基于分子對(duì)接和表面等離子體共振技術(shù)的大承氣湯治療急性胰腺炎的作用機(jī)制研究

陳穎， 曹伊媛， 陸杰， 張慧倩， 岳華， 梁琨， 王新宏

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082）

急性胰腺炎是一種病情險(xiǎn)惡、并發(fā)癥多、病死率較高的急腹癥，基本病機(jī)為腑氣不通，中醫(yī)學(xué)治療應(yīng)始終貫徹“通里攻下”的思想[1]。大承氣湯是經(jīng)典的“通里攻下”方劑，出自張仲景的《傷寒論》，由大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝4味中藥組成。方中：大黃蕩滌腸胃，泄熱瀉結(jié)為君；芒硝軟堅(jiān)潤燥，瀉熱通便為臣；厚樸、枳實(shí)行氣破結(jié)，消痞除滿為佐。四藥相和，綜瀉下、軟堅(jiān)、消痞、除滿之用，可用于治療“痞滿燥實(shí)”為主要表現(xiàn)的腸梗阻、胰腺膽道疾病等多種疾病[2]。在臨床上，加用大承氣湯優(yōu)于單獨(dú)常規(guī)西藥治療急性重癥胰腺炎，具有良好的臨床應(yīng)用前景[3]。本課題組前期采用膽胰管注射?；悄懰徕c法建立急性胰腺炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大承氣湯可明顯改善模型大鼠的胰腺損傷。同時(shí)，本課題組運(yùn)用超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-LTQ-Orbitrap-MS）技術(shù)對(duì)大承氣湯主要化學(xué)成分進(jìn)行了快速的分析和鑒定[4]。

分子對(duì)接（molecular docking）根據(jù)“鎖-鑰原理”通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法來模擬和預(yù)測蛋白質(zhì)受體與藥物小分子之間的結(jié)合力，是一種高效快速的藥物篩選手段，對(duì)藥效物質(zhì)與作用機(jī)制研究具有重要意義[5-6]。表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是一種無標(biāo)記型光學(xué)檢測手段，通過測定共振角的變化檢測生物分子間的相互作用，可為中藥的活性成分分析以及對(duì)應(yīng)蛋白靶點(diǎn)的鑒定提供有力支撐[7]。

為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)大承氣湯治療急性胰腺炎的潛在分子機(jī)制，本研究立足于中醫(yī)藥整體觀和系統(tǒng)論，通過分子對(duì)接與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，篩選主要活性化合物和關(guān)鍵靶蛋白，以SPR 技術(shù)驗(yàn)證活性成分及潛在靶標(biāo)親和力并評(píng)估其抵抗疾病的活性[8]，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 試藥胡蘿卜苷（批號(hào)：B20517）、和厚樸酚（批號(hào)：B20498）、柚皮素（批號(hào)：B21596）、大黃素-1-O-葡萄糖苷（批號(hào)：B27009）購自于上海源葉生物科技有限公司；厚樸酚（批號(hào)：AB0682-0020）、歐前胡素（批號(hào)：AB0831-0020）、柚皮苷（批號(hào)：AB1848-0020）、橙皮苷（批號(hào)：AB0714-0020）購自于成都埃法生物科技有限公司。

1.2 儀器Biacore T200 生物分子相互作用分析系統(tǒng)（GE Healthcare 公司）；CM-5 芯片購自于GE Healthcare公司。

2 方法

2.1 大承氣湯活性成分篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）（http：//sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php/）搜集大承氣湯中4 味中藥的化學(xué)成分。篩選類藥性（DL）≥0.18、口服利用度（OB）≥30%的化學(xué)成分結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)中報(bào)道過的重要活性成分，共同組成主要活性成分庫。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）查找化合物的 SMILES 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入 Discovery Studio 2016（DS）軟件，轉(zhuǎn)化成3D結(jié)構(gòu)，保存其mol2格式。

2.2 急性胰腺炎靶點(diǎn)預(yù)測及篩選在DrugBank 數(shù)據(jù) 庫（https：//www.drugbank.ca/）和 TTD 數(shù) 據(jù) 庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）中搜索與急性胰腺炎相關(guān)的靶點(diǎn)，并使用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對(duì)檢索到的靶點(diǎn)進(jìn)行命名規(guī)范化處理。PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）提供靶點(diǎn)的x-ray 晶體結(jié)構(gòu)，優(yōu)先選擇Resolution 值小、配體不是金屬離子，且有小分子與蛋白結(jié)合示意圖的靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，作為分子對(duì)接的受體。

