普通煙草NtNAC055基因的克隆、鑒定及表達分析

王奇 李曉旭 郭存 郭永峰

摘?要：NAC家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，在植物生長發育以及應對環境脅迫中起著至關重要的作用，克隆和驗證煙草中NAC相關基因可為煙草抗性育種提供理論依據。本研究采用RT-PCR方法從普通煙草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，對NtNAC055及其編碼蛋白進行了生物信息學分析、表達模式分析、亞細胞定位和轉錄激活等相關試驗。結果發現，NtNAC055基因的CDS序列全長為1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC結構域，編碼一個具有343個氨基酸的NAC轉錄因子;通過進化分析發現，煙草NtNAC055與擬南芥ANAC055同源性較高，同屬于RD26亞家族;通過亞細胞定位分析以及轉錄激活分析發現，NtNAC055蛋白在細胞核中且具有轉錄激活活性;運用qRT-PCR技術，對該基因不同組織和脅迫處理后的表達進行了分析，結果顯示，NtNAC055基因在根、莖、葉、花和腋芽中均有表達，且在根部表達量最高;同時，該基因受干旱和熱脅迫的誘導，表明煙草NtNAC055基因可能參與了煙草的非生物脅迫應答反應。

關鍵詞：煙草;NtNAC055;非生物脅迫;干旱;基因表達

Abstract： NAC family is one of the largest transcription factor families in plants， and plays a significant regulatory role in plant development， signal transduction and abiotic stress response. Cloning and validation of NAC related genes in tobacco can provide a theoretical basis for tobacco breeding for stress tolerance. In this study， NtNAC055 was cloned from root cDNA of cv. K326 by RT-PCR. In addition， bioinformatics analysis， expression pattern analysis， subcellular localization and transactivation activity analysis of NtNAC055 were performed. The results showed that the full-length of NtNAC055 was 1032 bp， and the NtNAC055 protein was 343 aa that contained a typical NAC domain. Phylogenetic analysis indicated that NtNAC055 had high homology with ANAC055 from Arabidopsis. Subcellular localization and transactivation analyses showed that NtNAC055 was localized in the nucleus and had transactivation activities. The expressions of NtNAC055 were analyzed by qRT-PCR in different tissues of tobacco， and in seedlings under different abiotic stresses. The results showed that NtNAC055 was expressed in tobacco roots， stems， leaves， flowers and axillary buds， especially in roots. The expression levels of NtNAC055 were induced under drought and heat stresses， which indicated that NtNAC055 might be involved in tobacco abiotic stress responses.

Keywords： tobacco; NtNAC055; abiotic stress; drought; gene expression

NAC（NAM， AFAT， CUC）轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子[1]，SOUER等[2]從矮牽牛中克隆到第一個NAC轉錄因子NAM（No Apical Meristem），該轉錄因子家族成員作為重要的調控因子廣泛參與了植物生長發育過程，包括葉片衰老[3-4]，側根發育[5-7]，果實成熟[8]，次生壁形成[9-10]和植物激素信號轉導[11-13]等。同時，有很多文獻報道NAC轉錄因子家族成員在植物響應非生物脅迫中也發揮著重要的作用[14]。過表達ANAC072、ANAC019和ANAC055基因時，轉基因擬南芥植株的耐旱性顯著提高[15]，并可以促進擬南芥干旱應答基因的表達。ANAC072可被多種生物、非生物脅迫誘導表達，包括脫落酸（ABA），NaCl，干旱，茉莉酸（JA）等[15-18]。在豆科植物中間錦雞兒中，過表達ANAC055的同源基因CiNAC4提高了轉基因植株的耐鹽性[19]。在玉米中，ZmNAC55基因在干旱、鹽等非生物脅迫處理下被顯著誘導，且過表達ZmNAC55的擬南芥植株對干旱的抗性明顯增強[20]。在水稻中，過表達OsNAC9基因可以有效提高轉基因水稻植株的耐旱性[21]。沙冬青在干旱、鹽、低溫和高溫脅迫以及施加外源ABA的條件下，AmNAC3、AmNAC4、AmNAC5的表達量均可被誘導上調。將3個基因分別轉入到擬南芥中，AmNAC3過表達株系的耐鹽性得到顯著提高，AmNAC4和AmNAC5基因可以提高耐鹽性和抗旱性[22]。煙草在不同的非生物脅迫和植物激素處理下，NtNAC072基因的表達可被NaCl、干旱以及ABA顯著誘導，說明NtNAC072基因可能在煙草處于干旱脅迫和鹽脅迫等非生物逆境下起著重要的作用[23]。徐小艷等[24]將NtNAC1基因轉入野生型煙草植株中，在使用甘露醇模擬干旱條件下，其過表達株系根長較野生型長，證實了NtNAC1基因具有增強植株抗旱性的功能。代婷婷等[25]將NtNAC4基因轉入普通煙草中，在干旱處理下，轉基因煙草幼苗根長與對照相比沒有受到明顯的抑制，表明過表達NtNAC4基因提高了植株的抗旱能力。

