補腎活血方對腎虛血瘀型不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)未孕患者分泌晚期血清中VEGF、TGF-β1的影響

魏爽

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

婦女妊娠不足28 周，胎兒體質(zhì)量不足1 000 g而終止妊娠稱為流產(chǎn)，與同一性伴侶連續(xù)2 次及2 次以上發(fā)生自然流產(chǎn)稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）[1]。其發(fā)病機制十分復(fù)雜，除目前已知的如遺傳、內(nèi)分泌、解剖、感染及環(huán)境等因素外，大約半數(shù)以上患者的發(fā)病原因尚不明確，被稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[2]。處于“接受態(tài)”的內(nèi)膜和具備侵入能力的胚胎是妊娠發(fā)生并維持的不可或缺的條件。妊娠中蛻膜化作為一個復(fù)雜而精密的生物過程極為關(guān)鍵，子宮內(nèi)膜蛻膜化過程的不正常不但可以引起著床失敗，而且還是流產(chǎn)反復(fù)發(fā)生的一個重要原因。蛻膜化一般發(fā)生在月經(jīng)周期的第23 天左右，可以理解為為了胚胎順利植入子宮內(nèi)膜組織所發(fā)生的一系列重塑過程。蛻膜化從血管周圍開始，逐漸發(fā)展至整個宮腔，是一個廣泛的改變，其過程伴隨著大批的血管形成與重塑。血管的形成在蛻膜化中十分重要，這些血管為胚胎提供了賴以生長發(fā)育的血供及營養(yǎng)，對正常妊娠的維持至關(guān)重要。而血管生成是在多種血管生成因子相互協(xié)調(diào)配合作用下進行的，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-beta 1， TGF- β1）與 血 管 內(nèi) 皮 生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的作用尤為突出。因此我們推測，VEGF 及TGF-β1 可能通過參與子宮內(nèi)膜血管的生成行為來改變子宮內(nèi)膜蛻膜化過程，從而影響妊娠結(jié)局。

中醫(yī)學(xué)中，URSA 當屬于“滑胎”范疇，其病因病機主要為肝脾腎等臟腑功能失調(diào)，影響沖任，沖任損傷，胎元失固，從而出現(xiàn)滑胎的不良妊娠結(jié)局。《景岳全書·婦人規(guī)》中明確提出要以“預(yù)培其損”作為滑胎的治療原則。中醫(yī)藥以其獨特的理論體系、多系統(tǒng)和多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用以及安全有效、副作用少的特點，在滑胎治療過程中發(fā)揮著其他治療手段無可媲美的優(yōu)勢。查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，前人對滑胎的機制主要分為母體沖任損傷及胎元不固兩個方面，腎虛、脾腎兩虛、氣血兩虛、血瘀、外傷及血熱等為臨床上常見病因。以虛則補之、孕前治療為主要治療原則，固腎安胎是其關(guān)鍵，給予URSA 患者補腎活血方加減治療臨床療效顯著。本研究通過觀察補腎活血方對腎虛血瘀型URSA 未孕患者分泌晚期血清中VEGF、TGF-β1 影響，以探討補腎活血方對URSA 患者的治療優(yōu)勢及作用機理，同時也為補腎活血方孕前治療URSA提供有力的臨床依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組選取80例于2018年4月至2019年3月期間到黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科門診及住院部就診并明確診斷為腎虛血瘀型的URSA 未孕患者作為給藥組，年齡23～40 歲，平均年齡（30.75 ± 4.02）歲。采用數(shù)字隨機表將給藥組患者隨機分為補腎活血方組（試驗組）和阿司匹林組（對照組），每組各40例。另選取40例同期在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科門診及住院部接受體檢的既往妊娠史正常的未孕婦女為正常組，年齡23～40歲，平均年齡（33.8±3.74）歲。本研究已獲得黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的審核批準，并在研究對象知情同意情況下收集相關(guān)生物血清樣本。

1.2 診斷標準西醫(yī)診斷標準：參照謝幸等主編的第8 版《婦產(chǎn)科學(xué)》[3]中有關(guān)URSA 的診斷標準。中醫(yī)診斷標準：參照《中醫(yī)婦科學(xué)》[4]《中醫(yī)診斷學(xué)》[5]《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[6]中的相關(guān)標準并結(jié)合臨床實際修改制定腎虛血瘀型的中醫(yī)證型診斷標準。

