pH敏感型黃原膠/聚乙烯醇水凝膠的制備與表征*

劉 靜，徐夢潔，張秀梅，徐 濤，郭 媛，陳維毅，黃 棣

(1. 太原理工大學 生物醫學工程學院生物醫學工程系，納米生物材料與再生醫學研究中心，太原 030024；2. 太原理工大學 生物醫學工程研究所, 材料強度與結構沖擊山西省重點實驗室, 太原 030024)

0 引言

水凝膠是一種能在水中溶脹但不溶于水的高分子材料，由于其含水率和結構等與生物組織相似，具有良好的生物相容性，因此被廣泛地應用于藥物緩釋載體、組織工程支架、皮膚敷料等生物醫學領域[1]。目前研究和應用最廣泛的是pH敏感型水凝膠和溫敏型水凝膠，pH敏感型水凝膠是指水凝膠的體積隨外界pH值或離子強度的變化而發生改變的一類水凝膠[2-3]。本課題研究一種pH敏感型水凝膠的溶脹-消溶脹行為從而表現出水凝膠的pH敏感性來控制藥物的緩釋。

目前用于制備水凝膠的高分子材料有天然和人工合成兩類[4-5]，但都存在不足之處，為了滿足符合人體內部條件及具有良好生物相容性的材料，對兩種高分子材料進行復合來綜合其優良性能[6]，本研究制備黃原膠/聚乙烯醇(Xanthan Gun/Polyvinyl alcohol，XG/PVA)水凝膠。PVA是一種無毒副作用、可降解且具有機械性能的人工合成材料，制備出的水凝膠雖然具有可調節的性能及降解性[7-9]，但與天然高分子相比其生物相容性較差，XG是一種無毒、可降解、生物相容性好的天然高分子材料[10-13]，本實驗采用化學交聯結合物理交聯的方式制備出一種XG/PVA復合水凝膠，研究XG與PVA不同質量比、不同交聯劑用量及不同冷凍-解凍循環次數對XG/PVA水凝膠溶脹性能和力學性能的影響，確定最優實驗條件制備水凝膠，進一步研究其pH敏感性及溶脹-消溶脹動力行為，同時以牛血清蛋白(Bovine serum alumin，BSA)為模擬藥物，研究其在該水凝膠中的釋放行為，及其生物相容性的研究，結果表明XG/PVA復合水凝膠有望在藥物控釋方面有所應用。

1 實驗

1.1 主要原材料

XG：上海麥克林生化有限科技有限公司；PVA(10500)：西隴科學股份有限公司；環氧氯丙烷：分析純，上海麥克林生化有限科技有限公司；氫氧化鈉：天津市北辰方正試劑廠。去離子水由四川優普純水儀制備(18.2 MΩ·cm)。

1.2 主要儀器與設備

集熱式恒溫磁力攪拌浴，HWCL-3，鄭州長城科工貿有限公司；強力電動攪拌機，JB50-D，上海標本模型廠制造；冷凍干燥機，FD-1A-80，上海比朗儀器制造有限公司；掃描電子顯微鏡(Scanning electric microscopy，SEM)，JSM-7100F，日本Jeol公司；電子萬能試驗機，Instron5544，美國INSTRON；傅里葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)，Nicolet iS10，美國Thermo Scientific公司；細胞培養箱，Forma311，美國Thermo Scientific公司；熒光倒置相差顯微鏡，TiS，日本Nikon公司。紫外分光光度計，SP-756，上海光譜儀器有限公司。

1.3 試樣制備

將一定量的XG和PVA混合在90 ℃機械攪拌下溶于200 mL去離子水中，待溶解完全后冷卻至室溫，再加入2 g氫氧化鈉和一定量的交聯劑環氧氯丙烷，攪拌均勻后倒入模具，放入冰箱進行冷凍-解凍循環即制得XG/PVA復合水凝膠。

1.3.1 XG與PVA的不同質量比

分別稱取2 g的XG和6、10、14 g的PVA混合加入200 mL的去離子水中，使XG與PVA質量比分別為1∶3、1∶5、1∶7，按照上述實驗步驟，再加入10 mL的環氧氯丙烷攪拌均勻后倒入模具放入冰箱進行2次冷凍-解凍循環即制得一系列XG/PVA復合水凝膠。

