江西省絲瓜果實腐爛病病原及寄主范圍研究

鄒芬 何烈干 賴金美 李湘民 黃瑞榮 馬輝剛

摘要：為明確江西省絲瓜果實腐爛病病原菌種類及病原菌寄主范圍，從江西省南昌市和贛州市絲瓜種植區采集具有典型癥狀的腐爛病病果并進行病原菌分離，采用形態學觀察、致病性測定和分子生物學技術對其種類進行鑒定，并接種7種作物幼苗以明確其寄主范圍。結果表明，從絲瓜爛果病病樣中共分離到2株菌株，分別命名為SG-1和 SG-2，2株菌株形態特征一致，菌落呈圓形，氣生菌絲發達，有膨大的孢子囊，孢子囊萌發有泡囊產生，有性生殖還可見雄器和藏卵器。在以ITS、Cox2、β-tubulin3個基因構建的系統發育樹中，菌株SG-1、SG-2和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）聚在同一個分支，結合上述結果，將此次采集的絲瓜果實腐爛病病原鑒定為瓜果腐霉。將該病原菌接種葫蘆科的黃瓜，茄科的辣椒、茄子，十字花科的白菜、西蘭花，錦葵科的秋葵等代表性作物幼苗，結果表明其還可以引起幼苗猝倒病。

關鍵詞：絲瓜果實腐爛病;病原鑒定;瓜果腐霉;寄主范圍;Cox2基因;β-tubulin基因

中圖分類號：S436.429 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0090-05

絲瓜（Luffa cylindrica）隸屬葫蘆科絲瓜屬，主要種植于熱帶和亞熱帶，如中國、泰國、印度、馬來西亞等[1]。絲瓜是我國常見的瓜類蔬菜之一，分為普通絲瓜和有棱絲瓜2個栽培種[2]，營養價值豐富，果肉中不僅富含蛋白質、維生素、鈣磷鐵等元素，還具有抗衰老和抗過敏等保健作用和藥用價值[3-4];成熟的絲瓜由于其發達的網狀纖維且天然易降解還可替代海綿作為一種環保的洗刷灶具[5]。絲瓜在江西省多個縣（市、區）均有種植，據調查，絲瓜約占江西省瓜類蔬菜資源總量的18.3%[6]。作者2019年7—8月到田間調查發現，有部分絲瓜發生爛果現象，對產量和品質造成了較大影響，由于尚不清楚各地區絲瓜果實腐爛病由何種病原菌引起，因此對病原菌進行系統分離鑒定，并明確其寄主范圍，對生產上防治該病害具有重要意義。關于枯萎病、炭疽病、病毒病、蔓枯病等絲瓜生產上常見病害的病原鑒定已有較多報道。彭家柱等根據形態學鑒定和ITS序列分析相結合的方法將絲瓜枯萎病病原鑒定為尖孢鐮刀菌[7];孫蕾對吉林省絲瓜、黃瓜、西瓜等11種葫蘆科作物炭疽病病原進行了鑒定，通過聯合ITS、CHS1和GAPDH多基因測序分析，確定絲瓜、黃瓜等的病原為圓刺盤孢（Colletotrichum orbiculare），西瓜炭疽病的病原有2種，分別為C. orbiculare和C. incanum，苦瓜炭疽病的病原為C. incanum，表明不同寄主病原不盡相同[8]。牛二波對山西省絲瓜病毒病病原檢測結果表明，絲瓜受小西葫蘆黃化葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）復合侵染[9]。目前對絲瓜果實病害病原鑒定的研究較少，對絲瓜果實腐爛病的研究主要見于常規發生和防治介紹，尚未發現對絲瓜果實腐爛病病原菌分子系統學方面的研究。本研究擬通過對病原菌進行形態學觀察、致病性測定，結合核糖體內轉錄間隔區（ITS）、細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ基因（Cox2）和β微管蛋白基因（β-tubulin）部分序列的多核苷酸序列系統學分析等方法，對引起江西省絲瓜果實腐爛病的病原菌進行鑒定，同時對該病原菌進行寄主范圍測定，以期為生產上該病害的防治及不同作物的選育種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別于2019年7—8月從江西省南昌市和贛州市采集絲瓜果實腐爛病典型病樣，帶回實驗室進行分離。絲瓜、黃瓜、番茄、茄子、白菜、西蘭花、秋葵種子購自當地種子市場。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L。V8培養基：罐裝V8汁330 mL、CaCO3 3.3 g，4層紗布過濾，按體積比1 ∶ 9加入純水進行稀釋，如配固體培養基再按1.5%加入瓊脂粉。

TaKaRa Taq，購自寶生物工程（大連）有限公司;DL2000 Marker，購自湖南擎科生物技術有限公司;PCR回收試劑盒，購自美國Axygen公司;其余試劑均為國產分析純。