1.3 納入標準

1.3.1 病例納入標準 ①符合上述URSA 的診斷標準；②中醫(yī)證型為腎虛血瘀型；③既往月經(jīng)規(guī)律，周期在28～30 d；④未經(jīng)過任何治療；⑤無有害毒物接觸史；⑥近期無病毒或寄生蟲感染；⑦尿妊娠試驗陰性、血中β 絨毛膜促性腺激素（β-HCG）＜5 U/L 且用藥期間避孕；⑧無精神類疾患，無血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及風濕類等全身系統(tǒng)疾病，且肝腎功能無異常；⑨近3個月內(nèi)未曾服用任何激素類藥物；⑩知情并同意參加本研究的患者。

1.3.2 正常組納入標準 ①尿妊娠試驗陰性、血β-HCG＜5 U/L 且3 個月內(nèi)避孕；②既往有一次或一次以上正常生育史且生產(chǎn)子女均健康；③既往無自然流產(chǎn)史；④夫妻無遺傳病史；⑤無精神類疾患，無血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及風濕類等全身系統(tǒng)疾病，且肝腎功能無異常；⑥近3個月內(nèi)未曾服用任何激素類藥物；⑦知情并同意參加本研究的健康體檢者。

1.4 排除標準有以下任何一種情況的病例均予以排除：①不符合上述中西醫(yī)診斷標準的患者；②合并有血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及風濕類等全身系統(tǒng)疾病，或肝腎功能存在異常的患者；③精神病患者；④近3個月內(nèi)曾服用過任何激素類藥物的患者；⑤依從性差，未按規(guī)定治療，或自行加用其他治療措施，從而影響檢測結(jié)果的患者。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 給予阿司匹林腸溶片口服治療。用法：阿司匹林腸溶片（生產(chǎn)廠家：拜爾醫(yī)藥保健有限公司；批準文號：國藥準字J20080078），口服，每次100 mg，每天1次，療程為4周。

1.5.2 試驗組 給予補腎活血方口服治療。補腎活血方組成：桑寄生15 g 、丹參15 g、續(xù)斷15 g、阿膠（烊化）10 g、黃芪15 g、菟絲子15 g。每日1 劑，常規(guī)煎取200 mL，分早晚2 次溫服，每次100 mL，療程為4周。以上中藥湯劑均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局及煎藥室提供。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 觀察指標 試驗組與對照組患者在治療前和治療4周后的月經(jīng)第26天（子宮內(nèi)膜5～6 mm）時檢測靜脈血清VEGF、TGF-β1、泌乳素（PRL）及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1（IGFBP-1）水平；正常組受試者入組后于月經(jīng)第26天（子宮內(nèi)膜5～6 mm）時檢測靜脈血清VEGF、TGF-β1、PRL及IGFBP-1水平。

1.6.2 標本采集及血清制備 受試者在受檢前1 d需低鹽低脂飲食，避免飲酒吸煙，零點后禁食和禁飲水，次日早晨取空腹靜脈血5 mL，置于促凝管中輕輕搖動混勻后放入離心機中，以3 500 r/min離心15 min，吸出上層分離血清，移入高溫滅菌的EP 管內(nèi)，迅速置于-80 ℃低溫冰箱中凍存?zhèn)溆谩?yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測受試者血清TGF-β1、VEGF、PRL及IGFBP-1水平。

1.6.3 試劑與儀器 ①試劑：Human VEGF ELISA Kit 試 劑 盒 ； Human TGF- β1ELISA Kit 試 劑 盒 ；Human PRL ELISA Kit 試劑盒；Human IGFBP-1 ELISA Kit 試劑盒；上述試劑均購自碧云天生物有限公司。②儀器：美國Beckman Coulter公司高速冷凍離心機，型號：Alehra-21R；BioTek Instruments.Inc全自動酶標儀，型號：ELX808；上海精宏實驗設(shè)備有限公司DK-8D 型電熱恒溫水槽；上海三科儀器有限公司318W 型洗板機及槍頭、移液器等實驗耗材。