1.3.2 交聯劑的不同用量

取XG與PVA的質量比為1 : 5，按照上述實驗步驟，分別加入6、10、14 mL的環氧氯丙烷到混合溶液中，使交聯劑用量為3%、5%、7%，攪拌均勻后倒入模具放入冰箱進行2次冷凍-解凍循環即制得一系列XG/PVA復合水凝膠。

1.3.3 冷凍-解凍循環的不同次數

取XG與PVA的質量比為1∶5，交聯劑用量為5%，按照上述實驗步驟，得到混合溶液后倒入模具放入冰箱進行冷凍-解凍循環，在-20 ℃下冷凍21 h常溫下解凍3 h為1次，分別進行1次、2次、3次的冷凍-解凍循環即制得一系列XG/PVA復合水凝膠。

1.4 性能測試

1.4.1 水凝膠溶脹性能的測定

采用重量法對水凝膠進行溶脹性能測試，將制得的試樣在冷凍干燥機中進行冷凍干燥，將干燥的樣品稱重后室溫下浸泡在pH = 5的PBS中24 h，取出用濾紙拭去表面水分后稱重，每組樣品做3次平行試驗。水凝膠的溶脹率(SR)按公式計算[7]：

其中Ms是達到溶脹平衡時凝膠重量；Md是烘干后干凝膠重量。

1.4.2 水凝膠力學性能的測定

將水凝膠切割成厚度10 mm的圓柱體，用Instron5544萬能材料試驗機對其進行壓縮力學性能測試，設置壓縮速度為3 mm/min，得到應力-應變曲線，每組樣品做3次平行試驗，采用開始壓縮至產生10%應變的線性階段進行線性擬合得到壓縮模量。采用應變至60%時，單位面積下的應力作為壓縮強度。

1.4.3 SEM觀察

將經過冷凍干燥機干燥后的材料切割成厚度為1 mm的片狀，固定在樣品臺上，表面噴鉑金(Pt)，觀察XG/PVA復合水凝膠的內部結構。

1.4.4 FT-IR分析

利用KBr壓片法，用FT-IR技術對冷凍干燥后的XG、PVA、XG/PVA水凝膠進行FT-IR分析，通過圖譜中的特征峰來觀察材料的交聯機理。

1.4.5 pH敏感性的測定

將冷凍干燥后的樣品稱重后，室溫下分別浸泡在不同pH值的PBS中，每隔一段時間后取出拭去表面水分稱重，計算水凝膠的溶脹率。每組樣品做3次平行試驗。

1.4.6 pH響應性的測定

將冷凍干燥后的樣品稱重后，室溫下預先在pH=7.0的PBS中溶脹24 h，然后分別置于pH=5.0和pH=10.0的PBS中，每隔2 h交替置于pH=7.0的PBS中，取出拭去表面水分計算溶脹率。每組樣品做3次平行試驗。

1.4.7 包埋BSA水凝膠的體外釋放測定

在XG/PVA共混溶液時加入BSA，制備BSA含量為0.5%(質量分數)的復合水凝膠，把載BSA水凝膠分別置于5 mL pH分別為2.5、7.0和10.0的PBS中，每隔一段時間后取出5 mL溶液并補充5 mL新鮮PBS，于279 nm處用紫外-可見分光光度計測定BSA的釋放量，每組樣品做3次平行試驗，繪制BSA的累計釋放曲線。

1.4.8 細胞相容性

本實驗采用CCK8法進行細胞增殖和毒性分析。將XG/PVA水凝膠冷凍干燥后制成約Φ10 mm × 1 mm的薄片，利用高壓蒸汽滅菌法滅菌處理后放入24孔培養板，同時設空白組。將MG63細胞懸液以1×104個/mL的濃度接種于24孔板中，每孔1 mL。移至細胞培養箱中(37 ℃，5% CO2)，每組3個平行樣，隔天換培養液，分別于1、4和7天利用倒置相差顯微鏡觀察細胞在材料周圍生長情況，并拍攝照片。同時向每孔中加入10 μL的CCK8溶液，再放入培養箱3 h，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值(OD)。

