TNFSF13B基因與腎透明細胞癌預后及腫瘤微環(huán)境的關系

鄭浩然，蔣愛民，劉 娜，傅 瀟，姚 煜

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061)

在世界范圍內(nèi)，腎癌約占成人惡性腫瘤的2%～3%，其最常見的病理類型為腎透明細胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)，約占腎癌病理分型的75%[1]。RCCC預后差，早期診斷困難，20%的患者初診時已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，晚期患者5年生存率小于10%[2]。因此，找到RCCC早期診斷及預后相關的生物標志物至關重要。以培唑帕尼、舒尼替尼等為代表的靶向治療是晚期RCCC的傳統(tǒng)一線治療。近年來，免疫治療的出現(xiàn)在晚期RCCC的治療中具有里程碑式意義[3]，腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)也成為當下的研究熱點。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學方法找到與RCCC腫瘤微環(huán)境相關的差異表達基因TNFSF13B，進一步驗證了其在RCCC中的表達、對RCCC預后的影響及其與RCCC腫瘤微環(huán)境成分的關系，為RCCC的發(fā)病機制、早期診斷、綜合治療及預后評價提供了新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源605例RCCC病例(正常樣品72例，腫瘤樣品533例)的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)和相應的臨床數(shù)據(jù)均從TCGA數(shù)據(jù)庫(https:∥portal.gdc.cancer.gov/)下載。

1.2 ESTIMATE評分、免疫評分和基質(zhì)評分的計算

使用R語言estimate包中的ESTIMATE算法估計腫瘤微環(huán)境中免疫成分和基質(zhì)成分的比率，以3種得分的形式展現(xiàn)：免疫評分(immune score)、基質(zhì)評分(stromal score)和ESTIMATE評分。其分別與免疫成分、基質(zhì)成分和兩者之和呈正相關。得分越高，TME中相應成分的比率越大[4]。

1.3 生存分析及臨床相關性分析使用R語言survminer包進行生存分析，生存曲線通過Kaplan-Meier法繪制，采用對數(shù)秩和檢驗，以P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。使用Wilcoxon秩和檢驗或Kruskal-Wallis秩和檢驗進行臨床相關性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 在免疫評分和基質(zhì)評分的高分組和低分組之間生成差異表達基因根據(jù)免疫評分和基質(zhì)評分的中位數(shù)將腫瘤樣本分為高分組和低分組。通過R語言limma包對高分組之間和低分組之間分別進行分析，篩選出差異表達基因(differently expressed genes,DEGs)[5]。以|log2FC|>1和錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為DEGs的截斷標準。

1.5 GO和KEGG富集分析通過R語言clusterProfiler、enrichplot、ggplot2軟件包對篩選出的93個DEGs進行基因本體(gene ontology，GO)分析及京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，以P值和q值均小于0.05為顯著性富集。

1.6 識別核心基因首先，采用STRING(https:∥string-db.org/)數(shù)據(jù)庫對DEGs進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction，PPI)構建[6]。隨后，運用Cytoscape 3.8.0(http:∥www.cytoscape.org/)[7]中的cytohubba插件對PPI網(wǎng)絡進行重構，采用交互關系置信度大于0.95的節(jié)點構建網(wǎng)絡。其次，通過R語言survival包進行單因素Cox回歸分析，分析結果在森林圖中顯示。最后，對PPI網(wǎng)絡及單因素Cox回歸分析中發(fā)現(xiàn)的DEGs繪制韋恩圖以獲得核心基因。

1.7 GSEA富集分析從Molecular Signatures(https:∥www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)數(shù)據(jù)庫下載Hallmark和C7(免疫相關通路)數(shù)據(jù)集作為目標集，進行GSEA富集分析[8]。用所有腫瘤標本的全部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行GSEA富集分析，只有當NOMP<0.05且FDRq<0.06時即為顯著性富集。