煙草（Nicotiana tabacum L.）為茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotiana）特種經濟作物，在我國的大部分地區都有種植。高溫、干旱、冷害、高鹽等極端環境嚴重影響了煙草的生長發育，進而對其品質造成損害。本研究運用RT-PCR的方法對NtNAC055基因進行分離克隆，對其表達模式、亞細胞定位以及轉錄激活活性進行分析，旨在探討煙草抗逆性的調控機制和內在機理，為后期培育抗逆新品種提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

種植材料為普通煙草K326。DH5α大腸桿菌感受態細胞和亞克隆載體購自北京全式金公司，GV3101農桿菌感受態細胞和AH109酵母感受態細胞購自博邁德生物公司。GFP標簽載體pYG56-GFP和pBridge載體由本實驗室保存。同源重組酶（Infusion）、PrimeSTAR Max DNA Polymerase購自寶生物工程（大連）有限公司，限制性內切酶購自NEB公司。植物總RNA提取試劑Trizol購自康為世紀生物科技有限公司，反轉錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit、qRT-PCR試劑、酵母培養基購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA膠回收和質粒提取試劑盒購自天根公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?煙草材料種植和處理?供試普通煙草品種K326于2020年5月種植在中國農業科學院煙草研究所氣候室。對K326種子進行消毒，首先用75%酒精浸泡20 s，無菌水洗2次，再用15%的H2O2浸泡8～12 min，最后再用無菌水洗4～5次。將消毒過的煙草種子均勻地鋪在MS固體培養基上，待長至4片真葉期，將長勢一致的煙苗分別轉移到含有100 mmol/L NaCl、10 μmol/L ABA、PEG-6000（5%）的相應培養基上，在4 ℃和37 ℃光照培養箱中模擬低溫脅迫和熱脅迫。在處理時間為0、1、3和6 h時對處理的煙苗進行整株采樣，每個處理每次采集3株，每株作為一個生物學重復，液氮速凍后轉移至–80 ℃冰箱中保存、備用。

將MS固體培養基上長勢一致的4片真葉期煙苗移栽至裝有營養土的花盆里，置于氣候室正常培養。在煙株盛花期，采集正常生長植株的根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、花及腋芽。根部組織取樣時，將煙草根系部位營養土用水輕輕沖洗干凈，剪取側根。采集樣品時，先將樣品放入液氮中，然后轉移至–80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2?總RNA的提取、反轉錄?將采集的不同組織樣品以及脅迫處理的樣品在液氮中研磨至粉末，使用Trizol試劑提取各樣品的總RNA，并利用反轉錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit對提取的總RNA進行cDNA第一鏈的合成，將反轉后的cDNA置于–20 ℃保存，備用。

