短小芽孢桿菌與化學殺細菌劑協同防治煙草青枯病研究

馮永新 關輝 靳彥峰 徐偉 張衛東 譚宏祥 王靜 王杰

摘?要：為探究短小芽孢桿菌與化學殺菌劑聯合防控煙草青枯病的可行性，分別采用改良抑菌圈法和平板菌落計數法測定7種殺菌劑和短小芽孢桿菌AR03對青枯雷爾氏菌的毒力及殺菌劑與AR03的生物相容性，同時采用Horsfall法確定殺菌劑和AR03的復配比例。室內毒力試驗結果表明，7種殺菌劑和AR03對青枯雷爾氏菌的生長均有較好的抑制作用。7種殺菌劑的毒力大小依次為三氯異氰尿酸、氯尿·硫酸銅、噻菌銅、溴菌·壬菌銅、甲霜·福美雙、噻唑鋅和中生菌素，EC50值介于101.02～212.70 mg/L之間。濃度為1.0×105～1.0×109 cfu/mL的AR03對青枯雷爾氏菌的抑菌率介于26.13%～73.54%之間，呈現濃度依賴性。生物相容性分析發現7種供試藥劑與AR03的生物相容性差異較大，短小芽孢桿菌AR03與噻菌銅、噻唑鋅、甲霜·福美雙生物相容性較好，尤其是噻菌銅表現最好，測試濃度100 mg/L時，菌落數大于1×107 cfu/mL。綜合殺菌劑對青枯病菌的毒力及其與AR03生物相容性，噻菌銅表現最優。噻菌銅（EC50=175.21 mg/L）與AR03（EC50=6.84×106 cfu/mL）復配劑在體積比為5∶5時，對青枯雷爾氏菌的抑制效果顯著，增效作用明顯，增效比率值IR值為1.482。室內盆栽試驗結果表明，菌藥復配劑的防效（68.77%）明顯優于單劑噻菌銅和生防菌AR03的防效，且混配劑中噻菌銅使用量只有單劑的1/2，大幅降低了化學藥劑的使用量。

關鍵詞：煙草青枯病;高效藥劑;短小芽孢桿菌;噻菌銅;增效作用

Abstract： To explore the potential of the control synergism of B. pumilus AR03 combined with seven tested fungicides against tobacco bacterial wilt， the toxicity of seven fungicides and AR03 strain against Ralstonia.solanacearum and the bio-compatibility of fungicides with AR03 were measured by the improved inhibition zone method and the plate colony-counting method， and the synergistic effect was determined by the Horsfall method. The results of in vitro toxicity test indicated that seven fungicides and AR03 all exhibited a good inhibitory effect on the growth of R. solanacearum， and the virulence of seven fungicides were trichloroiso cyanuric acid>chloroisobromine cyanuric acid plus copper sulfate>thiodiazole copper>bromothalonil plus cuppric nonyl phenolsulfonate> Metalaxyl plus thiram> thiadiazole zinc>Zhongshengmycin， and the half-maximal inhibitor concentration （EC50） ranged from 101.02-212.70 mg/L. B. pumilus AR03 also had a good inhibition rate （26.13%-73.54%） in a dose dependent manner at the concentration from 1.0×105 to 1.0×109 cfu/mL. Results from the bio-compatibility test showed that AR03 had good biocompatibility with thiodiazole copper， Metalaxyl plus thiram， thiadiazole zinc， while thiodiazole copper performed the best. When the test concentration of 100 mg/L， the number of colonies was greater than 1×107 cfu/mL. The mixture of thiodiazole copper （EC50=175.21 mg/L） and AR03 （EC50=6.84×106 cfu/mL） in the volume ratio of 5∶5 behaved a notable inhibitory and synergistic effect against R. solanacearum and yielded an IR value of 1.482. The results of in vivo experiment showed that the control effect of the combination was significantly higher than that of thiodiazole copper and AR03 strain treatment alone. More importantly， the usage volume of thiodiazole copper in the mixture was half of the single agent， which greatly reduced the use of chemical agents.