MyCycler PCR儀，購自美國Bio-Rad公司;JC600電泳儀，購自北京君意東方電泳設備有限公司;Alpha 5500型凝膠掃描儀，購自美國Alpha Innotech公司;PGX-330A-3HM 型生化培養箱，購自寧波萊?？萍加邢薰?IX53顯微鏡，購自奧林巴斯（中國）有限公司。

1.2 病原菌的分離與純化

按常規組織分離法分離病原菌[10]。用無菌水沖洗具有典型絲瓜果實腐爛病癥狀的病果，于病健交界處切取5 mm×5 mm大小的組織塊，用70%乙醇浸泡消毒30～60 s，隨后用無菌水漂洗3次，置于含50 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL利福平的PDA平板上，置于溫度為25 ℃的生化培養箱中黑暗培養3 d，待菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲轉移至新的V8平板上培養，隨后單孢分離純化菌株，并將菌株接種于V8斜面培養基上，置于13 ℃培養箱中保存。

1.3 致病性測定

1.3.1 原寄主致病性測定 按照科赫氏法則，取健康的絲瓜作為接種材料，將絲瓜先用自來水洗凈，再用75%乙醇擦拭表面并晾干。將分離獲得的菌株在V8培養基上培養3 d，用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，直接接種到健康絲瓜果實上，以接種無菌培養基為對照，接種樣品放入托盤中保濕，置于25 ℃培養箱中培養2 d。待果實發病后進行病原菌的再分離，方法同上。

1.3.2 對絲瓜及其他寄主致病性測定 除絲瓜外，選取葫蘆科的黃瓜，茄科的番茄、茄子，十字花科的白菜、西蘭花，錦葵科的秋葵為代表作物，將各作物種子催芽后播種在一次性塑料杯中，置于恒溫光照培養箱中16 h/8 h光暗交替培養，培養約10 d后在幼苗莖基部接種病原菌孢子懸浮液（將病原菌在V8培養基上25 ℃培養3 d，切取小塊菌絲塊放入V8液體培養基中培養2 d，用滅菌自來水洗凈菌絲，誘導游動孢子，將游動孢子濃度稀釋為1×105個/mL），接種后保濕培養，觀察并記錄發病情況。

1.4 形態學鑒定

將純化后的菌株接種到V8培養基上，于25 ℃恒溫培養箱中培養，3 d后觀察菌絲生長形態及顏色，并于顯微鏡下觀察泡囊的形態特征;15 d后在顯微鏡下觀察有性生殖器官形態，共計測量了50個性器官和泡囊。按照van der Plaats-Niterink等的方法[11-12]對病原菌進行形態學鑒定。

1.5 分子生物學鑒定

選取在V8平板上培養3 d左右的菌株，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅置于V8液體培養基中培養2～3 d，收集病原菌菌絲并用液氮冷凍研磨，采用溴化十六烷基三甲銨（CTAB）法提取病原菌DNA。分別使用rDNA-ITS區通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），Cox2基因特異性引物FM66（5′-TAGGATTTCAAGATCCTGC-3′）/FM58（5′-CCACAAATTTCACTACATTGA-3′）及β-tubulin基因特異性引物BT5（5′-GTATCATGTGCACGTACTCGG-3′）/BT6（5′-CAAGAAAGCCTTACGACGGA-3′）[13]進行PCR擴增。反應總體積50 μL：10×PCR buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL、上下游引物各 1 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL、Taq酶0.3 μL，ddH2O補足至50 μL。反應程序：94 ℃ 3 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，擴增產物送至湖南擎科生物技術有限公司進行測序。將所得的ITS、Cox2和 β-tubulin 基因序列用NCBI中BlastN程序進行同源性比對分析，將序列提交到NCBI/GenBank獲得基因登錄號。下載參比菌株各基因同源性較高的已知序列及鄰近屬種序列，將各基因串聯成數據集，使用ClutalX工具進行多重序列比對，將序列編輯、調整后，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）應用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，Bootstrap值重復 1 000 次。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及致病性測定

從南昌市和贛州市各分離獲得1株菌株，命名為SG-1、SG-2。

2.1.1 對絲瓜果實的致病性測定 將獲得的病原菌回接至健康的絲瓜果實中，恒溫培養約24 h后觀察發現，絲瓜果實上出現的癥狀與田間發病癥狀基本相似，在接種部位出現水漬狀褐色斑點，接種表面還有褐色霉層，而對照果實未出現發病癥狀（圖1-A）。隨機挑取發病組織進行再分離，獲得與原菌株一致的病原菌，根據科赫氏法則，確定該菌為引起絲瓜果實腐爛病的病原菌。

2.1.2 對絲瓜及其他作物幼苗的致病性測定 選取生長10 d左右的絲瓜、黃瓜、番茄、茄子、白菜、西蘭花、秋葵幼苗作為接種材料，用移液槍吸取游動孢子懸浮液注入幼苗根部，1～2 d后發現植株開始猝倒，接種部位部分萎縮，同時有水漬狀病斑出現（圖1-B～圖1-H）。