1.2.3?NtNAC055基因的克隆?以擬南芥ANAC055蛋白序列為query序列，在茄科基因組數據庫（http：//solgenomics.net/）中進行Blast P比對，獲得候選基因（Nitab4.5_0001204g0100.1），根據基因的編碼區設計PCR擴增引物（NtNAC055-F：5'-ATGGGTGTTCAGGAAATGGACC-3';NtNAC05 5-R 5'-TTACCGACTGAAACCCATATTCACT-3'），以普通煙草K326根部cDNA為模板，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進行基因擴增。PCR反應體系為：PrimeSTAR?Max Premix 25 μL，引物F 1.5 μL，引物R 1.5 μL，cDNA 1.5 μL，用ddH2O補充至50 μL。PCR反應程序：98 ℃變性10 s，55 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸20 s;32個循環。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將1000 bp左右的目的條帶切下經凝膠回收純化試劑盒回收純化，回收的目的片段與亞克隆載體連接，取5 μL連接產物轉化至DH5α細胞中，在LB固體培養基上（Kan 100 μg/ml）37 ℃培養，進行篩選，挑取經PCR鑒定為陽性的單克隆送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4?NtNAC055基因生物信息學分析?使用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具，在線分析NtNAC055蛋白的分子量、理論等電點。在擬南芥基因組數據庫TAIR（www.arabidopsis.org）下載擬南芥ATAF1、ATAF2、AtNAP、RD26、ANAC055、ANAC019、AtNAC2和AtNAC3等脅迫相關的NAC轉錄因子蛋白序列。在茄科基因組數據庫（http：//solgenomics.net/）中下載馬鈴薯StNAC053、StNAC055和StNAC101等脅迫相關的NAC轉錄因子蛋白序列[26]。在植物基因組數據庫EnsemblPlants（https：//plants.ensembl.org/ index.html）中下載其他物種脅迫相關NAC轉錄因子蛋白序列，包括水稻OsNAC4、OsNAC10，小麥TaNAC29、TaNAC2、TaNAC67，大豆GmNAC6、GmNAC11。利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線軟件進行NAC蛋白序列的保守基序（motif）分析，并使用DNAMAN進行多序列比對[27]，運用MEGA6構建系統樹。

1.2.5?NtNAC055基因亞細胞定位分析?參照文獻[28]對NtNAC055基因進行亞細胞定位分析。用Spe I單酶切質粒載體pYG56-GFP，使用同源重組酶（Infusion）將去掉終止密碼子的NtNAC055基因編碼序列連接到帶有GFP標簽的亞細胞定位載體上，即獲得融合表達載體35S：： NtNAC055-GFP。將構建好的融合質粒轉化至GV3101農桿菌感受態細胞中，以只含有GFP標簽的質粒農桿菌菌株為對照。將P19與目標菌等比例混合后，注射到正常生長4～5周的本氏煙草葉片背部，做好標記，避光培養1 d后正常培養2 d，取少量注射的煙草葉片在激光共聚焦顯微鏡TCS-SP8（德國Leica公司）488 nm激發光波長下觀察GFP信號。

1.2.6?NtNAC055基因轉錄激活試驗?參照文獻[29]對NtNAC055基因進行轉錄激活活性試驗。用EcoR I單酶切質粒載體pBridge，使用同源重組酶將NtNAC055基因編碼序列連接到pBridge載體中，構建NtNAC055與GAL4BD融合載體。將GAL4BD-NtNAC055重組質粒與pBridge空白載體分別轉入AH109酵母感受態細胞中，然后在缺少色氨酸的培養基（SD/-Trp）上進行陽性克隆的篩選，隨后將陽性克隆轉移至加有X-gal的缺素培養基（SD/-Trp/X-gal）上，避光培養3～4 d至顯色。

1.2.7?NtNAC055基因表達模式分析?采取qRT-PCR技術對NtNAC055基因的表達模式進行分析。根據NtNAC055基因的編碼序列設計熒光定量引物，NAC055-qRT-F：5'-CCGACTGACGAGGAG CTTTT-3';NAC055-qRT-R：5'-TTGGTCGTGATCC ATTCGGG-3'，采用煙草26S rRNA基因（26S-F：5'-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3';26S-R：5'-TC TCCCTTTAACACCAACGG）作為管家基因[30]。提取鹽、脫落酸、PEG6000、4 ℃和37 ℃處理的煙草幼苗的總RNA，使用儀器ABI 7500（美國ABI公司）進行qRT-PCR，設3次生物學重復。

2?結?果

2.1?NtNAC055基因的克隆與序列分析

根據茄科數據庫BlastP比對結果，設計煙草NtNAC055基因的特異性擴增引物，以K326根部cDNA為模板進行PCR擴增，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在泳道2內有一條清晰的條帶，處在1000 bp附近（圖1），泳道1作為陰性對照，回收純化后連接亞克隆載體，測序結果顯示，NtNAC055基因CDS全長為1032 bp，編碼343個氨基酸。采用ExPASy ProtParam工具預測其分子量和理論等電點，結果顯示：NtNAC055蛋白分子量為38.7 kDa，理論等電點（pI）為7.06。

