天麻素對(duì)幼鼠癲癇的改善及對(duì)海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的抑制作用研究

鄭婷婷， 金美玉， 張莉

（大連市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧大連 116000）

癲癇是兒童時(shí)期常見的一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有致殘率高、發(fā)病率高和反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可影響小兒大腦發(fā)育以及神經(jīng)元正常功能，引起遠(yuǎn)期神經(jīng)行為發(fā)育及突觸可塑性相關(guān)基因的表達(dá)異常，進(jìn)而造成認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重威脅患兒身體健康[1-2]。海馬組織結(jié)構(gòu)變化與癲癇的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生在癲癇發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞參與調(diào)節(jié)氨基酸代謝和離子濃度，引起癲癇發(fā)作。以星形膠質(zhì)細(xì)胞為切入點(diǎn)，抑制其增生，可為臨床防治癲癇發(fā)作提供新的思路和方法[3-4]。天麻素為中藥天麻Gastrodia elataBl.塊根提取物，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、催眠、腦保護(hù)等作用，可明顯緩解神經(jīng)衰弱、失眠等癥狀，臨床上廣泛用于心腦血管病的治療，其副作用小，療效顯著[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，天麻素可改善癲癇動(dòng)物模型的癥狀，具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。臨床研究顯示，天麻素可降低癲癇合并偏頭疼患者的發(fā)作頻率，提高總有效率[7]。 p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）在癲癇中發(fā)揮重要作用，通過抑制p38MAPK 通路可保護(hù)受損神經(jīng)元[8]。既往研究顯示，天麻素通過抑制p38MAPK 通路可降低化療痛大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾[9]。但天麻素對(duì)癲癇的治療作用是否與p38MAPK 有關(guān)，尚不明確，因此，本研究通過建立幼鼠癲癇模型，探討天麻素對(duì)幼鼠癲癇的改善作用及可能機(jī)制，以期為臨床治療小兒癲癇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 60 只，2 周齡，體質(zhì)量（20 ± 1）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0006]，飼養(yǎng)于大連市兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，購(gòu)入后保持環(huán)境清潔通風(fēng)，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 藥物、試劑和儀器天麻素（分子量：286.28，分子式：C13H18O7，批號(hào)：62499-27-8）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；p38 MAPK 激活劑茴香霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；匹羅卡品、氯化鋰均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；地西泮注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H12020957，2 mL：10 mg）購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物工程有限公司；兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。Mini-Protean4電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 癲癇模型建立與分組隨機(jī)選取50只幼鼠構(gòu)建癲癇模型。參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行建模，方法：給予幼鼠127 mg/kg 氯化鋰腹腔注射，18 h 后按1 mg/kg腹腔注射東莨菪堿，30 min后按30 mg/kg腹腔注射匹羅卡品，至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，如30 min 后未發(fā)作，再按上述劑量注射一次匹羅卡品。采用Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]評(píng)價(jià)癇性發(fā)作等級(jí)：0 級(jí)，無(wú)反應(yīng)；1 級(jí)，耳面部肌肉抽搐；2 級(jí)，以點(diǎn)頭或甩尾為主的肌肉抽搐；3 級(jí)，單側(cè)肢體的陣攣及抽搐；4 級(jí)，雙側(cè)肢體陣攣或全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作，伴有身體直立；5 級(jí)，抽搐，持續(xù)站立、身體背曲強(qiáng)直、跌倒。根據(jù)以上評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)4級(jí)以上發(fā)作，認(rèn)為造模成功，癲癇持續(xù)90 min，腹腔注射地西泮（10 mg/kg）終止癲癇持續(xù)狀態(tài)。建模成功幼鼠44 只，將其隨機(jī)分為模型組、天麻素組、天麻素+茴香霉素組、茴香霉素組，每組各11只。另將10只正常幼鼠設(shè)為對(duì)照組，腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 藥物干預(yù)造模結(jié)束12 h 后進(jìn)行干預(yù)。天麻素組：腹腔注射120 mg/kg 天麻素；天麻素+茴香霉素組：腹腔注射120 mg/kg 天麻素，腹腔注射5 μg/kg 茴香霉素；茴香霉素組：腹腔注射5 μg/kg茴香霉素；模型組和對(duì)照組：腹腔注射等體積溶媒二甲基亞砜（DMSO）。每日1次，連續(xù)1周。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 行為學(xué)觀察 造模開始至末次干預(yù)期間，觀察各組幼鼠行為學(xué)變化。