1.6.4 實驗方法 提前將試劑盒放置于室溫下40 min，使用前搖勻；待測血清常溫下解凍；在酶標板上設(shè)置10 孔標準品孔，稀釋后各孔均加樣50 μL；將樣品稀釋液40 μL 加入酶標包被板上待測樣品孔中，然后再加入10 μL待測樣品，輕輕晃動混勻；用封板膜密封后，置37 ℃溫育30 min；用蒸餾水將濃縮洗滌液30 倍稀釋后備用；小心揭開封板膜，棄去液體后甩干，將洗滌液加滿每微孔，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干；除去空白孔，每孔再加入50 μL 酶標試劑；重復(fù)溫育后，除去空白孔，每孔再次加入酶標試劑50 μL；將50 μL 顯色劑A 分別加入每微孔中，然后再加入50 μL 顯色劑B，輕輕搖動混勻，37 ℃避光顯色15 min；最后將50 μL 終止液分別加入每微孔中，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔吸光度（OD 值），且應(yīng)在加終止液后15 min 以內(nèi)完成測定。

1.6.5 結(jié)果判斷 依據(jù)OD 值與標準物的濃度計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實際濃度。

1.7 統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。實驗所得數(shù)據(jù)（計量資料）均用均數(shù)±標準差（）表示，組內(nèi)治療前后比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。所有檢驗均采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者脫落剔除情況治療期間，試驗組剔除2例，未按要求治療脫落3例；對照組剔除8例，未按要求治療脫落12例。最終試驗組35例、對照組20例納入研究。

2.2 2組患者治療前后血清VEGF 水平比較表1結(jié)果顯示：治療前，2組患者血清VEGF水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），均明顯低于正常組水平（P＜0.01）。治療后，2組患者血清VEGF 水平均較治療前明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），且試驗組對血清VEGF 水平的升高作用明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中試驗組已接近正常組水平（P＞0.05），而對照組尚未接近正常組水平（P＜0.05）。表明補腎活血方與阿司匹林均可明顯提高URSA 患者血清VEGF 含量，但補腎活血方的提高作用明顯優(yōu)于阿司匹林，而血清VEGF 表達水平的提高，可以促進胚胎發(fā)育和正常妊娠維持。

表1 2組不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者治療前后血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平比較Table 1 Comparison of serum VEGF level between the two groups of patients with URSA before and after treatment（，pg?mL-1）

表1 2組不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者治療前后血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平比較Table 1 Comparison of serum VEGF level between the two groups of patients with URSA before and after treatment（，pg?mL-1）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與治療前比較；⑤P＜0.01，與對照組治療后比較

組別試驗組對照組正常組例數(shù)（例）35 20 40治療前612.92±130.56②628.44±131.47②989.90±188.92治療后836.57± 188.75④⑤717.52± 115.82③①—P值0.000 0.042

2.3 2組患者治療前后血清TGF-β1水平比較表2結(jié)果顯示：治療前，2組患者血清TGF-β1 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），均明顯低于正常組水平（P＜0.01）。治療后，2組患者血清TGF-β1水平均較治療前明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），且試驗組對血清TGF-β1水平的升高作用明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中試驗組已接近正常組水平（P＞0.05），而對照組尚未接近正常組水平（P＜0.05）。表明補腎活血方與阿司匹林均可明顯提高URSA患者血清TGF-β1含量，且補腎活血方的提高作用明顯優(yōu)于阿司匹林，而血清TGF-β1表達水平的提高，可以促進胚胎發(fā)育和正常妊娠的維持。

表2 2組不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者治療前后血清轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）水平比較Table 2 Comparison of serum TGF-β1 level between the two groups of patients with URSA before and after treatment（，ng?L-1）

表2 2組不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者治療前后血清轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）水平比較Table 2 Comparison of serum TGF-β1 level between the two groups of patients with URSA before and after treatment（，ng?L-1）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與治療前比較；⑤P＜0.01，與對照組治療后比較

組別試驗組對照組正常組35 20 40 815.78 ± 91.76②811.03±104.86②1 209.44±190.07 1 012.45 ± 125.00④⑤879.97 ± 100.06③①—0.000 0.040例數(shù)（例） 治療前 治療后P值

