坤寶丸對大鼠實驗性卵巢早衰模型的影響

李想， 李嘉

（中國醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院、遼寧省腫瘤醫(yī)院，遼寧沈陽 110042）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指卵巢功能衰竭所引起的40 歲之前即閉經(jīng)的現(xiàn)象[1]。其特點是原發(fā)或繼發(fā)閉經(jīng)伴隨促黃體生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）水平升高以及雌二醇（E2）水平降低[2]，且伴有不同程度的低雌激素癥狀如潮熱多汗、性欲低下等[3]。坤寶丸由女貞子（酒炙）、菟絲子、枸杞子、龜甲、熟地黃、當歸、白芍等23味中藥組成，具有滋補肝腎、養(yǎng)血通絡[4]的功效，適用于肝腎陰虛所致烘熱汗出、心煩易怒、少寐健忘、頭暈耳鳴、口渴咽干、四肢痠楚等證，臨床常用于更年期綜合征的治療。更年期綜合征主要表現(xiàn)的卵巢功能減退與卵巢早衰具有諸多相似癥狀[5]。為探討坤寶丸治療卵巢早衰的潛力作用，本研究擬進一步觀察坤寶丸對卵巢早衰大鼠模型的影響，以期為坤寶丸臨床治療卵巢早衰提供藥效學依據(jù)，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級健康雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，購于遼寧長生生物有限公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（遼）2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度22～25 ℃，濕度55%～60%，每日12 h循環(huán)照明，實驗期間大鼠自由飲水及攝食。實驗動物使用許可證號：SCXK（遼）2019-0001。

1.2 藥物與試劑坤寶丸，北京同仁堂股份有限公司生產(chǎn)，口服，一次50粒，一日2次，每100粒質(zhì)量為10 g，批號：20180425；結合雌激素片，新疆新姿源生物制藥有限責任公司生產(chǎn)，批號：20180115。轉化生長因子（TGF）-β1、結締組織生長因子（CTGF）、干細胞因子（SCF）檢測試劑盒，北京博奧森生物技術有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器HHQ-2508型病理切片機（杭州艾普儀器設備有限公司）；KD-P型展片機、KD-H 型烘片機（北京世紀科信科學儀器有限公司）；BX43 型奧林巴斯生物顯微鏡（奧林巴斯中國有限公司）；BGXM496 型自動酶標儀（常州三豐儀器科技有限公司）；TGL-16.5M 型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.4 分組、模型制備與給藥60 只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量排序后隨機分為空白組、模型組、坤寶丸低劑量組（0.9 g·kg-1·d-1）、坤寶丸中劑量組（1.8 g·kg-1·d-1）、坤寶丸高劑量組（3.6 g·kg-1·d-1）、結合雌激素組（0.12 mg·kg-1·d-1），每組 10 只。預防灌胃給藥14 d 后，除空白組外，其余5 組大鼠建立卵巢早衰動物模型[6]，分別于第14、21天腹腔注射順鉑（將20 mg 順鉑溶于20 mL 生理鹽水中，注射體積為4 mL/kg）4 mg/kg。持續(xù)灌胃給藥至實驗的第28天。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 動情周期檢測 刮取大鼠陰道分泌物，對陰道涂片進行蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察陰道上皮細胞的變化情況，用于監(jiān)測大鼠動情周期。

1.5.2 血清FSH、E2、LH 水平檢測 末次給藥1 h 后，腹腔注射50 g/L 水合氯醛生理鹽水溶液0.7 mL/kg 麻醉大鼠，腹主動脈取血。采集的血液于室溫下靜置 20 min 后，以 280 ×g離心 15 min，收集血清。采用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測血清FSH[7]、E2[8]、LH[9]水平。具體操作方法按試劑盒說明進行。應用酶標儀于450 nm 波長處測量各指標光密度（OD）值。

1.5.3 免疫組織化學法檢測卵巢組織CTGF、TGF-β1、SCF 表達[10]將卵巢組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。加體積分數(shù)3% H2O2室溫孵育10 min。滴加10%山羊血清，室溫孵育10 min 后傾去血清。分別滴加一抗（TGF-β1，稀釋比 1∶400；CTGF，稀釋比 1∶150；SCF，稀釋比 1∶350），于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h。滴加生物素標記的二抗，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。滴加辣根酶標記的鏈霉素工作液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。DAB 顯色劑顯色，自來水沖洗，復染，脫水，透明，中性樹膠封片。采用ImageJ 軟件檢測 CTGF、TGF-β1、SCF 陽性表達的 OD 值，OD值越大則表示抗體表達程度越強[11]。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 坤寶丸對卵巢早衰大鼠動情周期的影響表1結果表明：空白組大鼠均表現(xiàn)為規(guī)律的動情周期，模型組大鼠的動情周期均有所延長，坤寶丸低劑量組大鼠大部分出現(xiàn)動情周期紊亂，坤寶丸高、中劑量組及結合雌激素組大鼠多恢復正常動情周期。