1.8 腫瘤浸潤性免疫細胞譜及其相關性分析通過R語言CIBERSORT算法估算所有腫瘤樣本中腫瘤浸潤性免疫細胞的豐度分布。隨后進行免疫細胞間相關性分析、免疫細胞與基因表達水平差異性和相關性分析。

1.9 HPA數(shù)據(jù)庫運用HPA數(shù)據(jù)庫(https:∥www.proteinatlas.org/)初步驗證基因在RCCC和正常組織中的蛋白質(zhì)表達情況。

2 結 果

2.1 高免疫評分與RCCC患者不良預后及淋巴結轉(zhuǎn)移相關除了腫瘤細胞外，TME主要由免疫細胞和基質(zhì)細胞等成分組成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中產(chǎn)生重要作用[9]。基質(zhì)細胞已被證實在腫瘤的血管生成和基質(zhì)重塑方面發(fā)揮重要作用[10]。而TME中不同種類的免疫細胞在抗腫瘤和促腫瘤方面發(fā)揮不同作用。越來越多的研究表明，TME中腫瘤浸潤性免疫細胞水平可能作為療效預測的指標[11]。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫下載RCCC患者的基因表達譜數(shù)據(jù)，通過ESTIMATE算法計算免疫評分、基質(zhì)評分和ESTIMATE評分，進而估計免疫細胞和基質(zhì)細胞在RCCC微環(huán)境中所占的比例。對三種評分分別進行Kaplan-Meier生存分析以建立TME中免疫和基質(zhì)比例與患者生存的相關性(圖1)。結果表明，免疫評分高與RCCC患者預后不良相關(P=0.033，圖1B)。然而，ESTIMATE評分和基質(zhì)評分與患者預后無相關性(圖1A和圖1C)。隨后，我們研究了3種評分與RCCC主要臨床病理特征的關系(圖2)，結果顯示，免疫評分高與RCCC淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關(P=0.021，圖2G)。

2.2 基于免疫評分和基質(zhì)評分篩選DEGs并進行GO和KEGG富集分析將RCCC樣本根據(jù)免疫評分和基質(zhì)評分的中位數(shù)分為高分組和低分組，構建基因表達譜熱圖(圖3A、C)，進而篩選出DEGs。結果表明，兩組之間有44個上調(diào)的DEGs和49個下調(diào)的DEGs(圖3B、D)。隨后，我們對這些DEGs進行了GO和KEGG富集分析，以研究這些DEGs最常見的生物學過程和途徑。GO富集分析結果表明，這些DEGs主要參與B細胞增殖、體液免疫應答、白細胞增殖、淋巴細胞增殖和單核細胞增殖(圖3E)。KEGG富集分析結果表明，這些DEGs主要在細胞因子-細胞因子-受體相互作用、造血細胞系、原發(fā)性免疫缺陷、酮體的合成和降解等通路富集(圖3F)。

2.3 通過PPI網(wǎng)絡和單因素Cox回歸分析確定核心基因我們對DEGs進行PPI網(wǎng)絡構建和單因素Cox回歸分析，以確定RCCC中潛在的與預后相關的核心基因。圖4A顯示了前52個基因之間的蛋白質(zhì)相互作用，圖4B用條形圖表示按節(jié)點數(shù)排列的前30個基因。單因素Cox回歸分析結果表明，23個DEGs與RCCC的預后相關(圖4C)。最后，我們選擇PPI網(wǎng)絡中的前20個基因與單因素Cox回歸分析篩選出的23個基因并繪制韋恩圖，從而確定核心基因。結果表明，只有IGLL5和TNFSF13B重疊(圖4D)。

A：ESTIMATE評分；B：免疫評分；C：基質(zhì)評分。

A～D：ESTIMATE評分；E～H：免疫評分；I～L：基質(zhì)評分。

A：基質(zhì)評分DEGs熱圖；B：免疫評分DEGs熱圖；C：免疫評分和基質(zhì)評分共有上調(diào)DEGs的韋恩圖；D：免疫評分和基質(zhì)評分共有下調(diào)DEGs的韋恩圖；E：DEGs的GO富集分析；F：DEGs的KEGG富集分析。