1.5.2 監(jiān)測(cè)腦電圖觀察腦電波改變情況 末次干預(yù)后12 h，以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉幼鼠，進(jìn)行腦電圖監(jiān)測(cè)。在雙側(cè)大腦皮層和海馬部位放置電極，使用牙托粉和膠水固定，采用多導(dǎo)生理記錄儀記錄腦電圖變化，連續(xù)記錄2 h內(nèi)腦電圖變化情況。潛伏期為從開始記錄至出現(xiàn)癇波（尖波、棘波、棘慢波）的時(shí)間。癇波頻率：記錄時(shí)長(zhǎng)1 min腦電波圖中出現(xiàn)癇波數(shù)值，2 h內(nèi)共采集10 次，取平均數(shù)。大發(fā)作次數(shù)：連續(xù)超過10 s的癇波記為1次大發(fā)作，記錄2 h內(nèi)數(shù)據(jù)。

1.5.3 尼氏染色觀察海馬組織神經(jīng)元存活情況 腦電圖監(jiān)測(cè)結(jié)束后，各組隨機(jī)選5只幼鼠，開胸于左心室至升主動(dòng)脈插管，以200 mL生理鹽水+40 mL 4%多聚甲醛先快后慢進(jìn)行灌注2 h，幼鼠出現(xiàn)四肢及全身痙攣、僵硬，表示灌注成功。取出大腦，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，25%蔗糖脫水至沉底，取前囟后1 ～ 2.5 mm 處的腦組織，切片（厚約20 μm）。室溫退冰后，加入尼氏染色液反應(yīng)10 min，依次乙醇脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察海馬CA3 區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)目，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，取平均值。

1.5.4 TUNEL 染色觀察海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況 取腦組織切片，二甲苯脫蠟10 min，乙醇脫水，滴加蛋白酶K溶液孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 3 次，以 3% H2O2室溫孵育 10 min，滅活過氧化物酶活性；PBS 洗滌3 次，滴加50 μL 的TdT 標(biāo)記的反應(yīng)混合物室溫避光孵育90 min，TBS溶液洗滌；終止反應(yīng)后，DAB顯色，PBS洗滌。隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察棕褐色TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5.5 免疫組織化學(xué)法觀察海馬組織GFAP 表達(dá)情況 取海馬組織切片，PBS洗滌3次，3%H2O2反應(yīng)10 min；PBS 洗滌，正常山羊血清封閉15 min，加入1∶200 稀釋的兔抗大鼠GFAP 多抗4 ℃孵育過夜；PBS 洗滌3 次，加入1∶150 稀釋的生物素標(biāo)記的二抗 37 ℃孵育 20 min；PBS 洗滌 3 次，加入 1∶150 稀釋的HRP 標(biāo)記的鏈霉素卵白素室溫孵育60 min；PBS 洗滌3 次，DAB 顯色，脫水，透明，封片，星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)DAB 顯色后呈棕褐色。每只幼鼠隨機(jī)取3 張切片，每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野，利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)GFAP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)細(xì)胞中p38MAPK、p-p38MAPK、GFAP、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)情況 取各組剩余大腦，分離海馬組織，保存于液氮中。取海馬組織，加入裂解液，冰上研磨，以12 000 r/min 離心（離心半徑10 cm）10 min，取上清，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度，蛋白水浴變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 溶液洗膜，分別加入稀釋的p38MAPK（1∶1 000 稀釋）、p-p38MAPK（1∶1 000 稀 釋）、 GFAP（1∶1 000 稀釋）、Bcl-2（1∶500 稀釋）、Bax（1∶800 稀釋）一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 溶液洗膜，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h。滴加電化學(xué)發(fā)光（ECL）液，顯影定影，晾干后掃描圖像，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平（目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值）。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察對(duì)照組幼鼠未出現(xiàn)癲癇發(fā)作；其余4 組幼鼠注射匹羅卡品后出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、肌肉抽搐、四肢痙攣、節(jié)律性點(diǎn)頭，直至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，天麻素+茴香霉素組和天麻素組大鼠發(fā)作次數(shù)逐漸減少。