2.2 坤寶丸對卵巢早衰大鼠血清FSH、E2、LH 水平的影響表2結果顯示：與空白組比較，模型組血清FSH、LH 水平顯著升高，E2水平顯著降低（均P< 0.01）；與模型組比較，坤寶丸低、中、高劑量組及結合雌激素組血清FSH、LH 水平顯著降低，E2水平顯著升高，且呈劑量依賴性，其中，除坤寶丸低劑量組血清E2水平與模型組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）外，其他各組指標的差異均有統(tǒng)計學意義（P< 0.05 或P< 0.01）。各治療組間FSH、E2、LH 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠血清促卵泡激素（FSH）、雌二醇（E2）、促黃體生成激素（LH）水平比較Table 2 Comparison of the levels of FSH，E2 and LH in rat serum of various groups（）

表2 各組大鼠血清促卵泡激素（FSH）、雌二醇（E2）、促黃體生成激素（LH）水平比較Table 2 Comparison of the levels of FSH，E2 and LH in rat serum of various groups（）

①P < 0.01，與空白組比較；②P < 0.05，③P < 0.01，與模型組比較

LH（ng·mL-1）1.47±0.32 4.73±0.58①3.88±0.37③3.16±0.42③2.56±0.27③2.68±0.38③空白組模型組坤寶丸低劑量組坤寶丸中劑量組坤寶丸高劑量組結合雌激素組10 10 10 10 10 10 0.012±0.002 0.092±0.013①0.063±0.008②0.057±0.006③0.041±0.006③0.034±0.004③87±7.58 53±5.31①61±5.96 65±6.52②69±7.64③73±7.37③組別 鼠數(shù)（只）FSH（IU·L-1）E2（ng·L-1）

2.3 坤寶丸對卵巢早衰大鼠CTGF 表達的影響表3、圖1 結果顯示：與空白組比較，模型組卵巢組織CTGF 表達水平顯著升高（P< 0.01）；與模型組比較，坤寶丸低、中、高劑量組及結合雌激素組卵巢組織CTGF 表達水平均降低，且呈劑量依賴性，其中，坤寶丸高劑量組、結合雌激素組差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05 或P< 0.01）。各治療組間CTGF 表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖1 各組大鼠卵巢組織結締組織生成因子（CTGF）分布比較（免疫組織化學法，×200）Figure 1 Comparison of the distribution of CTGF in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×200）

表3 各組大鼠卵巢組織結締組織生成因子（CTGF）表達水平比較Table 3 Comparison of the expression level of CTGF in rat ovarian tissue of various groups（）

表3 各組大鼠卵巢組織結締組織生成因子（CTGF）表達水平比較Table 3 Comparison of the expression level of CTGF in rat ovarian tissue of various groups（）

①P < 0.01，與空白組比較；②P < 0.05，③P < 0.01，與模型組比較

CTGF OD值0.093±0.024 0.238±0.057①0.225±0.036 0.199±0.044 0.188±0.044②0.175±0.065③組別空白組模型組坤寶丸低劑量組坤寶丸中劑量組坤寶丸高劑量組結合雌激素組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

2.4 坤寶丸對卵巢早衰大鼠TGF-β1 表達的影響表4、圖2 結果顯示：與空白組比較，模型組卵巢組織TGF-β1 表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，坤寶丸低、中、高劑量組及結合雌激素組卵巢組織TGF-β1 表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P< 0.05 或P< 0.01），且呈劑量依賴性。各治療組間TGF-β1表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖2 各組大鼠卵巢組織轉化生長因子（TGF）-β1分布比較（免疫組織化學法，×200）Figure 2 Comparison of the distribution of TGF-β1 in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×200）

表4 各組大鼠卵巢組織轉化生長因子（TGF）-β1表達水平比較Table 4 Comparison of the expression level of TGF-β1 in rat ovarian tissue of various groups（）

表4 各組大鼠卵巢組織轉化生長因子（TGF）-β1表達水平比較Table 4 Comparison of the expression level of TGF-β1 in rat ovarian tissue of various groups（）

①P < 0.01，與空白組比較；②P < 0.05，③P < 0.01，與模型組比較

TGF-β1 OD值0.174±0.038 0.301±0.054①0.259±0.034②0.250±0.032②0.227±0.047③0.238±0.055③組別空白組模型組坤寶丸低劑量組坤寶丸中劑量組坤寶丸高劑量組結合雌激素組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

2.5 坤寶丸對卵巢早衰大鼠卵巢SCF 表達的影響表5、圖3 結果顯示：與空白組比較，模型組卵巢組織SCF 表達水平顯著升高（P< 0.01）；與模型組比較，坤寶丸低、中、高劑量組及結合雌激素組卵巢組織SCF 表達水平均降低，且呈劑量依賴性，除坤寶丸低劑量組，其他各治療組與模型組的差異均有統(tǒng)計學意義（P< 0.05 或P<0.01）。各治療組間SCF 表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖3 各組大鼠卵巢組織干細胞因子（SCF）分布比較（免疫組織化學法，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of SCF in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×200）

表5 各組大鼠卵巢組織干細胞因子（SCF）表達水平比較Table 5 Comparison of the expression level of SCF in rat ovarian tissue of various groups（）

