植物，其形態優美，具有較高的觀賞價值[1]。綠蘿吸收室內甲醛的能力較強，深受人們喜愛[2]。此外，綠蘿對鉛、鎘、鉻等重金屬具有一定的富集能力，并能夠通過特定機制將根部積累的重金屬運輸到不同部位，因此在凈化低濃度重金屬污染的水體方面效果良好[3-5]。目前綠蘿多采用壓條和扦插的方式進行繁殖，繁殖系數低、速度慢、遺傳穩定性差，無法在短期內得到大量優質的植株[6]。組織培養是實現綠蘿快速繁殖的有效途徑，近年來的研究主要以綠蘿莖段為外植體，通過愈傷組織分化或直接誘導生芽的方式獲得綠蘿再生植株[7-8]。由于外植體選材的局限性和植物生長調節劑對綠蘿離體再生影響的復雜性，現階段還存在離體再生頻率低的缺點。此外，綠蘿還存在種質資源單一的不足。化學誘變育種是豐富植物種質資源的有效途徑，化學誘變劑甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulphonate，簡稱EMS）因其誘變頻率高、成本低廉、操作簡便，已成為獲得突變體、創制新種質的有效手段[9-11]。鑒于此，為豐富綠蘿種質資源、培育出觀賞價值更高和污染清除效果更好的綠蘿新品系，本研究在建立綠蘿高頻離體再生體系的基礎上，通過EMS對綠蘿愈傷組織進行誘變，探究EMS誘變綠蘿愈傷組織的最佳劑量，研究結果對于下一步通過化學誘變、篩選性狀優良的綠蘿突變體具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠蘿于2019年春購自山東省濱州市花卉市場，在濱州學院生物與環境工程學院人工氣候室內進行培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制 根據前期試驗結果，重新優化培養基組合并配制培養基，所有培養基均添加3%蔗糖和1%瓊脂。綠蘿葉柄愈傷組織誘導培養基C1～C5的配方如下：（1）C1，MS+0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.3 mg/L萘乙酸（NAA）+1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）;（2）C2，MS+0.2 mg/L噻苯隆（TDZ）+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA;（3）C3，MS+0.2 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L激動素（KT）;（4）C4，MS+0.5 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D;（5）C5，MS+0.5 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA。綠蘿帶節莖段培養和不定芽分化培養基B1～B5的配方如下：（1）B1，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA;（2）B2，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA;（3）B3，MS+2.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA;（4）B4，MS+3.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA;（5）B5，MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。綠蘿不定芽誘導生根培養基R1～R5的配方如下：（1）R1，1/2MS+0.03 mg/L NAA;（2）R2，1/2MS+0.05 mg/L NAA;（3）R3，1/2MS+0.1 mg/L NAA;（4）R4，1/2MS+0.2 mg/L NAA;（5）R5，1/2MS+0.5 mg/L NAA。

1.2.2 材料消毒及無菌苗的獲得 剪取綠蘿帶芽莖段，分別用自來水沖洗30 min、蒸餾水沖洗2次、70%乙醇消毒30 s、0.1%氯化汞處理15 min、無菌水沖洗5～6次后接種于B1～B5培養基上，2周后統計莖段芽的增殖系數。將莖段產生的芽切下，轉入新鮮培養基中培養30 d，獲得綠蘿無菌苗，相關計算公式：

芽的增殖系數=產生的芽數/接種的莖段數。

1.2.3 葉柄愈傷組織的誘導 選取綠蘿無菌苗的葉柄接種到愈傷組織誘導培養基中進行培養，30 d后按下式統計愈傷組織誘導率：

愈傷組織誘導率=（產生愈傷組織的外植體數/接種數）×100%。

1.2.4 不定芽的分化 先將綠蘿葉柄誘導產生的愈傷組織進行繼代培養，然后轉入分化培養基中進行不定芽誘導，30 d后進行不定芽分化率的統計，計算公式：

不定芽分化率=（產生不定芽的外植體數/接種數）×100%。

1.2.5 不定芽的生根 選取綠蘿不定芽接種于生根培養基上進行生根誘導，30 d后按下式統計不定芽的生根率、根增殖系數：

生根率=（產生不定根的外植體數/接種數）×100%;

根增殖系數=產生的根數/接種數。

1.2.6 綠蘿愈傷組織的EMS誘變 用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值為5.8）分別配制0、0.4%、0.6%、0.8%EMS溶液，過濾除菌后備用。選取生長良好的綠蘿愈傷組織，放入上述不同濃度的EMS溶液中，分別于100 r/min振蕩培養2、4、6 h。取出綠蘿愈傷組織，用無菌水反復沖洗后轉入愈傷組織誘導培養基中進行繼代培養。

1.2.7 EMS誘變半致死劑量的確定 得到用EMS誘變處理的綠蘿愈傷組織后，繼代培養30 d并觀察統計，根據愈傷組織的褐化程度和生長狀態，統計存活率、致死率。將致死率接近50%時的EMS濃度和誘變時間作為綠蘿愈傷組織EMS誘變的合適劑量，用于突變體的誘導，相關計算公式：