2.3 化合物與疾病靶點(diǎn)的分子對(duì)接將靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入DS 軟件，去除蛋白中水分子，準(zhǔn)備蛋白，使其易與小分子化合物對(duì)接。最后，選擇Libdock 模式，對(duì)接公差設(shè)置為0.25，進(jìn)行靶點(diǎn)和化合物的分子對(duì)接，把原配體與蛋白靶點(diǎn)對(duì)接所得的分?jǐn)?shù)作為基礎(chǔ)值，篩選出比之前分?jǐn)?shù)高的化合物，即說明兩者之間親和力更高，結(jié)合較好。若對(duì)接失敗，則上調(diào)對(duì)接公差至0.5。

2.4 成分-靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，通過Cytoscape 3.6.2 軟件“File”“Import”“Import Network from File System”構(gòu)建大承氣湯化學(xué)成分和疾病靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)圖來分析成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

2.5 生物功能及通路的富集分析將篩選出的疾病靶點(diǎn)基因名輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）“Multiple proteins”，物種設(shè)置為“Homosapiens”，其余參數(shù)設(shè)置為保持默認(rèn)，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物學(xué)功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路分析，統(tǒng)計(jì)富集信息。以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）作為篩選條件。

2.6 SPR技術(shù)測定活性成分與靶點(diǎn)蛋白的親和力

2.6.1 蛋白芯片固定 將蛋白通過1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）/N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）偶聯(lián)活化固定在CM5 芯片上，然后根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)篩選蛋白質(zhì)固定在CM5 芯片的最佳 pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5），濃度（20、50、100 μg/mL）摸索，以確保較多的蛋白固定于蛋白芯片上，其蛋白質(zhì)的偶聯(lián)包括3 步：EDC/NHS 的活化；蛋白質(zhì)的偶聯(lián)；乙醇胺封閉蛋白質(zhì)多余的結(jié)合位點(diǎn)。

2.6.2 化合物檢測液配制 精密稱定大黃素-1-O-葡萄糖苷、胡蘿卜苷、厚樸酚、和厚樸酚、歐前胡素、柚皮素、柚皮苷、橙皮苷對(duì)照品適量，分別以二甲基亞砜（DMSO）溶液溶解制成適當(dāng)濃度的對(duì)照品貯備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，再分別加入 DMSO 溶液和 1.05×磷酸緩沖鹽（PBS）溶液，制備成濃度為256 μmol/L 的對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相溶液依次稀釋成濃度為128、64、32、16、8、4 μmol/L的對(duì)照品溶液。

2.6.3 親和力檢測 設(shè)定結(jié)合目標(biāo)蛋白的流通池為檢測通道，未結(jié)合目標(biāo)蛋白的流通池為參比通道，流通池的流速為10 μL/min。同時(shí)，將待測物注入目標(biāo)蛋白流通池和參比流通池，使結(jié)合反應(yīng)在22～24 ℃的條件下進(jìn)行，分別取上述配制梯度的對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測，流動(dòng)相采用含5.0%DMSO的1.05 × PBS 溶液，結(jié)合時(shí)間為60 s，流速為30 μL/min，解離時(shí)間為180 s，同時(shí)配制溶劑校正（solvent correction）曲線的8 個(gè)濃度點(diǎn)，范圍為含4.5% ～ 5.5% DMSO 的PBS 溶液，以消除溶劑對(duì)表面折光率的影響。

2.6.4 親和曲線擬合 進(jìn)樣完成后，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，親和曲線擬合用Biacore T200 軟件進(jìn)行評(píng)估，將穩(wěn)態(tài)親和力模型（1∶1）用于曲線擬合。繪制靶點(diǎn)蛋白與單體化合物的結(jié)合曲線，即SPR 光譜圖，并且計(jì)算獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)如最大結(jié)合濃度（Kd）、最大響應(yīng)值（Rmax）、偏移量（Offset）和卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)（Chi2）。