將煙草NtNAC055蛋白序列與擬南芥、馬鈴薯、小麥、水稻和大豆中的NAC轉錄因子蛋白序列進行多序列比對（圖2），序列比對分析發現，NtNAC055蛋白序列N端具有保守的典型NAC結構域Subdomain A-E，在Subdomain D中發現保守的核定位信號（NLS），而其C端序列一致性非常低，推測該區域可能與NAC蛋白的轉錄激活功能相關。

2.2?NtNAC055的進化樹分析與保守基序分析

使用MEGA6軟件對煙草NtNAC055轉錄因子與其他物種中的NAC轉錄因子進行系統進化分析，建立進化樹（圖3）。從圖3可以看出，煙草NtNAC055與擬南芥ANAC055、ANAC072聚在一起，同屬于RD26亞家族。使用在線軟件MEME對NAC蛋白序列的保守基序進行分析發現，RD26亞家族內的NAC轉錄因子家族成員具有6個相同的保守基序且所處位置基本一致。而且NtNAC055與擬南芥ANAC055聚在同一小支內，推測兩者在功能上可能具有相似性。

2.3?NtNAC055蛋白的亞細胞定位分析

為確定NtNAC055的亞細胞定位，以攜帶35S：： NtNAC055-GFP的農桿菌和攜帶35S：：GFP的農桿菌（陰性對照）侵染煙草葉片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP信號，進行NtNAC055蛋白的亞細胞定位（圖4），從圖中可以看出，NtNAC055-GFP融合蛋白定位于細胞核中，與核指示劑DAPI共定位，而對照的GFP信號在細胞膜、細胞核均有表達，說明NtNAC055蛋白定位于細胞核。

2.4?NtNAC055的轉錄激活活性分析

為了確定NtNAC055是否具有轉錄激活活性，分別將GAL4BD-NtNAC055融合載體和GAL4BD空載體（對照）轉化至AH109酵母感受態中，在缺少色氨酸的培養基（SD/-Trp）上均生長良好，隨后將生長良好的酵母單克隆轉移至缺少色氨酸的顯色培養基（SD/-Trp/X-gal）上，在30 ℃培養箱中倒置避光培養。如圖5所示，只有轉化了GAL4BD-NtNAC055融合載體的酵母表達菌株在SD/-Trp/X-gal培養基上顯示藍色，而只有GAL4BD的對照酵母菌株沒有顯示藍色，表明NtNAC055蛋白具有轉錄激活活性。

2.5?NtNAC055基因的表達模式分析

利用實時熒光定量PCR檢測了煙草不同組織中NtNAC055基因的表達量，結果表明，在根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、花、腋芽中NtNAC055基因均有表達，其中在根部的表達量最高，在莖中的表達量最低。另外，在衰老葉片中的表達量是幼葉的3.98倍，是成熟葉片的2.41倍（圖6A）。

對NtNAC055基因在不同脅迫及ABA處理下的表達量進行分析，可知NtNAC055基因受多種脅迫和ABA的誘導和調控。在干旱處理6 h內，NtNAC055基因的表達量隨干旱處理時間增加而顯著提高（圖6B），處理1 h時表達量為對照（0 h）的8.1倍，處理3 h時為對照的11.8倍，處理6 h時達到最高，為對照的22.4倍。在熱脅迫下，處理1 h時表達量為對照（0 h）的2.2倍，而處理3 h和6 h時表達量出現了逐漸下降的趨勢（圖6C）。在鹽（圖6D）、低溫（圖6E）脅迫和ABA（圖6F）處理下，表達量均呈現下調的趨勢。結果表明，NtNAC055基因可能在煙草受到干旱和熱脅迫時發揮重要的作用;而在受到鹽、低溫脅迫和ABA處理時NtNAC055基因的表達量也受到顯著的調控，但與干旱脅迫時的響應模式存在明顯的差異。