2 結果與討論

2.1 XG/PVA復合水凝膠溶脹動力學

圖1為影響XG/PVA水凝膠溶脹性能的實驗條件因素，如圖所示，隨著PVA量或交聯劑量的增加，溶脹率出現先上升后下降的趨勢；隨著冷凍-解凍循環次數的增加溶脹率下降后基于平緩。這可能是因為，通過物理與化學的交聯作用，交聯程度大的凝膠內部結合緊密，溶脹率小。在XG與PVA質量比為1∶3時，或交聯劑用量為3%時，XG/PVA復合凝膠的溶脹率較小，說明此時凝膠內部通過化學交聯作用變得緊密[13-14]，之后隨著PVA量或者交聯劑量的增加，凝膠內部形成了更加均勻、更多的孔隙結構，空隙的總體積增加，從而表現出良好的溶脹行為，而下降可能是因為過量的PVA或交聯劑會發生一定的團聚現象，凝膠單位體積的孔隙率相對減少所致。隨著冷凍-解凍循環次數的增加，凝膠物理交聯點增多，高分子交聯點間距變小，溶脹率減小，在物理交聯達到飽和后，凝膠形成均勻孔隙結構，溶脹率基于平穩。故凝膠在XG與PVA質量比為1∶5時，交聯劑用量為5%，進行3次冷凍-解凍循環時具有最佳的溶脹性能，此時溶脹率達到241%。

圖1 不同實驗條件下的XG/PVA水凝膠的溶脹率

2.2 XG/PVA復合水凝膠力學性能

圖2為影響XG/PVA水凝膠壓縮彈性模量和壓縮強度的實驗條件因素，如圖2所示，隨著PVA量或交聯劑量的增加，力學性能出現先上升后下降的趨勢；隨著冷凍-解凍循環次數的增加力學性能不斷增強。這是因為隨著PVA量的增加凝膠內部形成了更加均勻的孔隙結構，且PVA本身具有一定的機械性能，從而力學性能增強，而下降可能是因為過量的PVA改變了凝膠已有的網絡結構，使其力學性能降低。交聯劑的用量影響著凝膠的交聯程度，隨著交聯劑用量的增加，凝膠化學交聯程度變大，內部結構緊密，孔隙均勻存在，從而力學強度增加，之后過量的交聯劑在凝膠交聯程度達到飽和后作為異物存在于凝膠中，阻礙了凝膠的網絡通道影響力學性能。冷凍-解凍循環通過凝膠內部高分子鏈間氫鍵，離子鍵等物理作用交聯凝膠，隨著冷凍解凍循環次數的增加，水凝膠內的物理交聯點增多，高分子交聯點之間的距離減小，凝膠內部結合緊密，力學性能增強[7]。與溶脹率相一致，凝膠在XG與PVA質量比為1∶5時，交聯劑用量為5%，進行3次冷凍-解凍循環時具有良好的力學性能，此時水凝膠的壓縮彈性模量和壓縮強度達到(26.30±0.03)kPa和(134.36±0.43)kPa。

圖2 不同實驗條件下的XG/PVA水凝膠的力學性能

這就說明可以通過改變原料的不同質量比、交聯劑不同用量和冷凍-解凍循環不同次數來控制XG/PVA復合水凝膠的溶脹性能及力學性能，這也對于控制藥物在體內的緩釋發揮出一定作用。當XG與PVA質量比為1∶5，交聯劑環氧氯丙烷用量為5%，冷凍-解凍循環3次時，XG/PVA復合水凝膠內部結構均勻緊密且具有較高的溶脹性能和良好的力學性能。之后對該實驗條件下制備的XG/PVA復合水凝膠進一步表征。

2.3 XG/PVA水凝膠SEM觀察

從SEM可以看出，XG/PVA復合水凝膠內部存在著明顯的孔隙結構，形成了互穿網絡結構，說明該凝膠成功交聯合成，且存在著明顯的孔通道，是具有良好的溶脹性能和力學性能的原因。XG/PVA水凝膠通過化學與物理交聯作用成功形成了網狀結構。

2.4 XG/PVA水凝膠紅外分析

圖4為XG、PVA、XG/PVA復合水凝膠的FT-IR圖譜。PVA分子鏈上帶有許多可反應羥基，環氧氯丙烷在堿性條件下可與羥基發生反應[15]。從圖中可以看出，3 439、3 432、3 437 cm-1處分別為XG、PVA和XG/PVA復合水凝膠的羥基伸縮振動峰，是分子鏈上羥基存在分子間或分子內的氫鍵振動吸收造成的，說明通過冷凍-解凍循環可以使凝膠分子鏈間產生氫鍵等形成物理交聯；1 110 cm-1處為醚鍵的吸收峰，可以看出在交聯后，XG/PVA復合水凝膠有一個較寬的醚鍵吸收峰，說明反應可能有新的醚鍵生成，發生了化學交聯[15-16]。可見，通過化學與物理交聯作用，XG與PVA交聯成功。

