4種重要外來病毒高通量液相芯片檢測方法的建立

仇汝龍 阮智楊 胡波 魏后軍 范志宇 宋艷華 陳萌萌 徐為中 王芳

摘要：為建立小反芻獸疫病毒（PPRV）、西尼羅病毒（WNV）、裂谷熱病毒（RVFV）和南非型口蹄疫病毒（SAT FMDV）的高通量 液相芯片檢測方法，根據GenBank上公布的PPRV的N蛋白基因序列、WNV的E蛋白基因序列、RVFV的S片段基因序列和FMDV的5′UTR區基因序列，并基于各基因保守區設計相應的引物和探針。通過對多重PCR的上游、下游引物比例、雜交溫度、雜交時間進行條件優化，并驗證檢測方法的特異性和敏感性。敏感性試驗顯示，該方法對于PPRV、WNV、RVFV以及FMDV 4種病毒最低檢出量分別為5.78×103、2.15×103、2.98×105、9.54×104 copies/μL。本研究建立的高通量液相芯片檢測方法能夠同時快速地檢測4種外來病病毒，具有良好的特異性、敏感性和穩定性，對于流行病學調查和防范外來動物疫病具有重要的意義。

關鍵詞：檢測方法;液相芯片;基因序列;條件優化;流行病學

中圖分類號：S855.3 ? 文獻標志碼：A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0051-05

小反芻獸疫病毒（PPRV）、西尼羅病毒（WNV）、裂谷熱病毒（RVFV）和南非型口蹄疫病毒（SAT FMDV）是我國明確指出要重點防范的外來動物疫病病毒。小反芻獸疫（peste des petits ruminants，簡稱PPR）是由PPRV感染而引起的一種高度接觸性傳染病，作為外來疾病，它最早出現在中國西藏地區，并由西部向東部擴散[1-2];西尼羅熱（west Nile fever，簡稱WNF）是由WNV引起的一種人獸共患傳染病，該病在我國周邊國家俄羅斯、印度、巴基斯坦等國均有存在或流行，且由于其媒介昆蟲眾多、自然宿主活動范圍廣泛，不排除隨候鳥遷徙傳入我國的可能性[3];裂谷熱（rift valley fever，簡稱RVF）是由RVFV引起的反芻動物和人的一種急性、烈性傳染病，該病主要發生在非洲，但隨著我國與之貿易往來日益頻繁，裂谷熱對我國的威脅也越來越大[4];口蹄疫（foot-and-mouth disease，簡稱FMD）是由FMDV引起的一種急性、熱性、高度接觸性人獸共患傳染病，常見發病于偶蹄類動物[5]。FMDV有7個血清型，根據其同源性可將它們分為2個群，群1包括A、O、C和Asia I型，群2則包括SAT1、SAT2和SAT3。目前我國流行的為群1，但隨著國際貿易的日益頻繁，我國在進口檢疫中亦存在SAT FMDV入侵的風險。

目前，對這些疾病的診斷主要釆用血清學方法與分子生物學方法，然而傳統血清學檢測方法常涉及活病毒試驗，對操作人員極易造成感染，并可能會導致病毒的擴散，因此血清學方法常被非疫區國家限制使用;并且傳統的分子生物學檢測方法也無法滿足邊境和出入境口岸的大量樣品進行高通量檢測的需求。液相芯片技術是一種新型的生物芯片技術，并且擁有高通量、快速和準確率等優勢，很快就得到廣泛應用，因此滿足了本研究快速高通量檢測的目的[6-7]。隨著液相芯片技術的普及，國內外已有多種液相芯片方法建立的報道，可以針對多種重要病原微生物的檢測[8]。液相芯片檢測方法可以從血液和組織中同時檢測多種病原，擁有良好的應用前景[9-13]。

本研究利用液相芯片技術，通過在GenBank檢索小反芻獸疫病毒、西尼羅病毒、裂谷熱病毒和南非型口蹄疫病毒共4種病毒的基因保守區域作為靶標，設計4種病毒的多重PCR引物序列及相應的探針序列。將特異性探針與微球偶聯后，與生物素化PCR產物雜交并與鏈親和素藻紅蛋白結合，經懸浮芯片檢測儀來讀取中位熒光值（median florescence intensity，簡稱MFI）。用建立的液相芯片技術同時檢測小反芻獸疫病毒、西尼羅病毒、裂谷熱病毒和南非型口蹄疫病毒，通過條件優化后，評價其特異性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