3 結(jié)果

3.1 大承氣湯活性成分分析由TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到大黃有92 個(gè)成分，枳實(shí)有65 個(gè)成分，厚樸有139 個(gè)成分。芒硝為硫酸鹽礦物藥，化學(xué)式為Na2SO4·10H2O，不計(jì)入后續(xù)研究。篩選并納入文獻(xiàn)報(bào)道的其他活性成分[9]，共收集到37 個(gè)化合物。澤蘭黃醇素、大黃素甲醚二葡糖苷、大黃酸、決明內(nèi)酯、胡蘿卜苷等12 個(gè)成分源自大黃；桉葉醇、和厚樸新酚、厚樸酚、和厚樸酚等4個(gè)成分源自厚樸；異橙黃酮、5，7，4-三甲氧基黃酮、異櫻花素-7-蕓香糖甙、柚皮素、橙皮素、木犀草素、橙皮苷、柚皮苷等21個(gè)成分源自枳實(shí)。

3.2 急性胰腺炎靶點(diǎn)的信息通過搜索DrugBank數(shù)據(jù)庫和TTD 數(shù)據(jù)庫，共獲取430個(gè)與急性胰腺炎相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。篩選出文獻(xiàn)報(bào)道較多，且具有配體及X 線晶體結(jié)構(gòu)的疾病蛋白32 個(gè)，具體靶點(diǎn)信息見表1。

表1 急性胰腺炎潛在的靶點(diǎn)信息Table 1 Potential targets information for acute pancreatitis

3.3 分子對(duì)接分析將上述篩選出的37個(gè)成分與32個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示：454條對(duì)接良好的信息，每個(gè)成分均可以與一個(gè)或多個(gè)蛋白靶點(diǎn)結(jié)合良好。其中，橙皮苷、柚皮苷、和厚樸酚、大黃素-1-O-葡萄糖苷、歐前胡素、厚樸酚、柚皮素、胡蘿卜苷的親和力較高，其分別與26、22、21、21、20、19、19、19 個(gè)蛋白結(jié)合較好，對(duì)接得分見表2。

表2 8個(gè)化合物與蛋白靶點(diǎn)Docking Score值Table 2 Docking Score values of 8 compounds and targets

其中，厚樸酚和細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）蛋白之間的對(duì)接相互作用如圖1-A、B 所示，厚樸酚母核中的羥基與ICAM-1 蛋白中的氨基酸GLU87、VAL89 可形成常規(guī)氫鍵，其鍵長范圍為1.0-1.6?，其苯環(huán)與VAL89 具有疏水結(jié)合Pi-Alkyl 作用，該化合物與ICAM-1對(duì)接能量為-8.540 87 KJ/mol。歐前胡素和ICAM-1 的分子相互作用如圖1-C、D 所示，歐前胡素母核結(jié)構(gòu)主要與ICAM-1中的氨基酸殘基VAL1123、ARG88 形成疏水結(jié)合Pi-Alkyl 作用，同時(shí)，母核上的羰基與VAL89 形成常規(guī)氫鍵，其鍵長范圍為1.0-1.6?，增加了分子與蛋白的結(jié)合，該化合物與ICAM-1對(duì)接能量為-13.485 6 KJ/mol。

圖1 ICAM-1與厚樸酚（A、B），歐前胡素（C、D）的二維及三維分子對(duì)接模式Figure 1 2D and 3D molecular docking patterns of ICAM-1 with magnolol（A，B），Ammidin（C，D）

歐前胡素-絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）蛋白對(duì)接的相互作用如圖2-A、B 所示，苯環(huán)的中心結(jié)構(gòu)與TRP197 形成了π-π相互作用力，又與氨基酸LYS249、LEU246 形成疏水結(jié)合Pi-Alkyl 作用，母核結(jié)構(gòu)上的羰基與ASN201 形成氫鍵，其鍵長范圍為0.9-1.6 ?。

圖2 MAPK14與歐前胡素的二維及三維分子對(duì)接模式（A、B）Figure 2 2D and 3D molecular docking patterns of MAPK14 with Ammidin（A，B）

3.4 成分-靶點(diǎn)互作分析將成分與疾病靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.6.2 軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。紅色橢圓形為大黃成分，綠色三角形為厚樸成分，粉色菱形為枳實(shí)成分，該網(wǎng)絡(luò)由66個(gè)節(jié)點(diǎn)（nodes）和454 條邊（edges）組成，只有29 個(gè)蛋白顯示出與大承氣湯成分對(duì)接良好。根據(jù)參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，ICAM1、MAPK11、MAPK14、ERN1、RAF1、CASP3度值分別為30、30、29、27、27、26。