3?討?論

NAC轉錄因子是植物最大的轉錄因子家族之一，參與了植物的生長發育、逆境脅迫[3-7，14]等，其中ANAC019、ANAC055、ANAC072（RD26）屬于脅迫相關轉錄因子（SNAC-A）亞家族的成員[31]，可以調控非生物應答基因的表達[16]。

本研究從普通煙草K326根部cDNA中克隆到脅迫相關基因NtNAC055，全長1032 bp，編碼343個氨基酸殘基。與其他物種NAC蛋白進行序列比對，結果發現，NtNAC055蛋白具有NAC轉錄因子家族典型的NAC結構域。系統進化表明，NtNAC055與RD26亞家族中的成員ANAC055聚在一起，且蛋白保守基序具有較高的一致性，暗示兩者具有相似的生物學功能。亞細胞定位試驗表明，NtNAC055定位在細胞核中。此外，轉錄激活結果表明，轉錄因子NtNAC055具有轉錄激活活性。表達模式分析發現，NtNAC055基因在葉片和根中高表達。特別的，NtNAC055表達量隨著葉片衰老過程逐漸上升，在衰老葉片中的表達量分別是幼葉和成熟葉的3.98倍和2.41倍，暗示NtNAC055可能在葉片衰老中發揮重要的調控作用。

有研究表明，在十字花科菜心中，BrNAC055基因在衰老葉片中上調表達，過表達BrNAC055基因能夠促進葉片衰老[32]。表達模式分析發現，在煙草中NtNAC055基因在衰老葉片中表達量上升（圖6A），暗示NtNAC055基因很可能在煙草中參與葉片衰老落黃的調控過程。在擬南芥中ANAC055基因受干旱、鹽等非生物脅迫的誘導，同時過表達ANAC055基因可以顯著提高植株的耐旱性[15]。在其他物種中，ANAC055的同源基因也被報道廣泛參與非生物逆境的響應和調控過程。在玉米中，ZmNAC55基因在干旱、鹽、低溫和ABA處理下被顯著誘導，且過表達ZmNAC55的擬南芥植株對干旱的抗性明顯增強[20]。在甘藍型油菜中，BnaNAC55基因受冷、熱、ABA等非生物脅迫的誘導[33]。在新疆小擬南芥中，ApNAC055基因被鹽脅迫顯著誘導，提示該基因可能參與小擬南芥鹽脅迫響應[34]。在豆科植物中間錦雞兒中，ANAC055的同源基因CiNAC4基因同時響應干旱、鹽、熱、冷和ABA，在擬南芥中過表達CiNAC4基因提高了轉基因植株的耐鹽性[19]。本研究中，NtNAC055基因能夠被干旱和熱脅迫誘導，同時響應ABA、鹽和冷脅迫，暗示NtNAC055基因可能參與多種非生物逆境的響應和調控過程。

4?結?論

試驗結果表明，NtNAC055基因為擬南芥ANAC055的同源基因，編碼典型的NAC轉錄因子，NtNAC055蛋白只在細胞核內表達，為核定位的轉錄因子且具有轉錄激活活性。NtNAC055基因在煙草根部高量表達，而且同時受到干旱脅迫和熱脅迫的誘導。說明NtNAC055基因可能在煙草響應干旱脅迫、熱脅迫等逆境方面起重要的調控作用。本研究結果有利于進一步探討煙草抗逆性的調控機制和內在機理，后續研究將利用過表達、基因編輯等手段深入探索NtNAC055基因功能，為煙草抗逆育種提供理論依據和育種中間素材。

參考文獻

[1]OLSEN A N， ERNST H A， LEGGIO L L， et al. NAC transcription factors： structurally distinct， functionally diverse[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（2）： 79-87.

[2]SOUER E， VAN A H， KLOOS D， et al. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J]. Cell， 1996， 85（2）： 159-170.

[3]GUO Y F， GAN S S. AtNAP， a NAC family transcription factor， has an important role in leaf senescence[J]. The Plant Journal， 2006， 46（4）： 601-612.

[4]KIM Y S， SAKURABA Y， HAN S H， et al. Mutation of the Arabidopsis NAC016 transcription factor delays leaf senescence[J]. Plant Cell Physiology， 2013， 54： 1660-1672.

