戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎發育的影響

戊唑醇（Tebuconazole）是一種高效、廣譜、內吸性三唑類殺菌劑，具有活性高、防治效果好、性價比高等優勢。戊唑醇的大量使用和丟棄使其通過多種途徑進入水體，對水生生態系統造成了巨大危害，并可通過食物鏈在魚類等水生生物體內富集并最終進入人體，對人體健康構成威脅[1-2]。戊唑醇主要在肝臟中代謝，分子中特丁基結構的一個甲基可被氧化后羥化，隨后與葡萄糖醛酸或硫酸發生結合反應[3]。在哺乳動物體內，氧化產物可進一步代謝為三元醇或酮類衍生物。然而，當各個臟器和解毒酶系統未發育完全前，尤其是對于體外胚胎發育的動物，戊唑醇對其胚胎發育的影響尚不清楚。

本文探究了戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎發育的潛在影響。使用不同濃度的戊唑醇（10，20，40 mg/L）處理處于囊胚末期的熱帶爪蟾胚胎，持續至裂縫胚孔期結束。統計胚胎的死亡率、畸形率；檢測胚胎中NRF2、SOD、CAT和NQO1的表達情況及DNA損傷效應。當戊唑醇濃度為20 mg/L時，胚胎出現大量畸形；當戊唑醇濃度達到40 mg/L時，胚胎的存活率顯著下降；戊唑醇對DNA存在一定的損傷作用；體內NRF2、SOD、CAT和NQO1的表達水平隨著戊唑醇濃度的增加而下降。戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎有顯著毒性作用，干擾原腸運動，影響器官發育，誘導胚胎發育畸形甚至死亡。

熱帶爪蟾個體小、生長周期短、胚胎發育模式與人類相似，且基因組簡單，爪蟾胚胎致畸實驗（FETAX）是檢測污染物發育毒性的常用檢測方法[4-5]。本文通過戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎發育的影響研究，進一步確定戊唑醇的毒性作用，以探究環境中戊唑醇對脊椎動物胚胎發育的潛在影響。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1主要試劑

人絨毛膜促性腺激素（HCG）購于寧波第二激素廠，半胱氨酸和戊唑醇購于生工生物公司。

1.1.2實驗材料

實驗熱帶爪蟾由溫州大學生命與環境科學院羊棲菜研究所實驗室培育。

1.2實驗方法

1.2.1胚胎獲取

選取本實驗室飼養的多對雌雄熱帶爪蟾，采用人工注射HCG的方法進行誘導產卵，使用2%半胱氨酸溶液去除卵外膠質膜，待發育到囊胚末期、原腸胚前期對正常胚胎進行染毒實驗。

1.2.2胚胎暴露實驗

使用熱帶爪蟾培養液將戊唑醇稀釋成0、10、20、40 mg/L等4個濃度，為了避免受精過程的不確定性帶來的誤差，在囊胚期于顯微鏡下挑選發育正常的胚胎，并從囊胚期開始處理至原腸期結束。向培養皿中加入50 mL戊唑醇溶液，于恒溫培養箱（26±0.5）℃黑暗培養12 h，之后每24 h更換培養液。

1.2.3顯微觀察

每間隔6 h記錄各濃度組胚胎死亡、畸形、孵化情況，于體視顯微鏡下觀察胚胎并拍照記錄。

1.2.4Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶mRNA表達水平檢測

根據NCBI和Xenbase數據庫獲取編碼熱帶爪蟾Nrf2、SOD、CAT、NQO1和β-actin的完整序列，并設計引物（見表1）。選取試驗組與對照組發育的胚胎，通過Trizol法提取總RNA，逆轉錄得到cDNA為模板，進行RT-PCR反應。

1.2.5 DNA損傷效應檢測

連續培養96 h后，每組隨機挑選10只熱帶爪蟾胚胎，提取胚胎總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶的拖尾情況，比較不同濃度戊唑醇對胚胎DNA的損傷效應。

1.2.6數據處理

用SPSS17.0統計軟件進行處理，采用t檢驗進行統計學分析，P<0.05表示差異顯著，P< 0.01表示差異極顯著，結果以平均值±SD表示。

2結果與分析

2.1熱帶爪蟾胚胎形態變化

在胚胎發育至Stage 9-10時，使用戊唑醇染毒處理后，爪蟾胚胎后期的發育受到不同程度的影響。如圖1所示，與對照組相比，染毒6 h，胚胎表現為原腸運動受干擾，細胞遷移和胚孔閉合無法正常進行，嚴重的導致死亡；染毒后24 h，部分胚胎出現尾部上彎、短尾等畸形變性，更嚴重的導致胚胎異常及死亡；染毒后72 h，胚胎出現小眼、腸道水腫、尾巴彎曲、嘴巴突出和卵黃囊外漏等異常表型；染毒后96 h，已有大量胚胎死亡，存活胚胎多表現不同程度的異常，例如體色深、小眼癥狀及尾部下彎、嘴巴水腫等。