Keywords： tobacco bacterial wilt; high efficiency pesticides; Bacillus pumilus AR03; thiodiazole copper; synergistic effect

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的煙草青枯病是一種細菌性土傳病害，其寄主范圍廣、致病機理和發病條件復雜多樣，防治困難，缺乏有效藥劑[1]。近年來該病害在云南、貴州、福建、四川、廣東、廣西等主栽煙區發生和為害十分嚴重[1-2]。目前，化學防治依然是防治煙草青枯病的主要手段，市面上用來防治煙草青枯病的常規化學藥劑主要為無機銅、有機銅、有機氯、無機硫和有機硫類的殺菌劑[3]。然而，化學藥劑長期不合理使用導致的致病菌抗藥性和對人類健康與環境的危害不容忽視。隨著農藥減量化觀點的提出，具有安全、低毒、對病原菌高度特異等優點的生物防治更受大家關注[4]。然而，受環境條件的多變性和土壤系統的復雜性影響，其防效穩定性差、效果不理想、顯效慢，單一使用生防手段難以實現煙草青枯病的有效防控[5]。

生物-化學防治措施的聯合使用可彌補二者各自的局限性和不足，成為一種切實可行且環境友好的防治策略。國內外已對化學殺菌劑和生防菌聯用防控真菌病害展開了廣泛深入的研究[6]，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等分別與化學殺真菌劑聯用防治葡萄霜霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、橡膠樹根病等具有協同增效作用[7-11]。使用芽孢桿菌聯合化學殺細菌劑防治煙草青枯病的研究鮮有報道。前期，我們發現并鑒定了一株對煙草多種病害具有較強拮抗活性的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）AR03菌株，能有效防治煙草青枯病、黑脛病及炭疽病，而且能在煙株根際及土壤中定殖，并具有促生作用[12]。本研究將篩選可與短小芽孢桿菌相容性較好的殺細菌劑，并進行復配劑比例優化和防效的測定，為煙草青枯病的防控提供新穎和實際有效的技術支持。

1?材料與方法

1.1?材料和藥劑

供試病原菌株：于2019年廣西靖西植煙區青枯病發病植株分離得到，經分子生物學方法鑒定為強致病力的青枯雷爾氏菌（R. solanacearum）菌株，屬1號生理小種。菌株放置在NA固體培養基上于30 ℃培養48 h，挑取單菌落轉接到LB液體培養基中培養10～12 h （OD600=0.8～1.0），然后離心，收集菌體保存在25%甘油中，儲存在–80 ℃冰箱中待用。

供試生防菌：本實驗室從煙草青枯病嚴重發生的煙田土壤中分離得到的短小芽孢桿菌Bacillus pumilus AR03[12]（CGMCC No. 4117）。

供試藥劑：52%氯尿·硫酸銅可溶粉劑，購于南京南農農藥科技發展有限公司;3%中生菌素可濕性粉劑，從福建凱立生物制品有限公司獲得;40%噻唑鋅懸浮劑，購于浙江新農化工股份有限公司;35%甲霜·福美雙可濕性粉劑，購買于丹東明珠科技有限公司;20%噻菌銅懸浮劑，購買于浙江龍灣化工有限公司;42%三氯異氰尿酸可濕性粉劑，購于湖南神隆海洋生物工程有限公司;25%溴菌·壬菌銅微乳劑，購于濰坊萬勝生物農藥有限公司。

1.2?供試化學藥劑和AR03對青枯雷爾氏菌的毒力測定

毒力測定采用“改良抑菌圈法”[13-14]，先用滅菌水將每一種供試化學殺菌劑分別配制成制劑含量為25、50、100、150、200 mg/L的溶液。將滅菌晾干的直徑6 mm中性濾紙片放在每一梯度濃度的藥劑稀釋液中，浸15 s，然后用滅菌鑷子取出濾紙片瀝干剩余的藥液，將吸附藥液的4張濾紙片呈“十”字狀分別放置于培養皿中，吸取10 μL青枯雷爾氏菌液（1×108 cfu/mL），點接于培養皿中心處。以吸附無菌水處理作空白對照，每濃度3皿，然后放置在30 ℃培養箱中倒置培養48 h，全自動菌落分析儀Scan 4000（Interscience，France）測量菌落直徑（mm），計算抑菌率，求EC50值。重復3次。