存活率=（外植體的存活數/接種數）×100%;

致死率=（外植體的致死數/接種數）×100%。

1.2.8 數據分析 用Excel 2007和SPSS 17軟件進行數據統計，通過Duncans多重比較進行樣本間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 帶節莖段芽的誘導

將綠蘿帶節莖段接種于B1～B5培養基上，接種后1周左右，莖段開始抽芽，接種后2周左右莖段長出明顯的芽，然后進行芽的增殖系數統計。由圖 1-A、圖2-A、圖2-B可以看出，在這5種培養基中，莖段均可產生芽，且芽生長迅速，但數量較少。其中B3培養基中芽的增殖系數最高，達到1.54，B4培養基中芽的增殖系數最低，僅有1.05，其他3種培養基中芽的增殖系數介于上述2個數據之間。根據芽的增殖系數和芽的生長情況，初步確定B3培養基作為帶節莖段芽誘導的培養基。將芽切下后轉入B3培養基中繼續培養30 d，芽不斷生長發育，獲得無菌苗（圖2-C、圖2-D）。

2.2 葉柄愈傷組織的誘導

選取葉柄為材料進行愈傷組織誘導。由圖1-B可以看出，葉柄在這5種培養基中均可產生愈傷組織，但誘導率存在明顯差異，其中誘導效果最好的為C5培養基，愈傷組織誘導率約為98%，且產生愈傷組織的量較多，生長比較旺盛（圖2-E、圖2-F）;其次是C4培養基的誘導效果較好，愈傷組織誘導率接近C5培養基;誘導效果最差的為C1培養基，愈傷組織誘導率不到10%，葉柄不僅極易褐化，而且愈傷組織產生的量很少。C2、C3培養基的誘導效果一般，愈傷組織誘導率約為30%。根據葉柄愈傷組織誘導率及其生長情況，初步確定C5培養基作為葉柄愈傷組織誘導的最適培養基。將愈傷組織轉接入C5培養基中進行繼代培養，發現2周后愈傷組織的量明顯增加（圖2-G）。連續繼代培養2次后，愈傷組織繼續增殖，并有少量芽點產生（圖2-H）。

2.3 愈傷組織不定芽的誘導

將葉柄誘導產生的愈傷組織繼代培養后轉入不定芽誘導培養基B1～B5中。由圖1-C可以看出，在這5種培養基中，葉柄愈傷組織均可分化產生不定芽。在B5培養基中，愈傷組織分化率接近100%，不定芽數量較多，生長較好。其次為B2培養基，不定芽分化率超過95%。分化效果較差的為B1培養基，芽的分化率只有30%左右，且芽的數量相對較少。B3、B4培養基的效果一般，不定芽分化率為50%～60%。根據不定芽分化率及其生長情況，初步確定B5培養基作為綠蘿不定芽分化最適培養基。在B5培養基中，愈傷組織培養1周即可分化出少量不定芽（圖2-I），3周后不定芽明顯繼續增多、增大（圖2-J）。隨著培養時間的延長，愈傷組織繼續分化培養，培養30 d后葉柄兩端產生較多不定芽（圖2-K）。將帶芽葉柄轉入B5培養基中繼續培養，發現不定芽生長比較旺盛（圖2-L）。切取葉柄兩端的不定芽進行增殖培養，發現不定芽數量繼續增多（圖2-M、圖2-N）。

2.4 不定芽生根誘導

不定芽生根培養30 d后進行數據統計，由圖 1-D 可以看出，在這5種培養基中，不定芽的基部均有根生成，且根的長勢較好，生根率十分接近，其中R2培養基的生根率達到98%，但根的增殖系數存在一定差別。在R2培養基中，不定芽的生根系數最高，約為5.3，且根數量較多、生長旺盛。在R5培養基中，不定芽的生根系數最低，約為2.7，且根數量少、生長較差。在其他3種培養基中，不定芽的生根系數介于上述2個數據之間。根據根的增殖系數和根的生長情況，初步確定R2培養基是不定芽誘導生根的最適培養基。選取健壯的不定芽接種于R2培養基中，培養30 d即可獲得試管苗（圖2-O、圖2-P）。

2.5 EMS處理對綠蘿愈傷組織生長的影響

選取生長良好的愈傷組織進行EMS誘變，培養30 d后進行觀察統計，試驗結果見圖3、圖4-A。

當磷酸緩沖液中不含EMS時，無論處理2、4 h還是 6 h，綠蘿愈傷組織均生長正常，葉柄呈現青綠色，幾乎沒有褐化，部分還生出芽點，存活率約為100%（圖3-A、圖3-E、圖3-I）。