表5 各組大鼠卵巢組織干細胞因子（SCF）表達水平比較Table 5 Comparison of the expression level of SCF in rat ovarian tissue of various groups（）

①P < 0.01，與空白組比較；②P < 0.05，③P < 0.01，與模型組比較

SCF OD值0.146±0.048 0.256±0.033①0.230±0.005 0.208±0.030②0.195±0.050③0.203±0.057②組別空白組模型組坤寶丸低劑量組坤寶丸中劑量組坤寶丸高劑量組結合雌激素組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

3 討論

目前建立卵巢早衰動物模型的方法主要有自身免疫模型、化療藥物模型、基因敲除模型、半乳糖模型等。其中，自身免疫模型和化療藥物模型較為成熟，基因敲除模型僅能明確某一基因的作用，但不能完全解釋卵巢早衰病因，半乳糖血癥為常染色體顯性遺傳病，可以較好地造成動物卵巢早衰模型，但臨床病例很少，缺乏實用的臨床意義。化療藥物可造成卵巢細胞DNA 結構和功能的損害，最終使細胞死亡或突變，導致卵巢損傷。癌癥患者使用順鉑治療后可能出現(xiàn)卵子形成障礙和卵巢功能損傷等現(xiàn)象。因此，本研究采用臨床常用化療藥物順鉑制作卵巢早衰模型，但結果僅適用于化療藥物引起的卵巢早衰，坤寶丸對其他因素引起卵巢早衰模型的影響有待于進一步研究。

卵巢早衰患者雌激素水平是突然下降的，故癥狀出現(xiàn)快而明顯，因此認為其癥狀出現(xiàn)與雌激素分泌減少的速度和程度相一致[12]。卵巢早衰患者血中FSH 持 續(xù) 在 40 IU/L 以 上 ，E2常 低 于 100 pmol/L[13]。FSH是垂體前葉嗜堿性細胞分泌的一種激素，主要作用為促進卵泡成熟，其可促進卵泡顆粒層細胞增生分化，并能促進整個卵巢長大。LH 由腦垂體前葉嗜堿性細胞分泌，它作用于成熟的卵胞，能引起排卵并生成黃體[14]。E2是一種甾體雌激素，有α、β1 2種類型，α型生理作用強，如卵巢缺如、發(fā)育低下、原發(fā)性卵巢衰竭等卵巢疾病血漿E2水平均降低[15]。而正常的動情周期代表著規(guī)律的激素水平變化。本研究結果顯示，模型組大鼠的動情周期延長，表明卵巢早衰大鼠卵巢儲備功能下降，激素水平紊亂。而坤寶丸治療可以改善實驗性卵巢早衰模型大鼠動情周期，使血清FSH、LH 水平降低，E2水平顯著增加，表明坤寶丸具有調(diào)節(jié)卵巢早衰模型大鼠激素水平的作用。

卵巢纖維化是造成卵巢功能衰退的原因之一，纖維化可出現(xiàn)在卵巢早衰及多囊卵巢綜合癥的卵巢組織中[16]。TGF-β1、CTGF 和 SCF 等生長因子是刺激卵巢組織發(fā)生纖維化的主要因素。研究表明，過度表達TGF-β1的轉基因小鼠會發(fā)生廣泛的纖維化，抗TGF-β1 或抗Smad 的治療可以阻止纖維化的發(fā)生和發(fā)展[17]，因此，調(diào)控TGF-β1 表達水平對調(diào)控卵巢早衰具有重要的意義。CTGF 是TGF-β1的直接下游效應介質(zhì)，CTGF 和TGF-β1可共同誘導纖維化的發(fā)生，在許多纖維化疾病過程中CTGF和TGF-β1表達同步增高，TGF-β1主要表達于組織纖維化病變的早期，CTGF 持續(xù)表達是纖維化病變緩慢進展的重要因素，且可能是器官纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[18]。SCF 是一種多功能細胞因子，參與慢性炎癥及腫瘤的血管形成[19]，卵巢顆粒細胞可產(chǎn)生SCF，而SCF 又可以促進卵巢顆粒細胞的生長發(fā)育，影響早期卵泡的正常發(fā)育。本研究結果顯示：卵巢早衰大鼠卵巢組織CTGF、TGF-β1、SCF 表達水平較空白組顯著升高（P<0.01），坤寶丸及結合雌激素治療可使卵巢早衰大鼠卵巢組織CTGF、TGF-β1、SCF 表達水平降低（P< 0.05 或P< 0.01）。表明坤寶丸可能通過降低卵巢組織CTGF、TGF-β1、SCF 的表達，減輕卵巢纖維化損傷，進而促進早期卵泡的生長發(fā)育，防止卵巢早衰的發(fā)生。

綜上所述，坤寶丸對注射順鉑誘導的大鼠卵巢早衰具有積極的干預作用，我們認為其可以作為治療卵巢早衰的候選中成藥。其機制可能與降低CTGF、TGF-β1、SCF 的表達從而減輕卵巢纖維化有關。