大黃-赤芍調控肝衰竭大鼠肝組織Gab1、Akt表達的實驗研究*

王明剛

廣西中醫藥大學第一附屬醫院 (廣西 南寧，530023)

肝衰竭以肝細胞大量壞死及/或凋亡為基本病理特征，肝細胞大面積死亡后肝組織出現不同程度的異構，較為直接的表現形式即為肝微循環障礙，特別是遠端微血管受累，這也是中醫肝臟“瘀血內阻”的生物學機制[1,2]。改善肝臟微循環以營造促進肝再生的良好內環境是肝衰竭研究的熱點和難點。中藥大黃-赤芍具有活血化瘀、瀉熱解毒功效，研究發現其能提高肝衰竭大鼠存活率，改善肝功能的急劇惡化[3]，提高血清白細胞介素(IL-6)含量[4]，促進增殖細胞核抗原(PCNA)表達[5]。近年研究發現接頭蛋白Gab1是遠端微血管再生的上游關鍵信號分子[6]，通過Gab1-Akt信號通路發揮效應。本研究通過觀察大黃-赤芍中藥顆粒溶解物對肝衰竭大鼠模型肝組織Gab1與Akt表達的影響，探索其“祛瘀生新”的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠45只，雄性，體重為(250±30)g(長沙市天勤生物技術有限公司提供)。隨機分為3組：空白組15只、模型對照組15只、大黃-赤芍中藥顆粒溶解物處理組(簡稱大黃-赤芍組)15只。實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥物組成及主要試劑 大黃10 g、赤芍30 g采用配方顆粒(江陰天江藥業)，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院提供。使用雙蒸水充分溶解藥物，藥物濃度設定為3.6 g/ml。Gab1(9272S)、Akt(3232S)及β-actin(3700S)抗體購于CST公司。

1.3 肝衰竭動物模型建立 D氨基半乳糖600 mg/kg聯合LPS 20 μg/kg一次腹腔注射復制肝衰竭大鼠模型。大黃-赤芍中藥顆粒溶解物在造模前48 h開始灌胃給藥，給藥劑量為7.2 g/(kg·d)，一直延續至造模后48 h。模型對照組給予等量蒸餾水代替。

1.4 標本采集與處理 造模48 h后，用1%戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠，腹主動脈采血，離心收集血清；剖取肝臟，PBS洗凈肝組織，濾紙吸干，稱重后分別予10%甲醛液固定及液氮保存，用于Western Blot及熒光定量PCR檢測。

1.5 指標檢測

1.5.1 WesternBlot檢測肝組織中Gab1、Akt蛋白表達 提取各組大鼠肝組織總蛋白，Bio-Rad法測定蛋白含量。取蛋白30 μg作SDS-PAGE電泳，將蛋白樣本轉移至PVDF膜。轉膜后，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1.5 h，PBST洗3次后分別加入抗Gab1(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)多克隆抗體，4℃孵育過夜。分別加入相應的過氧化物酶標記二抗，脫色搖床搖1 h，PBST洗3次，每次5 min。DAB顯色，凝膠成像系統成像拍照分析。IPP 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.5.2 熒光定量PCR檢測肝組織Gab1、Akt mRNA表達 提取各組大鼠肝組織總RNA，紫外-分光光度計測定總RNA濃度，反轉錄合成cDNA，配置 20 μl qPCR反應體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，RNase Free Water 6.4 μl，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μl，合成的cDNA 2 μl。引物序列見表1。反應條件：95℃預變性15 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s(40個循環)；72℃延伸5 min。擴增反應在Roche LightCycler 480熒光定量 PCR 儀上進行，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

表1 引物序列

2 結果

2.1 大黃-赤芍中藥顆粒溶解物上調肝衰竭大鼠肝組織Gab1表達 肝衰竭模型大鼠肝組織中Gab1蛋白和mRNA均出現應激性升高，mRNA表達量與空白組比較差異具有統計學意義(P<0.05)；大黃-赤芍組大鼠肝組織Gab1蛋白和mRNA同樣被上調表達，且與模型組比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，研究結果提示大黃-赤芍中藥顆粒溶解物可上調肝衰竭大鼠肝組織Gab1蛋白及mRNA表達水平，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織Gab1蛋白及mRNA表達情況

2.2 大黃-赤芍中藥顆粒溶解物上調肝衰竭大鼠肝組織Akt蛋白及mRNA表達 Akt蛋白生物活性廣泛，其也是Gab1下游的鏈接分子，參與微血管新生過程。研究中，肝衰竭模型大鼠肝組織中Akt蛋白和mRNA表達量升高，其中mRNA表達量與空白組比較差異具有統計學意義(P<0.05)；大黃-赤芍組大鼠肝組織Akt蛋白和mRNA被上調表達，且與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，研究結果提示大黃-赤芍中藥顆粒溶解物可上調肝衰竭大鼠肝組織Gab1下游Akt表達水平，見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織Akt蛋白及mRNA表達情況

2.3 大黃-赤芍中藥顆粒溶解物改善肝衰竭大鼠肝組織微循環狀態 大黃-赤芍是中藥活血化瘀、瀉熱解毒的常用藥對，在肝衰竭臨床防治中出現頻率極高。本研究發現，大黃-赤芍能提高肝衰竭大鼠肝組織Gab1及Akt表達，二者與遠端微血管新生關系密切。結合前期研究結果：大黃-赤芍能改善肝衰竭大鼠肝功能，促進PCNA表達，提高肝再生能力，提高肝組織NO含量[7]。由此推測，大黃-赤芍改善肝衰竭大鼠肝組織遠端微血管循環狀態，糾正惡化的血液流變，為肝再生營造良好的內環境狀態，提高肝再生能力，以盡快恢復肝臟功能。