參照上述方法測定AR03菌懸液抑菌能力。用LB液體培養基將短小芽孢桿菌AR03培養24 h后，配制含菌量為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109 cfu/mL的菌懸液。每重復每處理濃度3皿。重復3次。

1.3?AR03菌株與各化學藥劑的生物相容性測定

將各化學藥劑配制成制劑質量濃度為25、50、100、150、200 mg/L的LB平板，吸取AR03菌懸液100 μL，均勻涂布于培養基表面，然后放置于30 ℃恒溫培養箱中培養48 h，最后觀察菌落生長情況，全自動菌落分析儀Scan 4000 （Interscience，France）記錄菌落數量。以加等量無菌水的處理為空白對照（CK）。重復3次。

1.4?復配劑對青枯雷爾氏菌的毒力測定

1.4.1?復配劑對青枯雷爾氏菌的室內毒力測定?基于單劑毒力測定EC50結果，分別配制噻菌銅（175.21 mg/L）與短小芽孢桿菌AR03（6.84×106 cfu/mL）有效中濃度的藥液。按AR03和30%噻菌銅懸浮劑體積比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10等不同比例混合形成復配液，參照上述1.2的方法進行復配劑毒力測定，計算平均抑制率、理論抑制生長率，以加入等量無菌水為空白對照，每個處理3次重復。采用Horsfall法[15-16]進行聯合毒力的增效計算。增效比率IR計算公式：IR=Eab/Eth，式中：Eab為復配劑的實際防效，Eth為復配劑的理論防效[14-15]。IR>1為增效作用;IR=1為加和作用;IR<1為拮抗作用。

1.4.2?復配劑防治煙草青枯病室內防效測定?2020年7月在中國農業科學院煙草研究所即墨基地溫室內進行。供試煙草品種為青枯病感病品種紅花大金元和抗病品種K326，由中國農業科學院煙草研究所遺傳育種研究中心提供，育苗盤室內育苗，待煙苗長至40 d時，選擇生長健康一致的煙苗移栽至裝有混配營養土[細黃土∶營養基質=1∶1（V∶V）]的營養缽中（10 cm×12 cm），待苗齡55 d進行室內盆栽試驗。采用拌土接種法，青枯雷爾氏菌的接種量為6.5×106 cfu/g土。在煙草移栽前，每盆撒入200 g菌土（每缽裝土4 kg）。試驗處理如下：①單劑噻菌銅（EC50=175.21 mg/L）;②短小芽孢桿菌AR03菌懸液（6.84×106 cfu/mL）;③復配制劑[V30%噻菌銅懸浮劑∶VAR03=5∶5];④無菌水（對照）。每處理3次重復，每重復10株煙草，灌根20 mL/株，觀察對照組煙株

發病情況，始見病株后，每7 d調查1次病害發生情況，共調查3次[17]。采用國家標準GB/T 23222—2008《病害分級標準》調查各處理的病情指數，計算防效。

1.5?數據統計與分析

運用SPSS 16.0軟件對數據進行單因素方差分析（ANVOA），采用LSD法進行差異顯著性檢驗。

2?結?果

2.1?供試藥劑和短小芽孢桿菌AR03對青枯雷爾氏菌的毒力分析

7種供試殺細菌劑對青枯雷爾氏菌的生長均有較好的抑制作用（表1），其毒力大小依次為三氯異氰尿酸、氯尿·硫酸銅、噻菌銅、溴菌·壬菌銅、甲霜·福美雙、噻唑鋅、中生菌素，EC50值介于101.02～212.70 mg/L之間。