圖3 XG/PVA水凝膠的SEM

圖4 XG/PVA水凝膠的紅外光譜圖

2.5 XG/PVA水凝膠的pH敏感性

圖5為pH值對XG/PVA復合水凝膠平衡溶脹的影響曲線。從圖中可以看出，該凝膠在酸性及堿性環境中的溶脹率均高于中性條件下的溶脹率，這是因為在堿性環境中時，XG側鏈中的-COOH基團去質子化，電離成-COO-使凝膠帶有負電荷，電荷的相互排斥使凝膠內部結構疏松易于溶脹；在酸性環境中，XG中-COOH基團質子化，水凝膠中含有大量親水基團，高分子鏈上的羥基被質子化而帶正電荷，致使分子鏈間相互排斥，伸展結構，使凝膠表現出較大的溶脹率。表明了pH值的變化會造成該凝膠高分子鏈基團的質子化/去質子化的變化，使得鏈段的溶脹率平衡發生變化[2-3]。

圖5 不同pH的XG/PVA水凝膠的平衡溶脹率

2.6 XG/PVA水凝膠的pH響應性

圖6為XG/PVA水凝膠的溶脹-消溶脹曲線。從圖中可以看出，XG/PVA水凝膠置于酸或堿pH緩沖液中2 h該凝膠溶脹率增加，取出置于pH=7.0的PBS中2 h溶脹率降低，在置于酸或堿pH緩沖液2 h后溶脹率又增加，如此交替浸泡呈現出一種“∧”的趨勢。說明該凝膠對pH的改變具有一定的響應性，且其溶脹收縮過程可逆，在作為控制藥物釋放方面發揮出一定作用[17]。

圖6 XG/PVA水凝膠的溶脹-消溶脹行為

2.7 不同pH下包埋BSA的水凝膠體外釋放行為

圖7為不同pH值對BSA體外釋放的影響曲線。從圖中可以看出，XG/PVA水凝膠在酸性條件下和堿性條件下的BSA體外累積釋放率均高于中性條件下，可能是因為凝膠高分子鏈在強酸堿環境下呈舒展狀態，伸展結構為BSA的擴散打開了通道。而在中性環境下呈卷曲狀態，阻礙了BSA的釋放通道[18-20]。表明了環境中pH值對BSA的釋放具有明顯的控制作用。

圖7 不同pH的XG/PVA水凝膠的BSA體外釋放

2.8 XG/PVA復合水凝膠的細胞相容性

將MG63細胞與XG/PVA復合水凝膠共培養，用熒光倒置顯微鏡觀察材料周圍細胞生長情況。從圖8(a)中可以看出，4天時，大量梭形細胞在材料周圍增殖生長，并可以保持良好的細胞形態。圖8(b)則表明細胞與材料共培養時，細胞有明顯的增殖，表明XG/PVA復合水凝膠具有良好的細胞相容性，可維持細胞正常生長增殖。

圖8 XG/PVA水凝膠的細胞增殖實驗

3 結論

本文利用化學交聯結合物理交聯制備出了pH敏感型XG/PVA復合水凝膠，研究了其溶脹性能、力學性能、pH響應性能、BSA體外釋放性能及其生物相容性。

(1)當XG與PVA質量比為1 : 5時，交聯劑用量為5%時，冷凍-解凍循環3次時XG/PVA水凝膠具有良好的溶脹性能和力學性能，溶脹率達到241%。壓縮彈性模量和壓縮強度分別達到(26.30±0.03)kPa和(134.36±0.43)kPa。

(2)通過SEM觀察，XG/PVA復合水凝膠形成了互穿網絡結構；從FT-IR結果表明XG與PVA形成了復合水凝膠。

(3)XG/PVA復合水凝膠具有良好的pH刺激響應性，對BSA的釋放也表現出了良好的控制緩釋效果，且細胞培養結果表明，該凝膠周圍細胞生長良好，形態正常，表現出良好的細胞相容性，有望用于控制藥物釋放載體。