圖3 大承氣湯“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 “Active ingredient-disease target”network diagram of Da Chengqi Decoction

3.5 生物功能和信號(hào)通路分析將32個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入SRTING 數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)參數(shù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）值，篩選出靶點(diǎn)蛋白富集的前10 條富集GO功能，包括生物過程（biological process，BP）、分子 功 能（molecular function， MF）和 細(xì) 胞 組 成（cellular component，CC），結(jié)果如圖4 顯示。這些靶點(diǎn)參與的生物過程有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、分子功能的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等；分子功能主要與蛋白激酶活性、藥物結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等關(guān)系密切；細(xì)胞組成主要富集在胞漿、胞質(zhì)部分、膜結(jié)合細(xì)胞器等部位。KEGG 富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)蛋白主要參與了癌癥信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、JAK/STAT 信號(hào)通路等，分別有 15、9、9、9、9 個(gè)蛋白富集在上面，表明這些信號(hào)通路與急性胰腺炎緊密相關(guān)。FDR排名前20條信號(hào)通路，見圖5。

圖4 大承氣湯治療急性胰腺炎的基因本體（GO）分析（A、B、C）Figure 4 GO analysis of Da Chengqi Decoction for treatment of acute pancreatitis（A，B，C）

圖5 大承氣湯治療急性胰腺炎的KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis of Da Chengqi Decoction for treatment of acute pancreatitis

3.6 活性成分與靶點(diǎn)蛋白的親和作用分析采用SPR生物傳感器檢測活性成分橙皮苷、柚皮苷、和厚樸酚、大黃素-1-O-葡萄糖苷、歐前胡素、厚樸酚、柚皮素、胡蘿卜苷與關(guān)鍵靶點(diǎn)ICAM1、MAPK14、過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPAR-γ）之間的親和力。其中，ICAM-1 和MAPK14 為“成分-靶點(diǎn)”圖預(yù)測的關(guān)鍵蛋白，PPAR-γ 為文獻(xiàn)報(bào)道的重要靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，8 個(gè)化合物與ICAM-1反應(yīng)作出的擬合曲線中，厚樸酚、歐前胡素與ICAM-1 親和力較好，如圖6 所示。厚樸酚、歐前胡素的解離常數(shù)Kd值較小，各親和力參數(shù)如表3所示。

表3 大承氣湯主要活性成分和ICAM -1之間的親和力動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Affinity kinetic parameters between active compounds and ICAM-1 in Da Chengqi Decoction

圖6 ICAM -1蛋白與大承氣湯主要活性成分結(jié)合SPR分析擬合圖Figure 6 SPR fit plot of ICAM-1 protein and Da Chengqi Decoction active components binding

在對(duì)MAPK14 表現(xiàn)出高響應(yīng)和良好親和力的化合物中，歐前胡素可作出擬合曲線且顯示出較好的親和力，如圖 7 所示。Kd為 19.07 μmol·L-1，Rmax為3.665，Offset為-3.754，Chi2為0.755。

圖7 MAPK14蛋白與歐前胡素結(jié)合SPR分析擬合圖Figure 7 SPR fit plot of MAPK14 protein binding with active component

大黃素-1-O-葡萄糖苷、和厚樸酚、厚樸酚、胡蘿卜苷、歐前胡素與PPAR-γ反應(yīng)可作出擬合曲線，如圖8 所示。其中，大黃素-1-O-葡萄糖苷、和厚樸酚、厚樸酚、胡蘿卜苷、歐前胡素Kd值較小，說明與PPAR-γ親和力較好，各親和力參數(shù)如表4所示。

表4 大承氣湯主要活性成分和PPAR-γ之間的親和力動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Affinity kinetic parameters between Da Chengqi Decoction active compounds and PPAR-γ

4 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了大承氣湯治療急性胰腺炎預(yù)測靶點(diǎn)可能參與的生物過程和作用通路。GO 基因功能注釋結(jié)果表明，大承氣湯治療急性胰腺炎的相關(guān)靶點(diǎn)主要在胞漿、胞質(zhì)部分、膜結(jié)合細(xì)胞器等部位發(fā)生蛋白激酶活性、藥物結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子反應(yīng)，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、分子功能的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程。KEGG 富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)蛋白通過癌癥信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、JAK/STAT 信號(hào)通路等調(diào)控急性胰腺炎。