2.2 各組幼鼠腦電圖變化比較對(duì)照組幼鼠腦電波以α、β 波為主，偶有散在θ 波；模型組出現(xiàn)以尖波、棘波、棘慢波為主的癇波；茴香霉素組與模型組腦電波相似，以癇波為主，癇波密度更大；天麻素+茴香霉素組、天麻素組波幅較模型組明顯降低，癇波密度明顯減小，仍有散在尖波，其中，天麻素組較天麻素+茴香霉素組改善更明顯。具體結(jié)果見圖1。

圖1 各組幼鼠腦電波改變情況比較Figure 1 Comparison of the changes of brain waves of young rats in various groups

各組幼鼠潛伏期、癇波頻次和大發(fā)作次數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，茴香霉素組潛伏期縮短，癇波頻次和大發(fā)作次數(shù)增加，天麻素+茴香霉素組、天麻素組潛伏期延長(zhǎng)，癇波頻次和大發(fā)作次數(shù)減少（P＜0.05）；與茴香霉素組比較，天麻素+茴香霉素組、天麻素組潛伏期延長(zhǎng)，癇波頻次和大發(fā)作次數(shù)減少（P＜0.05）；天麻素組潛伏期長(zhǎng)于天麻素+茴香霉素組，癇波頻次和發(fā)作次數(shù)少于天麻素+茴香霉素組（P＜0.05）。具體結(jié)果見表1。

表1 各組幼鼠潛伏期、癇波頻次和大發(fā)作次數(shù)比較Table 1 Comparison of the incubation period，frequency of epileptic waves and frequency of major attack of young rats in various groups （）

表1 各組幼鼠潛伏期、癇波頻次和大發(fā)作次數(shù)比較Table 1 Comparison of the incubation period，frequency of epileptic waves and frequency of major attack of young rats in various groups （）

①P<0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與茴香霉素組比較；③P＜0.05，與天麻素+茴香霉素組比較

組別模型組茴香霉素組天麻素+茴香霉素組天麻素組F值P值大發(fā)作次數(shù)（次）92.36±10.25 121.25±11.49①63.48± 9.86①②25.62 ± 6.13①②③197.579＜0.001鼠數(shù)（只）11 11 11 11潛伏期（s）123.68±23.25 95.89±22.57①267.45± 30.46①②482.69 ± 35.21①②③428.151＜0.001癇波頻次（次·min-1）375.62±26.13 423.59±28.64①223.41± 22.75①②143.54 ± 18.62①②③317.676＜0.001

2.3 各組幼鼠海馬組織存活神經(jīng)元數(shù)比較海馬存活神經(jīng)元數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、茴香霉素組、天麻素+茴香霉素組、天麻素組存活神經(jīng)元數(shù)減少（P＜0.05）；與模型組比較，茴香霉素組存活神經(jīng)元數(shù)減少，天麻素+茴香霉素組、天麻素組存活神經(jīng)元數(shù)增加（P＜0.05）；與茴香霉素組比較，天麻素+茴香霉素組、天麻素組存活神經(jīng)元數(shù)增加（P＜0.05）；天麻素組存活神經(jīng)元數(shù)較天麻素+茴香霉素組增加（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 各組幼鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元存活情況（Nissl染色法，×400）Figure 2 Comparison of the survival of neurons in hippocampal CA1 region in young rats of various groups（by Nissl staining method，×400）

表2 各組幼鼠海馬組織存活神經(jīng)元數(shù)比較Table 2 Comparison of the number of survival neurous in hippocampus of young rats in various groups（）

表2 各組幼鼠海馬組織存活神經(jīng)元數(shù)比較Table 2 Comparison of the number of survival neurous in hippocampus of young rats in various groups（）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與茴香霉素組比較；④P＜0.05，與天麻素+茴香霉素組比較

存活神經(jīng)元數(shù)（個(gè)·視野-1）352.40±20.13 93.60±15.25①61.40± 10.33①②168.40 ± 17.59①②③246.80 ± 19.42①②③④243.475＜0.001組別對(duì)照組模型組茴香霉素組天麻素+茴香霉素組天麻素組F值P值鼠數(shù)（只）5 5 555

2.4 各組幼鼠海馬組織凋亡神經(jīng)元數(shù)比較凋亡神經(jīng)元數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、茴香霉素組、天麻素+茴香霉素組、天麻素組凋亡神經(jīng)元數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組比較，茴香霉素組凋亡神經(jīng)元數(shù)增加，天麻素+茴香霉素組、天麻素組凋亡神經(jīng)元數(shù)減少（P＜0.05）；與茴香霉素組比較，天麻素+茴香霉素組、天麻素組凋亡神經(jīng)元數(shù)減少（P＜0.05）；天麻素組凋亡神經(jīng)元數(shù)較天麻素+茴香霉素組減少（P＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 各組幼鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況（TUNEL染色法，×400）Figure 3 Comparison of the apoptosis of neurons in hippocampal CA1 region of young rats in various groups（by TUNEL staining method，×400）