2.4 2組患者治療前后血清PRL水平比較表3結(jié)果顯示：治療前，2組患者血清PRL 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），均明顯低于正常組水平（P＜0.01）。治療后，2組患者血清PRL 水平均較治療前明顯升高（P＜0.01），且試驗組對血清PRL水平的升高作用明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但均未接近正常組水平（P＜0.05）。表明補腎活血方與阿司匹林均可明顯提高URSA 患者血清PRL 含量，且補腎活血方的提高作用明顯優(yōu)于阿司匹林，而血清PRL 表達水平的提高，有利于胚胎發(fā)育和正常妊娠的維持。

表3 2組不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者治療前后血清泌乳素（PRL）水平比較Table 3 Comparison of serum PRL level between the two groups of patients with URSA before and after treatment（，ng?L-1）

表3 2組不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者治療前后血清泌乳素（PRL）水平比較Table 3 Comparison of serum PRL level between the two groups of patients with URSA before and after treatment（，ng?L-1）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.01，與治療前比較；④P＜0.05，與對照組治療后比較

組別試驗組對照組正常組例數(shù)（例）35 20 40治療前466.40±90.99②459.99±11.42②802.48±96.81治療后633.06 ± 99.73③④①564.11 ± 81.97③①—P值0.000 0.001

2.5 2組患者治療前后血清IGFBP-1水平比較表4結(jié)果顯示：治療前，2組患者血清IGFBP-1 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），均明顯低于正常組水平（P＜0.01）。治療后，2組患者血清IGFBP-1 水平均較治療前明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），且試驗組對血清IGFBP-1 水平的升高作用明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中試驗組已接近正常組水平（P＞0.05），而對照組尚未接近正常組水平（P＜0.05）。表明補腎活血方與阿司匹林均可明顯提高URSA 患者血清IGFBP-1含量，但補腎活血方的提高作用明顯優(yōu)于阿司匹林，而血清IGFBP-1 表達水平的提高，有利于胚胎發(fā)育和正常妊娠的維持。

表4 2組不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者治療前后血清IGFBP-1水平比較Table 4 Comparison of serum IGFBP-1 level between the two groups of patients with URSA before and after treatment（，μg?L-1）

表4 2組不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者治療前后血清IGFBP-1水平比較Table 4 Comparison of serum IGFBP-1 level between the two groups of patients with URSA before and after treatment（，μg?L-1）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與治療前比較；⑤P＜0.05，與對照組治療后比較

組別試驗組對照組正常組例數(shù)（例）35 20 40治療前36.35±12.11②37.34±11.19②72.98±18.51治療后61.98± 17.45④⑤50.07± 14.31③①—P值0.000 0.017

2.6 相關(guān)性分析由圖1～4可見，試驗組與對照組中的PRL 與VEGF 及TGF-β1 比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），表明蛻膜化標志物 PRL 與 VEGF 及 TGF-β1 均呈正相關(guān)，即當TGF-β1 和 VEGF 水平升高時，會伴隨著 PRL 水平升高。由圖5～8 可見，試驗組與對照組中的IGFBP-1 與 VEGF 及 TGF-β1 比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），表明蛻膜化標志物IGFBP-1 與 VEGF 及 TGF-β1 均呈正相關(guān)，即當VEGF 和TGF-β1 水平升高時，會伴隨著IGFBP-1水平升高。提示VEGF、TGF-β1 水平可通過影響蛻膜化過程從而影響妊娠狀態(tài)。補腎活血方可能通過提高腎虛血瘀型URSA 患者VEGF、TGF-β1水平，促進蛻膜化標志物PRL、IGFBP-1表達，從而促進蛻膜化過程的正常進行，以維持正常妊娠。

圖1 試驗組治療前后血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與PRL相關(guān)性比較Figure 1 Comparison of correlation between VEGF and PRL in the trial group before and after treatment

圖2 對照組治療前后血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與PRL相關(guān)性比較Figure 2 Comparison of correlation between VEGF and PRL in the control group before and after treatment

圖3 試驗組治療前后轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）與PRL相關(guān)性比較Figure 3 Comparison of correlation between TGF-β1 and PRL in the trial group before and after treatment

圖4 對照組治療前后轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）與PRL相關(guān)性比較Figure 4 Comparison of correlation between TGF-β1 and PRL in the control group before and after treatment

圖5 試驗組治療前后血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與IGFBP-1相關(guān)性比較Figure 5 Comparison of correlation between VEGF and IGFBP-1 in the trial group before and after treatment