此外，通過分子對(duì)接篩選出了大承氣湯治療急性胰腺炎的8個(gè)活性成分，這些化合物來自于不同的中藥且與較多的急性胰腺炎相關(guān)靶點(diǎn)顯示出親和力。大黃素-1-O-葡萄糖苷、胡蘿卜苷是大黃的活性成分；厚樸酚、和厚樸酚為厚樸的活性成分；橙皮苷、柚皮苷、歐前胡素、柚皮素為枳殼的活性成分。ICAM1、MAPK11、MAPK14、ERN1、RAF1、CASP3 為分子對(duì)接結(jié)果中度值較高的蛋白，進(jìn)一步證實(shí)了中藥“多成分-多靶點(diǎn)”干預(yù)疾病的整體觀。

ICAM-1 在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，其介導(dǎo)異質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附，并參與一系列重要的生理和病理過程，例如免疫、炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移等[10]。在嚴(yán)重急性胰腺炎患者引發(fā)的免疫反應(yīng)中，可見T淋巴細(xì)胞的抑制活性升高，嗜中性粒細(xì)胞的吞噬活性降低，黏附分子ICAM-1 活化異常[11]。Li 等[12]發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎大鼠胰腺和肝組織中ICAM-1的表達(dá)較高，并且抗炎作用與ICAM-1 表達(dá)的降低有關(guān)。MAPK 是一種促分裂原活化蛋白激酶，MAPK 通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路傳輸體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并在急性胰腺炎的形成機(jī)理中起重要作用[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，重癥急性胰腺炎早期MAPK14 活性上調(diào)，釋放了炎癥細(xì)胞因子，觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重全身炎癥反應(yīng)綜合征，通過控制MAPK14 活性可能是緩解炎癥反應(yīng)的有效途徑[14]。PPAR-γ與急性胰腺炎嚴(yán)重程度相關(guān)，重癥急性胰腺炎大鼠的胰腺及肺臟組織中PPAR-γ表達(dá)上調(diào)，有研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥通過降低PPAR-γ表達(dá)，加重重癥急性胰腺炎炎癥程度[15]。

采用SPR技術(shù)對(duì)ICAM-1、MAPK14和PPAR-γ蛋白與大承氣湯治療急性胰腺炎的8個(gè)化合物進(jìn)行親和力檢測。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)蛋白均可以與1個(gè)或多個(gè)成分顯示出較好的結(jié)合力。現(xiàn)有的報(bào)道證實(shí)了SPR 的結(jié)果，厚樸酚可抑制NF-κB 信號(hào)通路降低ICAM-1 的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[16]。歐前胡素在人類單核細(xì)胞系U937 泡沫細(xì)胞中對(duì)ICAM-1表達(dá)具有抑制作用[17]。故推測ICAM-1 蛋白在大承氣湯治療急性胰腺炎的過程中發(fā)揮著重要作用。歐前胡素也能抑制MAPK14 的磷酸化，減少膠原沉積和炎癥細(xì)胞滲出[18]，這些研究側(cè)面驗(yàn)證了SPR實(shí)驗(yàn)的有效性。PPAR-γ為3 個(gè)蛋白中與化合物結(jié)合力最好的蛋白，然而這一蛋白在分子對(duì)接結(jié)果中并未體現(xiàn)出優(yōu)越性。這一結(jié)果可能與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和SPR技術(shù)的局限性有關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的數(shù)據(jù)信息主要依賴于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫，收錄的信息可能存在偏倚。目前的網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)仍然有限，虛擬計(jì)算結(jié)果呈現(xiàn)假陰性的可能性較高。SPR技術(shù)計(jì)算主要是在體外動(dòng)態(tài)模擬化合物與蛋白芯片的相互結(jié)合，體外的虛擬計(jì)算無法全面反映出藥物的體內(nèi)作用狀態(tài)?；诖?，本課題組下一步將會(huì)從網(wǎng)絡(luò)分析和體外研究，延伸至分子水平、細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平等不同層面展開研究，以期闡明大承氣湯在體內(nèi)對(duì)靶蛋白的作用情況以及大承氣湯通過調(diào)節(jié)AGERAGE 信號(hào)通路、JAK/STAT 信號(hào)通路等改善急性胰腺炎的分子生物學(xué)機(jī)制。