用0.4%EMS誘變劑處理愈傷組織2 h時，愈傷組織生長基本正常，與對照沒有明顯區別，存活率接近100%（圖3-B）;用0.4% EMS誘變劑處理愈傷組織4 h時，愈傷組織輕微褐化，生長受到一定抑制，存活率約為62.5%（圖3-F）;用0.4% EMS誘變劑處理愈傷組織6 h時，愈傷組織褐化較深，生長受到明顯抑制，存活率為30%左右（圖3-J）。用0.6% EMS誘變劑處理愈傷組織2 h時，愈傷組織生長受到一定抑制，褐化比較明顯，存活率約為98%（圖3-C）;用0.6% EMS誘變劑處理愈傷組織4 h時，愈傷組織生長受到的抑制程度較大，葉柄、愈傷組織褐化程度較深，愈傷組織存活率為50%左右（圖3-G）;用0.6% EMS誘變劑處理愈傷組織6 h時，愈傷組織生長幾乎完全受到抑制，葉柄完全褐化，存活率不到3%（圖3-K）。用0.8% EMS誘變劑處理愈傷組織2 h時，愈傷組織生長受到明顯抑制，葉柄、愈傷組織褐化程度較深，愈傷組織的存活率接近52%（圖3-D）;0.8% EMS誘變劑處理愈傷組織4 h時，愈傷組織生長受到嚴重抑制，愈傷組織褐化嚴重（圖3-H）;0.8% EMS誘變劑處理愈傷組織6 h時，愈傷組織生長完全抑制，葉柄變黑，愈傷組織完全褐化，存活率為0（圖3-L）。

2.6 EMS半致死劑量的確定

由圖4-D可以看出，用EMS處理2 h時，0.4%、0.6% EMS處理組的愈傷組織致死率與對照相比沒有明顯區別，然而當EMS濃度提高到0.8%時，愈傷組織致死率接近50%;當EMS處理時間為4 h時，0.4%、0.6%、0.8% EMS處理愈傷組織的致死率分別為38%、50%、80%，與對照存在顯著性差異;當EMS處理時間為6 h時，0.4% EMS處理愈傷組織的致死率已經超過70%，0.6% EMS處理愈傷組織的致死率達到97%，0.8% EMS處理的愈傷組織完全褐化，無法正常生長，致死率為100%。上述統計結果表明，0.8% EMS處理2 h或0.6% EMS處理4 h時，愈傷組織致死率約為50%。由此可見，0.8% EMS處理2 h、0.6% EMS處理4 h這2種組合可作為半致死條件，用于綠蘿愈傷組織的EMS誘變處理。

3 結論與討論

3.1 綠蘿的離體快繁

本研究以綠蘿葉柄為外植體，當在MS培養基中添加0.5 mg/L TDZ、0.3 mg/L NAA時，愈傷組織誘導效果最佳，誘導率接近100%。張盛圣研究發現，以莖段為外植體時，綠蘿愈傷組織誘導的最適培養基為MS+2.0 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2，4-D[12]。葉柄和莖段愈傷組織誘導之間存在一定的差異，表明外植體的選擇和植物生長調節物質的種類都會對綠蘿愈傷組織的誘導產生影響。植物生長調節物質對外植體不定芽的誘導具有重要的調節作用。試驗結果表明，葉柄產生的愈傷組織在 MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA中的分化率接近100%，其芽分化明顯，數量較多，生長旺盛。這和張瑜等的研究結果有所不同，張瑜等以帶節莖段為外植體進行試驗發現，最佳不定芽誘導培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA[7]，這很可能是由外植體類型和誘導方式不同所造成的。崔小麗等經研究證實，綠蘿生根的最佳培養基為 1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA[13]。而本研究結果表明，在1/2MS+0.05 mg/L NAA培養基中，綠蘿不定芽的生根率達到98%，生根系數較高，根數量較多。由此可見，植物生長調節物質的種類和濃度對不定芽生根的影響明顯。本研究建立了綠蘿高頻離體再生體系，將為其工廠化繁殖種苗奠定基礎，也為誘導綠蘿突變體等研究提供了條件。

3.2 綠蘿的EMS誘變

將植物組織培養與誘變技術相結合的離體誘變技術，在選育性狀優良突變體的過程中，逐漸受到人們的關注[14]。EMS是目前應用較多且最為有效的一種化學誘變劑[15-16]。目前，尚無關于綠蘿誘變育種的相關報道。通過EMS誘變劑處理綠蘿愈傷組織，有助于擴大綠蘿變異譜，豐富種質資源，培育出觀賞價值更高和污染清除效果更好的綠蘿新品系。在綠蘿愈傷組織EMS誘變過程中，當誘變時間相同時，隨著EMS濃度的增加，葉柄褐化程度逐漸加深，愈傷組織生長所受的抑制程度逐漸加深，存活率逐漸降低。當EMS濃度相同時，誘變處理時間越長，愈傷組織褐化程度越深，受到的抑制程度越重，存活率越低。上述結果表明，綠蘿愈傷組織對于EMS處理表現出明顯的劑量效應和時間效應。通過分析綠蘿愈傷組織的存活情況可知，0.8% EMS處理2 h或0.6% EMS處理4 h時，綠蘿愈傷組織致死率接近50%，因此這2種組合可作為EMS誘變綠蘿愈傷組織的半致死條件，用于綠蘿愈傷組織的EMS誘變處理。以上研究結果對于篩選性狀優良的綠蘿突變體具有重要的意義。

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