圖6 對照組治療前后血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與IGFBP-1相關(guān)性比較Figure 6 Comparison of correlation between VEGF and IGFBP-1 in the control group before and after treatment

圖7 試驗組治療前后轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）與IGFBP-1相關(guān)性比較Figure 7 Comparison of correlation between TGF-β1 and IGFBP-1 in the trial group before and after treatment

圖8 對照組治療前后轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）與IGFBP-1相關(guān)性比較Figure 8 Comparison of correlation between TGF-β1 and IGFBP-1 in the control group before and after treatment

2.7 隨訪結(jié)果截止2019年4月31日，除去本研究中剔除和脫落的患者，電話隨訪調(diào)查其余55例患者，記錄是否妊娠及其妊娠結(jié)局。結(jié)果顯示：對照組發(fā)生妊娠15例，其中已成功分娩3例，未發(fā)現(xiàn)胎兒畸形及新生兒疾病；妊娠中期3例，未見流產(chǎn)征兆；妊娠早期5例，未見流產(chǎn)征兆；妊娠期早期流產(chǎn)4例，尚未妊娠5例。試驗組發(fā)生妊娠29例，其中已成功分娩4例，未發(fā)現(xiàn)胎兒畸形及新生兒疾病；妊娠中期14例，未見流產(chǎn)征兆；妊娠早期5例，未見先兆流產(chǎn)征兆；妊娠中期流產(chǎn)4例，妊娠8周流產(chǎn)3例，尚未妊娠6例。

3 討論

很多已知和未知的不良因素都可影響妊娠結(jié)局，胚胎植入前子宮容受態(tài)形成和胚胎植入后子宮內(nèi)膜蛻膜化都與胚胎植入和妊娠維持密切相關(guān)，其中任意因素異常均可致母胎識別失敗而出現(xiàn)早期流產(chǎn)。近年來，隨著對子宮內(nèi)膜蛻膜化研究的逐漸深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺乏蛻膜化或蛻膜化不足在生殖中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其可能是不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）發(fā)生的一個主要原因。排卵后，因孕激素水平的升高而使處于增生期的子宮內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)變，這一過程即為子宮內(nèi)膜蛻膜化，是子宮為了適應(yīng)妊娠做出的最早改變之一，可概括為為使胚胎順利植入子宮內(nèi)膜組織而發(fā)生的一系列重塑過程。子宮內(nèi)膜蛻膜化一般發(fā)生在月經(jīng)周期的第23 天左右，是子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞在蛻膜化誘導(dǎo)因子的刺激下增殖并再分化，腺體和螺旋小動脈發(fā)育以及自然殺傷細胞的聚集，為胚胎提供營養(yǎng)的同時調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層以減少局部免疫反應(yīng)，是胚胎植入母體及維持妊娠的保障[7]。大量的生長因子、催乳素、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1（IGFBP-1）、細胞因子、組織因子、神經(jīng)肽、細胞外基質(zhì)成分等在間質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化的過程中分泌，其中IGFBP-1與泌乳素（PRL）被廣泛用來作為蛻膜化標志的因子[8-11]。大量的血管形成與血管重塑在蛻膜化過程中進行，這些血管的生成是子宮內(nèi)膜蛻膜化過程的核心環(huán)節(jié)，通過建立一個復(fù)雜的血竇與血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)以利于胚胎與母體之間的物質(zhì)交換，從而維持妊娠的正常進行。因此，異常的血管生成過程可導(dǎo)致蛻膜化過程缺陷而引起妊娠失敗，影響妊娠結(jié)局。在多種血管生成因子的相互協(xié)調(diào)配合作用下血管才能正常生成，其中又以轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）與血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）尤為突出。