A：PPI網(wǎng)絡；B：按節(jié)點數(shù)排列的前30個基因；C：DEGs的單因素Cox回歸分析；D：PPI網(wǎng)絡中前20個基因和單因素Cox回歸分析共有基因的韋恩圖。

2.4TNFSF13B的表達與RCCC預后、N分期及TME相關TNFSF13B又稱B細胞激活因子(BAFF)，在B細胞生存、增殖、向漿細胞分化等方面發(fā)揮關鍵作用[12]。作為免疫相關基因，我們進一步研究了TNSF13B表達與RCCC預后、臨床病理特征和TME的關系。結果表明TNFSF13B在RCCC腫瘤組織中的表達顯著升高(圖5A、B)。通過HPA數(shù)據(jù)庫初步驗證TNFSF13B蛋白在RCCC組織中的表達高于正常組織(圖8D)。生存分析結果表明TNFSF13B高表達與RCCC患者更短的總體生存率(OS)顯著相關(圖5C，P<0.001)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)TNFSF13B的高表達與RCCC淋巴結轉(zhuǎn)移相關(圖5F)。隨后，對C7基因集(免疫相關通路)的GSEA富集分析結果顯示，TNFSF13B的高表達主要在抗原的處理和提呈、趨化因子信號通路、細胞因子-細胞因子-受體相互作用和自然殺傷細胞介導的毒性等通路富集(圖6A)。此外，對Hallmark基因集的GSEA富集分析結果表明，在TNFSF13B高表達組中，多個免疫通路相關基因集，如移植物排斥反應、細胞凋亡、補體、IL2-STAT5信號通路和IL6-JAK-STAT3信號通路等顯著富集(圖6B)。這表明，TNFSF13B與RCCC免疫微環(huán)境存在一定的相關性。

A：TNFSF13B在RCCC腫瘤組織和正常組織中的表達；B：同一患者來源的正常組織和腫瘤組織中TNFSF13B表達的配對差異性分析；C：不同TNFSF13B表達RCCC患者的生存分析；D～G：TNFSF13B表達與RCCC患者臨床病理特征的相關性。

A：TNFSF13B高表達樣本中C7基因集的GSEA富集分析；B：TNFSF13B高表達樣本中Hallmark基因集的GSEA富集分析。

2.5TNFSF13B表達與腫瘤浸潤性免疫細胞的相關性為了進一步證實TNFSF13B表達與RCCC免疫微環(huán)境的相關性，我們采用CIBERSORT算法分析了RCCC腫瘤浸潤免疫細胞亞群的豐度分布(圖7A)，構建了RCCC樣本的21種免疫細胞相關性圖譜(圖7B)。我們進一步繪制了免疫細胞浸潤水平相對于TNFSF13B表達水平差異性的小提琴圖(圖8A)和免疫細胞浸潤水平與TNFSF13B表達水平相關性的散點圖(圖8B)。差異性和相關性分析結果表明，共11種腫瘤浸潤免疫細胞與TNFSF13B表達相關(圖8C)。其中未成熟B細胞、靜息CD4+記憶T細胞、活躍樹突狀細胞、靜息肥大細胞與TNFSF13B表達呈負相關。CD8+T細胞、活躍的CD4+記憶T細胞、Tfh細胞、Treg細胞、γδT細胞、靜息的NK細胞、嗜酸性粒細胞與TNFSF13B表達呈正相關。這些結果進一步證實TNFSF13B表達會對RCCC腫瘤免疫微環(huán)境產(chǎn)生一定影響。