表3 各組幼鼠海馬組織凋亡神經(jīng)元數(shù)比較Table 3 Comparison of the number of apoptotic neurons in hippocampus of young rats in various groups （）

表3 各組幼鼠海馬組織凋亡神經(jīng)元數(shù)比較Table 3 Comparison of the number of apoptotic neurons in hippocampus of young rats in various groups （）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與茴香霉素組比較；④P＜0.05，與天麻素+茴香霉素組比較

凋亡神經(jīng)元數(shù)（個(gè)·視野-1）4.20±2.31 33.60±3.43①41.20 ± 3.12①②22.80 ± 3.06①②③14.60 ± 2.89①②③④58.535＜0.001組別對(duì)照組模型組茴香霉素組天麻素+茴香霉素組天麻素組F值P值鼠數(shù)（只）5 5 5 5 5

2.5 各組幼鼠海馬區(qū)GFAP 表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較GFAP 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、茴香霉素組、天麻素+茴香霉素組、天麻素組凋亡GFAP 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組比較，茴香霉素組GFAP 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)增加，天麻素+茴香霉素組、天麻素組凋亡GFAP 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與茴香霉素組比較，天麻素+茴香霉素組、天麻素組GFAP 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；天麻素組GFAP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較天麻素+茴香霉素組減少（P＜0.05）。見表4、圖4。

圖4 各組幼鼠海馬組織GFAP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（DAB染色法，×400）Figure 4 Comparison of the number of GFAP positively expressed cells in hippocampus of young rats in various groups（by DAB staining method，×400）

表4 各組幼鼠海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較Table 4 Comparison of the number of GFAP positively expressed cells in hippocampus of young rats in various groups （）

表4 各組幼鼠海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較Table 4 Comparison of the number of GFAP positively expressed cells in hippocampus of young rats in various groups （）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與茴香霉素組比較；④P＜0.05，與天麻素+茴香霉素組比較

GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)·視野-1）8.26±1.53 27.59±2.16①39.48± 2.58①②19.46 ± 1.84①②③12.12 ± 1.67①②③④197.777＜0.001組別對(duì)照組模型組茴香霉素組天麻素+茴香霉素組天麻素組F值P值鼠數(shù)（只）55 5 5 5

2.6 各組幼鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較海馬組織p-p38MAPK、GFAP、Bcl-2、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、茴香霉素組、天麻素+茴香霉素組、天麻素組p-p38MAPK、GFAP、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，茴香霉素組p-p38MAPK、GFAP、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，天麻素+茴香霉素組、天麻素組p-p38MAPK、GFAP、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與茴香霉素組比較，天麻素+茴香霉素組、天麻素組p-p38MAPK、GFAP、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；天麻素組p-p38MAPK、GFAP、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于天麻素+茴香霉素組，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于天麻素+茴香霉素組（P＜0.05）。各組p38MAPK 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、圖5。

圖5 各組幼鼠海馬組織相關(guān)蛋白的Western Blot電泳條帶比較Figure 5 Comparison of the Western Blotting electrophoresis strips of related proteins in hippocampus of young rats in various groups

表5 各組幼鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)比較Table 5 Comparison of the related protein expression in hippocampus of young rats in various groups（）

表5 各組幼鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)比較Table 5 Comparison of the related protein expression in hippocampus of young rats in various groups（）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與茴香霉素組比較；④P＜0.05，與天麻素+茴香霉素組比較

Bax 0.62±0.06 0.97±0.09①1.12± 0.11①②0.83 ± 0.08①②③0.71 ± 0.07①②③④31.640＜0.001組別對(duì)照組模型組茴香霉素組天麻素+茴香霉素組天麻素組F值P值鼠數(shù)（只）56666 p38MAPK 1.01±0.11 0.98±0.10 0.95±0.11 1.02±0.12 0.97±0.10 0.413 0.798 p-p38MAPK 0.36±0.05 0.81±0.08①0.92± 0.09①②0.63 ± 0.07①②③0.47 ± 0.05①②③④60.659＜0.001 GFAP 0.48±0.06 0.86±0.09①1.13± 0.11①②0.71 ± 0.07①②③0.59 ± 0.07①②③④53.338＜0.001 Bcl-2 0.85±0.08 0.35±0.07①0.21± 0.06①②0.62 ± 0.06①②③0.73 ± 0.07①②③④87.093＜0.001