由表2結果可知，短小芽孢桿菌AR03濃度介于1.0×105～1.0×109 cfu/mL時，對青枯雷爾氏菌的生長抑制效果明顯，抑菌率介于26.13%～73.54%，呈現濃度依賴性。毒力回歸方程為y=0.42x+1.55，決定系數R2=0.982，EC50值為6.84×106 cfu/mL。

2.2?短小芽孢桿菌AR03與供試藥劑的相容性分析

由表3可知，7種供試藥劑與AR03的生物相容性差異較大。與短小芽孢桿菌AR03相容性最差的是三氯異氰尿酸和氯尿·硫酸銅，AR03在含有100 mg/L或以上的這兩種化學藥劑的平板中不能生長。在含有質量濃度為100 mg/L的溴菌·壬菌銅和中生菌素的平板中，AR03可零星生長。短小芽孢桿菌AR03與噻菌銅、噻唑鋅、甲霜·福美雙的相容性表現較好。100 mg/L甲霜·福美雙和噻唑鋅對AR03生長無明顯影響，但測試濃度超過150 mg/L時，AR03的生長受抑制或停止生長。噻菌銅在質量濃度200 mg/L以下，對生防菌生長抑制作用不顯著?；诠┰囁巹η嗫堇谞柺暇亩玖σ约芭c生防菌的相容性，選噻菌銅與AR03復配。

2.3?噻菌銅與短小芽孢桿菌AR03復配劑的室內毒力分析

復配劑的聯合毒力測定結果（表4）顯示具有增效作用的復配比例有V噻菌銅∶VAR03=7∶3、6∶4、5∶5、4∶6，其實際抑制率分別為53.39%、72.71%、73.92%、55.92%。其中體積比為6∶4和5∶5時，增效作用最顯著，抑制效果最好，因此，復配的最佳比例選擇V噻菌銅∶VAR03=5∶5。

2.4?噻菌銅和AR03復配劑防治煙草青枯病效果

從表5數據可知，噻菌銅和AR03復配劑灌根處理，煙草青枯病病情指數為10.67，要顯著低于噻菌銅或短小芽孢桿菌AR03單劑處理;復配劑處理組的防效為68.77%，顯著高于單劑噻菌銅和短小芽孢桿菌處理組防效（56.39%和55.22%）

3?討?論

黃小琴等[17]研究表明硫酸鏈霉素、春雷霉素、氫氧化銅、噻唑鋅、中生菌素、甲霜·福美雙、噻菌銅對煙草青枯病的EC50值在170.07～318.57 mg/L之間，以硫酸鏈霉素藥效最高;畢濤等[18]采用紙碟片法測定了3%四霉素水劑、72%硫酸鏈霉素可溶性粉劑、80%乙蒜素乳油等13種藥劑對青枯雷爾氏菌的毒力作用，研究發現3%四霉素水劑抑菌效果最好;張幸等[19]選用7種殺菌劑進行煙草青枯病田間藥效試驗，田間防效大小依次為25%溴菌-壬菌銅微乳劑>20%噻菌銅懸浮劑>XQ生防菌劑>72%農用鏈霉素可濕性粉劑>4%春雷霉素。農用鏈霉素已在我國禁用，且上述室內毒力測定工作為5年前開展的，時效性較差。本研究采用改良抑菌圈法測定了7種已登記于青枯病防治的化學殺細菌劑對廣西煙區青枯病菌的毒力作用，發現7種殺菌劑均可有效抑制病菌的生長，平均EC50值介于101.02～212.70 mg/L之間，且毒力大小依次為三氯異氰尿酸>氯尿·硫酸銅>噻菌銅>甲霜·福美雙>噻唑鋅>中生菌素。本研究結果與上述研究[17-19]有較大差異，可能與青枯病原菌分離地用藥背景和所分離菌株有關。