3 討論

肝衰竭是臨床常見的嚴重肝病癥候群，病死率極高。肝臟內環境穩態是肝臟正常生理活動的基礎，在肝衰竭狀態下肝內微環境狀態出現嚴重偏移。這些微環境不僅包括了肝內微循環狀態(血管微環境及血液流變學狀態)，還囊括了免疫/炎癥微環境、缺氧微環境及干細胞微環境等，臨床治療的根本著眼點還是在改善以上微環境以營造良好肝再生狀態，以期能夠保障肝臟功能快速代償。這對肝衰竭的臨床綜合治療手段提出了極高的要求，至少來說，關鍵的微環境狀態必須得到快速糾正，否則肝臟功能將失去重新代償的關鍵時間窗。我國的肝衰竭綜合治療手段起步較晚，第一部《肝衰竭診療指南》于2006年頒布，至此肝衰竭的臨床治療才有了規范化的指引標準[8]。2019年1月我國對《肝衰竭診療指南》進行全面更新，極大提高了臨床治療的標準化操作及預期的臨床療效目標[9]。

從肝衰竭發病的病理特點來看，其實肝內微循環障礙貫穿的整個疾病過程，特別是肝臟遠端的一些微小血管。首先，肝組織大面積死亡后肝臟正常結構被異構，微循環的空間間隙被壓縮，肝臟遠端部分區域直接形成壞死區塊；其次，難以避免的進一步出現肝臟內部血液流變學改變，進而誘發微小血管血栓形成，加重循環障礙與灌注區域缺血血氧；并且，惡化的肝臟代謝合成能力，對整個凝血機制的穩態維持出現深層次偏移，直接波及肝臟內部凝血微環境，加重肝內微循環障礙[2]。能否適時的改善肝衰竭時肝內微循環，為肝再生營造良好的內環境是進一步提高肝衰竭臨床救治水平的關鍵突破點之一。

接頭蛋白Gab1是哺乳動物體內含量最多、分布最廣泛的Gab家族蛋白，其能被多種酪氨酸激酶受體或非酪氨酸激酶受體激活，接受胞外多種生長因子、細胞因子和一些T/B細胞抗原的刺激，介導AKT、JNK、MAPK等多條信號轉導途徑，具有調控生長發育、血管形成、免疫適疫等廣泛的生物學功能[10]。早年已經發現Gab1能通過與血管內皮生長受體(VEGFR)2 形成多分子的復合體，激活PLC-r和Erk1/2促進細胞增殖，激活Akt促進細胞的遷移和存活[11]，若在內皮細胞中降低Gab1的表達，磷酸化FOXO1明顯降低，細胞存活直接受到影響[12]。至于Gab1在血管再生扮演什么角色及下游的效應分子一直沒有明確，直到近年來，采用基因敲除技術將大鼠Gab1基因剔除，以致損傷的血管根本無法再生，進一步研究發現其發揮效應的主要是通過“Gab1-Akt-eNOS”實現。

肝衰竭歸屬于中醫“黃疸”病范疇，進而有分為陽黃和陰黃兩大類，近代以來對該病病因、病機的全新認識，使臨床療效大為提高。項目組繼承肝衰竭“毒邪病因”新學說[13]，“熱毒內蘊、瘀血內阻”是肝衰竭發病的核心中醫病機。大黃味苦性大寒，歸肝、脾、胃、大腸經，不僅有解毒、活血化瘀、利膽退黃之功，且有推陳出新、蕩滌腸胃、釜底抽薪的功效，通腑瀉熱其效最優；赤芍味苦性微寒，入肝、脾經，為祛血分瘀血的要藥，是肝臟活血化瘀的必用之藥，也是肝衰竭臨床應用出現頻次最高藥物。大黃-赤芍兩藥的功效與肝衰竭中醫病機機制最為切合。2009年毛德文教授研究小組收集了1997～2007年國內專業期刊文獻共328篇，在治療肝衰竭的503方個中藥復方中，藥物配伍分布發現，大黃-赤芍配伍同時出現在218個方劑中[14]，大黃-赤芍作為治療本病的要藥已被大多數學者認同。

本研究中發現模型對照組大鼠Gab1及Akt表達升高，與正常組比較其差異具有統計學意義(P<0.05)，這可能與大面積肝損傷后，肝組織應激性啟動肝再生機制以試圖挽救瀕臨崩潰的肝臟功能。肝衰竭大鼠經過大黃-赤芍中藥顆粒溶解物干預處理后，肝組織中Gab1及Akt表達也同樣升高，與模型組比較其差異具有統計學意義(P<0.05)，研究結果提示大黃-赤芍可增強Gab1-Akt信號傳導強度，促進下游微血管新生等改善肝臟微循環的功能作用，這與大黃-赤芍活血化瘀、祛瘀生新的功能特性高度吻合。深入闡明大黃-赤芍活血化瘀、祛瘀生新以防治肝衰竭的分子機制是需要重點突破的關鍵科學問題，以此演化出某些具備功能活性的小分子化合物或小分子團，持續優化大黃-赤芍劑型設置將帶來廣闊的臨床應用空間與前景。