2.2戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎死亡率和畸形率的影響

不同濃度戊唑醇處理后胚胎發育死亡率和畸形率統計結果如圖2所示，隨著戊唑醇濃度的升高，胚胎死亡率呈上升趨勢，且當濃度為20 mg/L時有極顯著差異（P<0.01）。胚胎畸形率隨戊唑醇濃度增加呈上升趨勢，但沒有呈明顯正相關，且當濃度為40 mg/L時具有極顯著差異（P<0.01）。在染毒后96 h，胚胎存活率隨戊唑醇濃度增加而逐漸下降，當濃度為20 mg/L時有極顯著差異（P<0.01），當濃度為40 mg/L存在顯著差異（P<0.05）。綜上，戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎死亡率和畸形率有顯著影響，導致胚胎出現不同程度的畸形甚至導致死亡。戊唑醇毒性存在累積效應，胚胎存活率隨時間推移逐漸降低直至全部死亡。

2.3戊唑醇誘導熱帶爪蟾細胞氧化損傷

為了進一步探索戊唑醇對胚胎發育致畸作用的分子機制，在戊唑醇處理6 h后，檢測了NRF2、SOD、CAT及NQO1幾種編碼與機體氧化還原狀態密切相關的II相解毒酶和抗氧化酶基因的表達情況。結果如圖3及圖4所示，當胚胎處于Stage 13時，其體內Nrf2、SOD和CAT表達量相對較低，在經過戊唑醇處理后，NRF2和CAT的表達受到進一步抑制。與之對應，NQO1的表達量在對照組中較高，經戊唑醇處理后，表達水平隨濃度增加顯著降低（P<0.01）。綜上所述，熱帶爪蟾胚胎中抗氧化系統在胚胎發育早期尚未完善，且戊唑醇能顯著抑制相關基因的表達，從而誘導胚胎細胞的氧化損傷。

2.4戊唑醇誘導熱帶爪蟾胚胎染色體DNA損傷

在戊唑醇處理后96 h，提取熱帶爪蟾胚胎的基因組DNA，并檢測戊唑醇對胚胎DNA造成的損傷。結果如圖5所示，與對照組相比，10、20 mg/L實驗組DNA條帶出現明顯拖尾，說明戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎DNA產生較大損傷。

3討論與結論

在戊唑醇對斑馬魚的急性毒性試驗中發現，戊唑醇比較穩定，但過量則易殘留在土壤和水中，對魚類等水生生物造成危害[6- 7]。不同濃度戊唑醇處理均會對熱帶爪蟾胚胎產生影響，10 mg/L戊唑醇就開始對胚胎發育產生顯著影響；20 mg/L戊唑醇會造成胚胎出現不同程度的畸形，例如脊柱彎曲、尾部彎曲、腸道水腫、小眼和體色異常等。其潛在機制可能與戊唑醇抑制了胚胎細胞中Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因表達有關。Nrf2是抗氧化系統主要的調控因子，而醌氧化還原酶（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶對活性氧清除具有重要作用[8]。當胚胎受到外界強烈刺激時，Nrf2、NQO1、CAT、SOD等基因的表達被顯著抑制從而誘導胚胎氧化損傷。通過該實驗，既探究了戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎發育的影響，同時也為戊唑醇對人類及脊椎動物早期胚胎發育的影響提供借鑒。值得注意的是，低濃度戊唑醇即會對胚胎發育產生較大影響，因此需合理預估其安全使用濃度。

參考文獻

[1]龔會琴，楊鴻波，鷹申，等.戊唑醇對2種水生生物的毒性試驗研究[J].貴州科學，2014，32（2）：74-77.

[2]王曉琳，劉玉霞，高素霞，等.金銀花中戊唑醇、苯醚甲環唑的殘留分析[J].中國農學通報，2017，33（19）：143.

[3]MANN R M，HYNE R V，CHOUNG C B， et al. Am‐phibians and agricultural chemicals： review of the risks in a complex environment [J]. Environmental pollution，2009，157（11）：2 903.

[4]HI H，QIAN L，GUO S， et al. Teratogenic effects of tetrabromobisphenol [J]. Comparative biochemistry and physiology Toxicology & pharmacology ： CBP， 2010， 152（1）： 62.

[5]來松濤，魏于全，鄧洪新，等.模式生物——爪蟾在生物醫學上的應用[J].自然科學進展，2006，16（9）：1 074.

[6]陳迎麗，段亞玲.戊唑醇對斑馬魚的急性毒性與安全評價[J].貴州科學，2013，32（6）：72.

[7]錢麗娟，劉青坡，郭素珍，等.爪蟾胚胎致畸實驗（FE‐TAX）在檢測污染物發育毒性中的應用[J].安全與環境學報，2009，9（4）：24.

[8]胡流芳. Keap1_Nrf2_ARE信號通路的抗氧化應激作用及其調控機制[J].國際藥學研究雜志，2016，43（1）：146.

（溫州大學徐曼，朱振濤）