[5]YANG X， KIM M Y， HA J， et al. Overexpression of the soybean NAC gene GmNAC109 increases lateral root formation and abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants[J]. Frontiers in Plant Science， 2019， 10： 1036-1047.

[6]XIE Q， FRUGIS G， COLGAN D， et al. Arabidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development[J]. Genes & Development， 2000， 14（23）： 3024-3036.

[7]HE X J， MU R L， CAO W H， et al. AtNAC2， a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways， is involved in salt stress response and lateral root development[J]. The Plant Journal， 2005， 44（6）： 903-916.

[8]NIEUWENHUIZEN N J， CHEN X， WANG M Y， et al. Natural variation in monoterpene synthesis in kiwifruit： transcriptional regulation of terpene synthases by NAC and ETHYLENE-INSENSITIVE3-like transcription factors[J]. Plant Physiology， 2015， 167（4）： 1243-1258.

[9]MITSUDA N， SEKI M， SHINOZAKI K， et al. The NAC transcription factors NST1 and NST2 of Arabidopsis regulate secondary wall thickenings and are required for anther dehiscence[J]. The Plant Cell， 2005， 17（11）： 2993-3006.

[10]ZHANG J， HUANG G Q， ZOU D， et al. The cotton （Gossypium hirsutum） NAC transcription factor （FSN1） as a positive regulator participates in controlling secondary cell wall biosynthesis and modification of fibers[J]. New Phytologist， 2018， 217（2）： 625-640.

[11]SHAHNEJAT-BUSHEHRI S， TARKOWSKA D， SAKURABA Y， et al. Arabidopsis NAC transcription factor JUB1 regulates GA/BR metabolism and signalling[J]. Nature Plants， 2016， 2（3）： 16013-16021.

[12]CHEN X， LU S， WANG Y， et al. OsNAC2 encoding a NAC transcription factor that affects plant height through mediating the gibberellic acid pathway in rice[J]. The Plant Journal， 2015， 82（2）： 302-314.

[13]CAO L， YU Y， DING X， et al. The Glycine soja NAC transcription factor GsNAC019 mediates the regulation of plant alkaline tolerance and ABA sensitivity[J]. Plant Molecular Biology， 2017， 95（3）： 253-268.

[14]SHAO H， WANG H， TANG X. NAC transcription factors in plant multiple abiotic stress responses： progress and prospects[J]. Frontiers in Plant Science， 2015， 6： 902-909.

[15]TRAN L S P， NAKASHIMA K， SAKUMA Y， et al. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter[J]. The Plant Cell， 2004， 16（9）： 2481-2498.

[16]NAKASHIMA K， TAKASAKI H， MIZOI J， et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Gene Regulatory Mechanisms， 2012， 1819（2）： 97-103.

[17]FUJITA M， FUJITA Y， MARUYAMA K， et al. A dehydration-induced NAC protein， NAC055， is involved in a novel ABA-dependent stress-signaling pathway[J]. The Plant Journal， 2004， 39（6）： 863-876.

[18]CHUNG Y， KWON S I， CHOE S. Antagonistic regulation of Arabidopsis growth by brassinosteroids and abiotic stresses[J]. Molecules and Cells， 2014， 37（11）： 795-803.

[19]HAN X M， FENG Z Q， XING D D， et al. Two NAC transcription factors from Caragana intermedia altered salt tolerance of the transgenic Arabidopsis[J]. BMC Plant Biology， 2015， 15（1）： 208-219.

[20]MAO H D， YU L J， HAN R， et al. ZmNAC55， a maize stress-responsive NAC transcription factor， confers drought resistance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Physiology & Biochemistry， 2016， 105： 55-66.

[21]REDILLAS M C F R， JEONG J S， KIM Y S， et al. The overexpression of OsNAC9 alters the root architecture of rice plants enhancing drought resistance and grain yield under field conditions[J]. Plant Biotechnology Journal， 2012， 10（7）： 792-805.

[22]任美艷. 沙冬青三個抗逆相關NAC轉錄因子基因的克隆與功能研究[D]. 呼和浩特：內蒙古農業大學，2019.

REN M Y. Cloning and functional analysis of three stress-related NAC transcription factor genes from Ammopiptanthus mongolicus[D]. Inner Mongolia Agricultural University， 2019.