近年來，生物藥劑聯合化學藥劑協同防治作物真菌病害的相關研究報道較多，而且其協同增效作用明顯，展現了生防微生物與化學殺菌劑的潛在相容性[6]。JI等[11]研究表明甲基營養型芽孢桿菌TA-1菌株與氟醚菌酰胺的相容性較好，二者復配使用對番茄灰霉菌菌絲生長的抑制效果顯著高于單劑處理，且甲基營養型芽孢桿菌TA-1（108 cfu/mL）與氟醚菌酰胺（50 g/hm2）聯合施用的室內防效可達到70.16%，較單劑施用組有明顯提高。KIM等[20]研究表明解淀粉芽孢桿菌JCK-12菌株可增加小麥赤霉病對化學殺菌劑的敏感性，室內防效達到96.40%，田間防效達到91.00%。陳志誼等[21]研究發現芽孢桿菌能與半量的井崗霉素協同防治水稻紋枯病，并使芽孢桿菌更好地定殖在水稻上?；诨瘜W殺真菌劑作用靶標的單一性和作用機制的特異性，生防細菌與大部分真菌殺菌劑的相容性、復合度高。然而生防細菌和殺細菌劑相容性較差，復合難度較大。目前，生防細菌與殺細菌劑復配防治細菌性植物病害的研究實例較少。PENG等[22]研究發現100 mg/L噻森銅對枯草芽孢桿菌B-001生長無影響，將枯草芽孢桿菌B-001菌株與登記用量減半的30%噻森銅懸浮劑復配對番茄青枯病的室內盆栽和大田防效均明顯高于單獨施用，表現出協同作用。黃小琴等[17]在煙草青枯病生防芽孢桿菌協同防治藥劑的篩選和復配研究中發現，農用硫酸鏈霉素與解淀粉芽孢桿菌Bs2-4相容性較好，菌藥聯用防治青枯病的防效明顯高于兩者單獨使用的處理，且能使化學農藥減量。本研究中的革蘭氏陽性生防菌短小芽孢桿菌AR03濃度高于1.0×107 cfu/mL時對青枯雷爾氏菌的室內防效在50%以上。毒力測定及生物相容性分析發現短小芽孢桿菌對甲霜·福美雙、噻唑鋅、噻菌銅3種供試殺菌劑耐藥性強，生物相容性較好，在噻菌銅含量為200 mg/L平板中仍能正常生長，兩者以5∶5的比例復配使用對煙草青枯病的室內盆栽防效達到68.77%，增效明顯，同時降低化學農藥使用量一半以上。菌藥聯用不僅可以抑制土壤生境中病原菌的生長，還可以幫助生防菌在復雜的土壤系統中定殖，形成優勢種群[6]。除此之外，菌藥聯用可增加生防菌次生代謝物質等的分泌（揮發性物質和抗菌蛋白或酶）和增強寄主防御反應[6，23]。短小芽孢桿菌AR03菌株能夠產生具有較強抑菌活性的揮發性有機物倍半萜烯類化合物，且對煙草具有較好的促生作用[12]。為此，其菌藥聯合增效機制如菌藥聯用后短小芽孢桿菌揮發性代謝產物、植物抗病性及活體競爭和定殖能力的關系等還需深入探索。同時，為了拓展其應用前景，本研究下一步將對菌藥聯用的田間藥效展開研究。

4?結?論

本研究結果表明，7種供試殺菌劑對青枯雷爾氏菌的生長均有較好的抑制作用，毒力大小依次為三氯異氰尿酸、氯尿·硫酸銅、噻菌銅、甲霜·福美雙、噻唑鋅、中生菌素;短小芽孢桿菌AR03濃度為1.0×107 cfu/mL時，對青枯雷爾氏菌的抑菌率大于50%。7種供試藥劑中與AR03的生物相容性較好的為噻菌銅、甲霜·福美雙、噻唑鋅。噻菌銅（EC50=0.625 3 μg/mL）與AR03（EC50=6.46×107 cfu/mL）復配劑在體積比5∶5時，對煙草青枯病的室內防治效果顯著，增效作用明顯，增效比率值IR值為1.482。

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