包含PPRV保守基因序列的質粒由筆者所在實驗室構建和保存;包含RVFV、WNV、FMDV保守基因的質粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;檢測樣品中家畜樣品部分由江蘇等地養殖場采集，部分由中國動物衛生與流行病學中心國家外來動物疫病診斷中心提供;野生動物樣品由東北林業大學野生動物資源學院提供。

1.2 主要試劑和儀器

RNAiso Plus購自寶生物工程（大連）有限公司;Blood & Tissue Kits購自QIAGEN公司;PrimeScriptTM RT reagent Kit購自TaKaRa公司;EDC（N-（dimethylaminopropyl）-N′-ethylcarbodiimide購自美國Pierce公司;MES（2[N-Morpholino] ethanesulfonic acid）、Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸）、5 M TMAC（四甲基氯化銨）、10% SDS溶液、100×TE Buffer均購自Sigma公司;鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE，streptavidin-phycoerythrin）、熒光編碼微球購自美國Bio-Rad公司。Bio-PlexTM 200懸浮芯片系統由美國Bio-Rad公司生產制造。

1.3 試驗時間與地點

試驗于2017年11月5日至2018年5月30日在江蘇省農業科學院獸醫研究所完成，期間使用懸浮芯片檢測儀進行的檢測在上海柏辰生物科技有限公司完成。

1.4 引物和探針的設計

根據GenBank上公布的各病毒的保守區域基因序列，PPRV的N蛋白基因序列（GenBank：KX938427）、WNV的E蛋白基因序列（GenBank：GQ502441）、RVFV的S片段基因序列（GenBank：DQ380153）和FMDV南非型SAT1 5UTR區基因序列（GenBank：AY593840），利用Primer5設計出了4種病原的特異性探針，并在探針上游、下游分別設計特異性引物。分別在特異性探針的5′端進行C12臂氨基化[NH2（CH2）12]修飾，引物及探針序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 多重PCR擴增 將小反芻獸疫病毒、西尼羅病毒、裂谷熱病毒和南非型口蹄疫病毒的檢測引物混合，引物混合液中的每種上游引物濃度為 1.25 μmol/L，下游引物濃度為2.5 μmol/L。

以質粒DNA為模板，按照以下體系進行PCR反應：2×High Fidelity Master Mix 12.5 μL，引物混合液 1.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10 μL。反應條件：98 ℃ 3 min;98 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共計35循環;72 ℃延伸 5 min。4 ℃保存。

1.2.2 微球與探針的偶聯 選取編碼為36#、55#、43#和27#的磁性微球分別與經過C12臂氨基化[NH2（CH2）12]修飾的PPRV、WNV、RVFV以及FMDV探針進行偶聯，將2支新鮮EDC粉末從4 ℃冰箱中取出于室溫靜置30 min。以最高轉速渦旋懸浮微球，并超聲30 s，使其完全分散開。取200 μL微球加入到1.5 mL離心管中，以最高轉速離心 2 min，棄去上清，以22 μL 0.1 mol/L pH值4.5的MES重懸微球，徹底渦旋，使微球分散。在重懸的微球中加入 2 μL 對應的探針。取恢復至室溫的EDC粉末，加入1 mL ddH2O溶解。取1.25 μL EDC溶液加入微球中，迅速渦旋混勻。黑暗中室溫孵育30 min，再次制備新鮮EDC溶液，取1.25 μL EDC溶液加入微球中，迅速渦旋混勻。黑暗中室溫孵育30 min，加入 1 mL 0.02% Tween 20，輕微渦旋混勻，以最高轉速離心2 min，棄去上清，加入0.1% SDS，重懸沉淀 40 s。以最高轉速離心2 min。棄去上清，用40 μL TE Buffer（pH值8.0）重懸沉淀。渦旋儀上以最高轉速渦旋30 s，用錫紙包裹EP管，置于 4 ℃ 黑暗條件下保存。