[23]李曉旭，郭存，劉成，等. 普通煙草NtNAC072基因的克隆、鑒定及表達模式分析[J]. 煙草科技，2019，52（3）：10-17.

LI X X， GUO C， LIU C， et al. Cloning， characterization and expression pattern analysis of NtNAC072 gene in Nicotiana tabacum[J]. Tobacco Science & Technology， 2019， 52（3）： 10-17.

[24]徐小艷，姚新轉，呂立堂，等. 煙草NtNAC1基因的克隆及其在煙草中的抗旱功能分析[J]. 植物生理學報，2018，54（6）：1085-1094.

XU X Y， YAO X Z， LYU L T， et al. Cloning of NtNAC1 gene from Nicotiana tabacum and its analysis of drought-resistant function[J]. Plant Physiology Journal， 2018， 54（6）： 1085-1094.

[25]代婷婷，姚新轉，呂立堂，等. 煙草NAC4基因的克隆及其抗旱功能分析[J]. 農業生物技術學報，2018，26（5）：764-773.

DAI T T， YAO X Z， LYU L T， et al. Cloning and drought-resistant function analysis of NAC4 gene in tobacco （Nicotiana tabacum） [J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2018， 26（5）： 764-773.

[26]SINGH A K， SHARMA V， PAL A K， et al. Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription factor family in potato （Solanum tuberosum L） [J]. DNA Research， 2013， 20（4）： 403-423.

[27]劉成，李曉旭，蘇玉龍，等. 普通煙草SBP轉錄因子家族的全基因組鑒定及其進化和表達分析[J]. 中國煙草科學，2015，36（4）：

1-11.

LIU C， LI X X， SU Y L， et al. Genome-wide identification， phylogenetic analysis and expression profiling of the SBP transcription factor family in Nicotiana tabacum[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36（4）： 1-11.

[28]LI X X， HAMYAT M， LIU C， et al. Identification and characterization of the WOX family genes in five Solanaceae species reveal their conserved roles in peptide signaling[J]. Genes， 2018， 9（5）： 260-279.

[29]孫晉浩，牛文利，陳志華，等. 煙草 NtbHLH112 基因的克隆、鑒定及表達模式分析[J]. 中國煙草科學，2020，41（5）：8-14.

SUN J H， NIU W L， CHEN Z H， et al. Cloning， characterization and expression pattern analysis of NtbHLH112 gene in Nicotiana tabacum[J]. Chinese Tobacco Science， 2020， 41（5）：8-14.

[30]王姍姍，趙影影，李超杰，等. 煙草轉錄因子MYB12基因克隆及表達模式分析[J]. 煙草科技，2017，50（8）：1-9.

WANG S S， ZHAO Y Y， LI C J， et al. Cloning and expression analysis of transcription factor gene MYB12 from Nicotiana tabacum[J]. Tobacco Science & Technology， 2017， 50（8）： 1-9.

[31]HICKMAN R， HILL C， PENFOLD C A， et al. A local regulatory network around three NAC transcription factors in stress responses and senescence in Arabidopsis leaves[J]. The Plant Journal， 2013， 75（1）： 26-39.

[32]FAN Z Q， TAN X L， CHEN J W， et al. BrNAC055， a novel transcriptional activator， regulates leaf senescence in Chinese flowering cabbage by modulating reactive oxygen species production and chlorophyll degradation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2018， 66（36）： 9399-9408.

[33]NIU F， WANG C， YAN J， et al. Functional characterization of NAC55 transcription factor from oilseed rape （Brassica napus L.） as a novel transcriptional activator modulating reactive oxygen species accumulation and cell death[J]. Plant Molecular Biology， 2016， 92（1-2）： 89-104.

[34]林軍，張亮，黃先忠. 新疆小擬南芥NAC轉錄因子ApNAC055的克隆及表達分析[J]. 石河子大學學報（自然科學版），2017，35（6）：747-753.

LIN J， ZHANG L， HUANG X Z. Molecular cloning and expression analysis of ApNAC055 from Arabidopsis pumila[J]. Journal of Shihezi University （Natural Science）， 2017， 35（6）： 747-753.