VEGF 在子宮血管生成中十分重要，是最有力的血管生成因子。其受體僅存在于血管內(nèi)皮細胞中，VEGF 通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在正常組織中很少合成，但在有血管新生的組織內(nèi)多呈高表達狀態(tài)。VEGF 的生物學(xué)特性主要表現(xiàn)為：增加微血管的通透性并與血管內(nèi)皮細胞受體特異性地結(jié)合，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和分裂，進而導(dǎo)致新生血管的生成[12]。薄而密的子宮內(nèi)膜在VEGF 的調(diào)節(jié)作用下可轉(zhuǎn)化為通透性高且厚的分泌性內(nèi)膜，血管通透性發(fā)生改變[13]。分泌期的子宮內(nèi)膜容受性良好，子宮血管豐富，血管通透性增加，子宮輕微水腫，基質(zhì)細胞增殖分化并進行蛻膜轉(zhuǎn)化，同時伴有大量血管的重塑和新生[14-15]。在妊娠的過程中，VEGF 可以促進血管生成參與子宮內(nèi)膜的蛻膜轉(zhuǎn)換，故其正常的分泌水平是蛻膜化過程正常進行的保障，以維持胚胎與母體之間的物質(zhì)交換，是維持正常妊娠的關(guān)鍵。研究表明VEGF 低水平時可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜蛻膜化異常或缺陷，從而導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生。

TGF-β 超家族成員眾多，它們在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡及組織重塑等方面具有重要作用并形成了網(wǎng)絡(luò)化調(diào)節(jié)模式，從而參與了蛻膜化過程的調(diào)節(jié)[16]。顆粒細胞作為TGF-β 產(chǎn)生的主要部位之一，其存在的類型以TGF-β1為主。通過實驗研究，Chang H J 等[17]發(fā)現(xiàn)，通過磷酸化Smad 和Erk TGF-β1可誘導(dǎo)蛻膜化發(fā)生，使PRL分泌增加。同時，通過促進環(huán)氧化酶（COX-2）及前列腺素E2（PGE2）的表達，TGF-β1 可間接發(fā)揮誘導(dǎo)ESCs 蛻膜化的作用。Brogi E 等[18-19]根據(jù)TGF-β1 在血管生成等方面的作用，將其稱為“間接”血管生成因子，認為TGF-β1可調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞中血管內(nèi)皮生長因子的生成，上調(diào)VEGF 的表達，甚至在適當條件下可以直接參與VEGF 產(chǎn)生，在妊娠早期可以促進胎盤血管形成，有助于胚胎著床及胎盤形成，使蛻膜化過程正常進行，以利妊娠的維持。TGF-β1主要存在于結(jié)締組織細胞及血管內(nèi)皮細胞，在大鼠的整個正常妊娠過程中，其在子宮和胎盤中都有表達，另外，其分布早期主要集中在子宮蛻膜組織中，中晚期則主要集中在滋養(yǎng)層以及植入點附近的腔上皮和腺上皮周圍，在胚胎著床、胎盤發(fā)育和胎兒生長等各方面發(fā)揮重要作用[20]。通過刺激纖維和血管內(nèi)皮生長因子的生長作用，TGF-β1在胚胎種植過程中發(fā)揮重要作用[21]。亦有研究[11]表明，在TGF-β1的刺激下子宮內(nèi)膜中的基質(zhì)細胞分泌細胞外基質(zhì)蛋白，可促進內(nèi)膜的蛻膜化，從而有利于孕卵的著床。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在祖國醫(yī)學(xué)中相當于“滑胎”范疇。《諸病源候論》指出腎虛沖任損傷、胎元不固為滑胎的主要發(fā)病機制，腎虛為墮胎發(fā)病之本，血瘀為發(fā)病之標。腎虛溫煦失職或生內(nèi)熱，寒凝血滯不行而生血瘀或熱灼精血，瘀滯胞宮，新血不能下注胞宮以養(yǎng)胎，均可導(dǎo)致胎動不安、胎漏甚至墮胎；同時，流產(chǎn)反復(fù)發(fā)生也會導(dǎo)致瘀血內(nèi)阻于胞宮，沖任胞絡(luò)損傷或癥瘕發(fā)生，瘀血不去，新血不生，胎失所養(yǎng)或癥瘕礙胎生長發(fā)育，從而導(dǎo)致胎漏、胚胎發(fā)育不良甚至枯萎，終致胎元難固而流產(chǎn)。腎虛血瘀，屢屢胎墮，故應(yīng)補腎活血，通過補腎藥與活血藥相互結(jié)合，才能夠更好地發(fā)揮相互促進的作用，進而提高妊娠成功率。在中醫(yī)學(xué)理論體系中，“治未病”貫穿始終，眾多思想觀念、治療原則、組方用藥均是在“治未病”基礎(chǔ)之上建立的。在該理論思想指導(dǎo)下，張景岳將“預(yù)培其損”作為對滑胎病的治療原則。結(jié)合該理論，為最大程度地對墮胎者進行治療，避免患者再次出現(xiàn)妊娠不良結(jié)局，從而最大限度地提高妊娠成功率，補腎活血功效的藥物應(yīng)在患者未孕前給予，以達到孕前治療的目的。本研究使用的補腎活血方是根據(jù)對腎虛血瘀證URSA 患者的臨床診療經(jīng)驗及其致病機理擬定的，在臨床使用上療效確切。經(jīng)該方治療后患者月經(jīng)第26 天（子宮內(nèi)膜5～6 mm）靜脈血中PRL 及IGFBP-1水平顯著升高，再次妊娠者孕期檢測血清孕激素、血清雌激素和人絨毛膜促性腺激素，其水平均有明顯的升高。