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞亞型，具有多種功能，不僅參與維持神經(jīng)元正常代謝活動(dòng)，為神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)支持，還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成及神經(jīng)突觸的形成[12]。星形膠質(zhì)細(xì)胞增生不僅在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為胞體肥大腫脹，突起加粗、延長(zhǎng)，而且GFAP 表達(dá)增加。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過調(diào)節(jié)離子濃度、谷氨酸釋放以及細(xì)胞間連接功能變化等多種途徑影響神經(jīng)元的興奮性，其發(fā)生活化后，可誘導(dǎo)局部神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性發(fā)生改變，引起異常同步放電，導(dǎo)致癲癇發(fā)作[13]。增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞還可釋放遞質(zhì)和炎癥因子，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞活化和增生，導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作，有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞增生對(duì)于防止癲癇發(fā)作至關(guān)重要[14]。

研究證實(shí)，癲癇過程中伴隨神經(jīng)元病理生理改變，癲癇發(fā)作后迅速引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、壞死，凋亡壞死的神經(jīng)元釋放多種生物活性物質(zhì)，激活補(bǔ)體，進(jìn)而誘發(fā)鄰近神經(jīng)元溶解、凋亡，表現(xiàn)為神經(jīng)元丟失，出現(xiàn)凋亡[15-16]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，風(fēng)邪為癲癇主要病機(jī)，多與肝有關(guān)，若逆氣上巔犯腦，內(nèi)擾腦神，可引發(fā)癇證。腦主神，肝主風(fēng)，而中藥天麻具有熄風(fēng)平肝、祛風(fēng)通絡(luò)、醒腦止癇之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究[17-18]證明，天麻素可通過血腦屏障，可減輕神經(jīng)毒性，減少神經(jīng)元丟失，減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠表現(xiàn)出典型的癇樣腦電波，經(jīng)天麻素干預(yù)后，潛伏期延長(zhǎng)，癇波頻次和大發(fā)作次數(shù)減少，存活神經(jīng)元數(shù)增加，凋亡神經(jīng)元數(shù)減少，亦提示天麻素可保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，具有一定的抗癲癇作用。癲癇發(fā)作過程中，大量神經(jīng)元丟失，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，引起肥大增生，形成膠質(zhì)瘢痕。有研究顯示，天麻素可抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，減少神經(jīng)元凋亡[19]。另有研究顯示，天麻素可減少脊髓背角灰質(zhì)中GFAP 表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕大鼠化療痛反應(yīng)[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)天麻素治療后的癲癇大鼠海馬組織GFAP 表達(dá)較模型組明顯降低，亦提示天麻素可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕癲癇發(fā)作。

神經(jīng)元丟失及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生在癲癇發(fā)作過程中起重要作用，本研究進(jìn)一步采用Western Blot 法證實(shí)了天麻素可減弱GFAP、Bax 蛋白表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2 蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生；但其通過何種機(jī)制發(fā)揮作用尚不清楚。MAPK 通路異常是癲癇大鼠記憶障礙的關(guān)鍵因素。p38MAPK 是MAPK 家族的重要分子，通過凋亡、自噬等多種途徑介導(dǎo)癲癇認(rèn)知障礙，已研究表明，調(diào)控p38MAPK 的表達(dá)可減少神經(jīng)元凋亡，改善癲癇癥狀[21]。本研究在使用天麻素基礎(chǔ)上，添加p38MAPK 通路激活劑茴香霉素，觀察天麻素是否通過抑制p38MAPK 通路發(fā)揮作用，結(jié)果顯示，天麻素+茴香霉素組較茴香霉素組的癲癇癥狀減輕，而天麻素組對(duì)癲癇改善明顯，提示茴香霉素可抵消部分天麻素對(duì)p38MAPK 通路的抑制作用，表明天麻素對(duì)幼鼠癲癇的改善作用及對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的抑制作用，可能是通過抑制p38MAPK通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，天麻素可有效改善癲癇，并對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與抑制p38MAPK通路有關(guān)。