1.2.3 多重PCR產物與偶聯核酸探針的微球混合物雜交 將4種病毒的陽性PCR產物與偶聯了微球的探針進行雜交檢測（027#-FMDV，036#-PPRV，043#-RVFV，055#-WNV）。配制工作微球混合液，在660 μL 1.5×TMAC雜交緩沖液中加入約150 000個偶聯好的微球，加入雙蒸水至終體積為990 μL，放置在冰上。將33 μL工作微球混合液加入反應管中，并加入2 μL PCR產物，并用TE Buffer補齊至50 μL，并以PCR陰性作為陰性對照，TE Buffer作為空白對照。將反應管置于PCR儀中孵育雜交，95 ℃加熱5 min，52 ℃孵育15 min。配置新鮮的SA-PE工作液，用1×TMAC 按照100倍稀釋SA-PE至工作濃度。將雜交孵育后的樣品轉移至預熱的濾板中，并在磁力洗板機中清洗2次。在每孔中加入100 μL 1×TMAC緩沖液，水平振蕩器上重懸磁珠1 min。加入25 μL稀釋好的SA-PE工作液。52 ℃振蕩孵育5 min。在Bio-Plex懸浮芯片檢測儀上讀取數據。

1.2.4 雜交條件優化 從上游、下游引物比例、雜交溫度和雜交時間3個方面對檢測條件進行了篩選，從而優化液相芯片雜交的條件。分別選擇上游、下游引物1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5這4個比例分別進行PCR反應，確定最佳上游、下游引物比例;根據所設計4條探針的Tm值，選擇48～58 ℃的溫度范圍，并且每隔2 ℃設置溫度梯度，確定最佳雜交溫度;分別將雜交溫度設定為5、10、15、20、30 min對各病毒進行雜交檢測，確定最佳雜交時間。

1.2.5 雜交產物的檢測及特異性試驗 在Bio-Plex懸浮芯片檢測儀上對樣品進行檢測并讀取數據。根據每孔中中位熒光值（MFI）讀數來進行結果判定。當檢測時每種微球的檢出數≥50且空白對照背景中位熒光值小于300，則表示結果可信。當樣品中中位熒光值（Median florescence intensity，簡稱MFI）≥300且與陰性對照的比值（qualitative criteria，簡稱QC）≥3時，可判定結果為陽性，否則為陰性。

1.2.6 檢測方法的靈敏性 將構建的PPRV病毒質粒以及合成的各病毒序列，用無菌水進行10倍倍比稀釋后，以各稀釋度作為模板進行多重不對稱PCR擴增，用所建立的液相芯片檢測體系對各組PCR產物進行雜交檢測，檢測其靈敏度。

1.2.7 樣品的檢測 利用建立的液相芯片檢測方法對來自養殖場及邊境地區的106份樣品進行了檢測。利用RNAiso Plus和Blood & Tissue Kit試劑盒分別提取樣品的RNA，并使用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒對RNA進行反轉錄。以4種 RNA病毒PPRV、RVFV、WNV、FMDV的引物對反轉錄得到的cDNA進行多重不對稱PCR擴增。將每份樣品對應的PCR擴增產物等量混合后，用所建立的液相芯片檢測體系對其進行雜交檢測，并將PCR產物進行測序驗證。

2 結果與分析

2.1 多重PCR檢測

用各病毒引物對反轉錄的cDNA或合成的基因序列進行擴增，分別可擴增出RVFV、FMDV、WNV、PPRV的大小為330、107、496、339 bp的目的片段，片段大小與預期相符，PCR擴增結果見圖1。

2.2 液相芯片雜交條件的優化

分別對液相芯片檢測方法的雜交溫度、上下游引物比例和雜交時間進行優化。檢測時空白對照的MFI值符合雜交檢測判定結果的要求，檢測結果可信。根據雜交檢測信號結果，在上游、下游引物比例篩選結果中，WNV最佳上游、下游引物比例為1 ∶ 4，其他病毒最佳引物比例為1 ∶ 5（圖2-A）;在雜交溫度篩選結果中，FMDV的最佳雜交溫度為 56 ℃，其他均為54 ℃（圖2-B），確定最佳雜交溫度為54 ℃;在雜交時間篩選結果中，各病毒最佳雜交時間均為30 min（圖2-C）。