2.2 病原菌形態學鑒定

病原菌在V8平板上培養時，菌落生長迅速、呈圓形、菌絲白色、氣生菌絲發達。在顯微鏡下觀察，孢子囊呈姜瓣狀或膨大菌絲狀（圖2-A），孢子囊萌發時頂端可產生泡囊，內生游動孢子（圖2-B）。藏卵器球形，直徑19.2～29.1 μm，柄較直，雄器側生，寬棍棒狀或近檸檬形，大小為（9.8～16.2） μm×（8.3～13.6） μm，卵孢子球形，直徑（16.4～21.9） μm，平滑，不滿器（圖2-C）。上述結果與文獻中報道的腐霉屬中瓜果腐霉的形態特征和測量結果基本一致，初步將絲瓜果實腐爛病病原菌鑒定為瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）。

2.3 病原菌分子生物學鑒定

以ITS、Cox2和β-tubulin基因通用引物分別擴增SG-1、SG-2菌株gDNA，擴增SG-1分別得到長度為867、592、683 bp的片段（登錄號分別為MT598010、MT857739、MT857741）;擴增SG-2分別得到長度為865、590、682 bp的片段（登錄號分別

為MT598009、MT857740、MT857742），將3個基因序列串聯后構建系統發育樹，結果顯示，SG-1、SG-2 與瓜果腐霉均聚在同一分支，進化上的距離最近（圖3）。結合上述病原菌的形態特征及分子生物學鑒定結果，確定本次在江西省絲瓜上分離的果實腐爛病病原菌為瓜果腐霉。

3 結論與討論

腐霉菌是一類重要的作物土傳病害病原菌[14]，腐霉菌的卵孢子可在土壤中長期存活，且該病害傳播蔓延迅速，一旦發生將難以控制。之前有報道造成絲瓜果實腐爛的病原有腐霉和疫霉等[15]，由于二者引起的病害發病時間及發病癥狀均較為相似，生產上容易造成誤判，因此明確致病病原菌至關重要。過去主要根據形態學特征對腐霉菌進行分類，由于多數腐霉菌的形態特征不穩定，有些分類特征存在交叉性，且大多數為異宗配合，這些均限制了腐霉病害診斷的準確性[16]，趙思峰等分離的120個腐霉菌中有29個分離物因未誘發出雄器和藏卵器而無法鑒定到種[17]。目前主要采用形態學和分子生物學相結合的方法對病原菌進行鑒定。腐霉屬內包含多個近緣種，核糖體DNA內轉錄間隔區（ITS）序列作為特異性的靶標被廣泛應用于多種病原菌的分子檢測，但是ITS序列并不能完全區分所有親緣關系近的種[18]，結合形態學特征及多基因序列分析才能對病原菌進行準確鑒定。Martin等利用Cox2基因序列對24種腐霉的遺傳進化關系進行了分析，指出腐霉的系統發育與腐霉的孢子囊或菌絲體存在相關性[19];Belbahri等在對腐霉ITS序列分析的基礎上也分析了EF-1α、β-tubulin和nadh1的基因序列，揭示了這些基因在菌株內和不同菌株之間具有高水平的雜合性和多態性[20]。本研究通過對分離自江西省南昌市和贛州市絲瓜果實腐爛病的病原菌菌落、泡囊、雄器和藏卵器等形態特征觀察、致病性測定，聯合ITS、Cox2和β-tubulin多基因序列對絲瓜果實腐爛病病原菌進行分子生物學鑒定和系統進化關系分析，明確江西省絲瓜果實腐爛病的病原菌為瓜果腐霉，這是目前國內首次對絲瓜果實腐爛病病原進行的系統分離鑒定。

瓜果腐霉為我國第一個報道的腐霉種，也是腐霉屬中致病力最強的種之一，可以侵染多種寄主植物[21]。徐作廷等從玉米根部分離的瓜果腐霉能引起玉米苗期莖腐病[22]，de Cara等從哈密瓜苗期分離的瓜果腐霉能引起哈密瓜苗期植株死亡[23]，銀鈴等從菠菜猝倒病苗期分離的瓜果腐霉能引起菠菜幼苗猝倒病和根腐病[24]，Al-Sheikh從小麥種植區根際分離的瓜果腐霉能引起小麥幼苗猝倒病和根腐病[25]。本研究從絲瓜果實中分離出的瓜果腐霉除了能引起絲瓜果實腐爛和幼苗猝倒外，接種葫蘆科的黃瓜，茄科的番茄、茄子，十字花科的白菜、西蘭花，錦葵科的秋葵等幼苗發現均能引起植株猝倒。因此生產上防治該病害時，輪作意義不大，而應加強農田水分管理，注意排水、高壟等，同時選擇抗性品種及生物防治等手段進行綜合控制。

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