補腎活血方的主要成分有丹參、菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠（烊化）、黃芪。其中，桑寄生益腎安胎。《本草綱目》認為，桑寄生能夠“安胎……助筋骨，益血脈，主懷妊漏血不止，令胎牢固。”藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑寄生含有豐富的錳、鋅等微量元素，有益于胚胎生長和發(fā)育。丹參活血通經(jīng)，養(yǎng)血消癰，止痛安神。菟絲子補腎安胎，固精止瀉。《山東中藥》指出，菟絲子能“治婦人常習流產(chǎn)。”張錫純提出，菟絲子是治流產(chǎn)的主藥，“菟絲子大能補腎，腎旺能蔭胎。”續(xù)斷補益肝腎，止血安胎，強筋健骨，療傷續(xù)折。《本草綱目》云：“久服……破癥結(jié)瘀血……胎漏。”黃芪益氣升陽固表，可維系胞脈，升舉陽氣，固攝胎元。現(xiàn)代藥理學(xué)認為，黃芪能夠調(diào)節(jié)機體免疫，平衡Th1/Th2，增強細胞免疫力。阿膠補血止血。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載阿膠能“主女子下血，安胎，久服益氣。”綜觀全方，針對腎虛血瘀證URSA 擬定的補腎活血方，以續(xù)斷、菟絲子、丹參為君藥，達補腎與活血并重之功；以桑寄生為臣藥，發(fā)揮益腎安胎之效；以黃芪與阿膠為佐藥，發(fā)揮補氣補血止血、以血養(yǎng)胎之效，并使血脈伏藏，以防活血化瘀藥散血動血之弊。故全方適用于腎虛血瘀證URSA未孕患者的治療。

諸多研究表明，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與血栓前狀態(tài)有一定關(guān)系，故使用抗凝藥物在臨床上也可取得一定療效。作為治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)傳統(tǒng)藥物的阿司匹林，可抑制血小板的釋放反應(yīng)，抑制血小板聚集，在體內(nèi)具有抗血栓的作用，是西醫(yī)治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)血栓前狀態(tài)的主要臨床藥物。

本研究結(jié)果顯示，治療前，試驗組與對照組的URSA 未孕患者外周血中VEGF、TGF-β1 水平及蛻膜化標志因子PRL、IGFBP-1的水平均明顯低于正常組（P＜0.01），治療4 周后，上述各項指標水平均較治療前明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），且試驗組的升高作用均明顯優(yōu)于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。同時，VEGF、TGF-β1與PRL、IGFBP-1均呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。表明補腎活血方與阿司匹林均可明顯提高URSA 患者血清VEGF、TGF-β1及蛻膜化標志因子PRL、IGFBP-1 水平，且補腎活血方的提高作用明顯優(yōu)于阿司匹林。血清VEGF、TGF-β1及蛻膜化標志因子PRL、IGFBP-1表達水平的提高，有利于母胎界面大量的血管形成與血管重塑，可為胚胎與母體之間的物質(zhì)交換建立橋梁，改善母胎界面免疫微環(huán)境，促進子宮內(nèi)膜蛻膜化的正常進行，從而有利于胚胎發(fā)育和正常妊娠的維持。

綜上所述，應(yīng)用中藥補腎活血方治療腎虛血瘀型URSA 未孕患者具有顯著的臨床療效，該研究結(jié)果可為臨床孕前治療URSA 患者提供較為客觀的科學(xué)依據(jù)。