2.3 4種病毒的液相芯片特異性試驗

利用優化后的液相芯片檢測方法過對RVFV、FMDV、WNV和PPRV病毒陽性質粒進行檢測，發現各病毒間均未出現交叉反應，表現出良好的特異性（表2）。

2.4 檢測方法的靈敏性

利用優化后的液相芯片檢測方法對各稀釋度模板進行檢測，RVFV、FMDV、WNV和PPRV起始模板濃度分別為1.08、1.12、1.17、2.15 ng/μL。根據液相芯片檢測結果判定標準，RVFV、FMDV、WNV、PPRV 4種病毒最低檢出稀釋度均為10-6，靈敏度分別為1.08×10-4 ng/μL（2.98×105 copies/μL）、1.12×10-5 ng/μL（9.54×104 copies/μL）、1.17×10-6 ng/μL（2.15×103 copies/μL）、2.15×10-6 ng/μL（5.78×103 copies/μL）（表3）。

2.5 臨床樣品的檢測

利用建立的多重液相芯片檢測方法對從養殖場及邊境地區采集的106份樣品進行了檢測。結果檢出PPRV陽性樣品15份，其余病毒檢測結果均呈陰性（表4）。陽性樣本的PCR產物通過測序驗證均符合。

3 討論與結論

小反芻獸疫（PPR）、西尼羅熱（WN）、裂谷熱（RVF）、外來型口蹄疫（FMD）是4種《國家動物疫病防治中長期規劃》中明確指出要重點防范的外來動物疫病，近年來，在我國周邊國家時有暴發，嚴重威脅著我國公共衛生安全。這些動物疫病一旦傳入，對于野生動物保護以及家畜養殖業都將是毀滅性的打擊。因此，在邊境動物及其制品的進出口檢疫中，如何快速準確地檢測這些外來疫病和防止傳入國內顯得尤為重要。常規的分子生物學檢測方法雖然具有安全、特異、敏感等優點，但是同樣不能滿足邊境高通量檢測的需求。因此，急需研發一種滿足邊境高通量檢測需求且能夠快速排查、 準確診斷外來動物疫病的方法。

目前，病毒的檢測主要依靠PCR檢測技術，主要包括普通PCR和熒光定量PCR。隨著檢測通量的增加，普通PCR和熒光定量PCR的靈敏度和準確性均難以保證，特別是多重熒光定量PCR的成本大大增加[14]。液相芯片系統是一種以流式技術為檢測平臺，不同熒光編碼的微球為載體，用于高通量分子檢測的新型生物芯片技術。其中以MagPlex微球應用最為廣泛。它以磁性微球替代了原本的聚苯乙烯微球，省去了操作過程中過濾的步驟，既減少了微球的損失，也使操作更為便捷，并且縮短了檢測時間，提高了檢測效率。熒光微球編碼是通過紅色和橙色2種熒光染料，每種染料分為10個濃度梯度，不同濃度的2種熒光染料相互組合可賦予微球載體100種顏色，以此來對微球進行編碼，對1份待檢樣品中最多100個指標進行同步檢測。本研究建立的液相芯片檢測技術，可實現在1個反應內檢測4種病毒，節省了試驗時間，并且提高了檢測效率。

本研究建立的液相芯片檢測技術具有較好的特異性。本研究建立的液相芯片技術檢測小反芻獸疫病毒（PPRV）的靈敏度為2.15×10-6 ng/μL（5.78×103 copies/μL）、 西尼羅熱病毒（WNV）的靈敏度為1.17×10-6 ng/μL（2.15×103 copies/μL），與其他已報道的液相芯片檢測方法靈敏度基本一致，并且與商業化的熒光定量檢測試劑盒的檢測靈敏度102～103 copies/μL也相當[15]。 其他2種病毒RVFV和FMDV的檢測靈敏度分別為2.98×105、9.54×104 copies/μL，靈敏度相對比較低。在進行敏感性試驗時，多重液相芯片檢測相較于單重檢測出現了本底值出現背景信號升高的現象，在排除可能引起本底值背景升高的原因后，發現此為多重檢測中存在的正常現象[16]。然而由于本底值的升高，會對陽性結果的判定有一定影響，表現為部分探針檢測敏感性降低。隨著檢測靶基因的增多，引物擴增效率，微球的數量以及反應條件等都會影響液相芯片的檢測，因此，還需要通過對引物設計和液相芯片的檢測體系等條件進行優化，從而提高檢測方法的靈敏性。另外，在對臨床樣品的檢測，使用多重液相芯片檢測方法檢測到小反芻獸疫病毒陽性的樣本15份，說明了該方法可用于臨床樣本的檢測。

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