A：RCCC樣本中21種腫瘤浸潤性免疫細胞比例；B：RCCC樣本中21種腫瘤浸潤性免疫細胞的相關性。

A：RCCC中21種腫瘤浸潤性免疫細胞比例相對于TNFSF13B表達水平差異性分析的小提琴圖；B：RCCC中15種腫瘤浸潤性免疫細胞與TNFSF13B表達水平相關性的散點圖；C：差異性分析和相關性分析共有的腫瘤浸潤性免疫細胞韋恩圖；D：TNFSF13B蛋白在RCCC腫瘤組織和正常組織中的表達。

3 討 論

大量研究表明RCCC是免疫原性惡性腫瘤，TME中存在大量浸潤性免疫細胞，如CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、NK細胞、髓樣細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)等[13]。然而，CD8+T細胞和CD4+T細胞的大量浸潤卻與RCCC的高分級和生存期縮短相關。研究表明，CD8+T細胞的高增殖率與RCCC患者生存期延長相關，這表明免疫細胞的功能狀態(tài)是決定其抗腫瘤活性的關鍵因素。RCCC中腫瘤浸潤性淋巴細胞無法發(fā)揮抗腫瘤功能可能是與Treg細胞、MDSCs等免疫抑制性細胞的大量浸潤相關[14]。RCCC的免疫抑制狀態(tài)可以通過應用靶向免疫檢查點抑制劑的負向調(diào)節(jié)作用打破，恢復抗腫瘤免疫反應。RCCC中30%的患者存在PD-L1的過表達[15]，TME中亦經(jīng)常發(fā)現(xiàn)PD-1陽性的巨噬細胞、MDSCs和NK細胞。巨噬細胞中PD-1的表達與M2型巨噬細胞的極化以及IL-6的產(chǎn)生增加相關，從而導致免疫抑制及腫瘤進展[16]。免疫檢查點抑制劑在RCCC的治療過程中顯示出良好的療效，目前，免疫治療以及免疫治療聯(lián)合靶向治療已經(jīng)成為晚期RCCC患者的標準治療模式。盡管如此，部分RCCC患者對免疫治療響應差，找到能夠影響RCCC腫瘤微環(huán)境及預測免疫治療療效的生物標志物至關重要。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)掘出的與RCCC患者預后及TME相關的關鍵基因TNFSF13B又稱B細胞激活因子(B cell activating factor,BAFF)，是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)家族成員之一，在B細胞增殖分化過程中發(fā)揮重要作用。血液中可溶性BAFF的升高與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關[17]。自發(fā)現(xiàn)以來，BAFF在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用一直是研究的熱點。由于BAFF在維持B細胞和漿細胞的存活方面發(fā)揮重要作用，血清中BAFF水平的升高與多發(fā)性骨髓瘤和B淋巴細胞惡性腫瘤患者不良預后相關[18-19]。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)批準的抗BAFF抗體貝利木單抗(Belimumab)只適用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療，其在B細胞淋巴瘤的療效仍在臨床試驗過程中[20]。在實體瘤中，已有研究表明，胰腺癌、腎癌及神經(jīng)內(nèi)分泌癌等腫瘤中TNFSF13B表達升高，且與患者不良預后相關[21-23]。RIHACEK等[24]的研究表明BAFF可能通過促進炎癥反應及胰島素抵抗導致癌癥患者晚期惡病質(zhì)的出現(xiàn)。最近，YARCHOAN等[25]的研究表明，BAFF在TME中發(fā)揮雙重作用：既可以增強B細胞對CD4+Th細胞的抗原提呈能力，增強TME中Th1細胞的抗腫瘤活性，又能夠?qū)е耇ME中Treg細胞的增加，從而介導腫瘤免疫逃逸。我們的研究發(fā)現(xiàn)Treg細胞浸潤水平與TNFSF13B表達呈正相關，這說明TNFSF13B高表達可能與RCCC免疫逃逸及免疫抑制狀態(tài)相關。CD8+T細胞、活躍的CD4+記憶T細胞等抗腫瘤免疫細胞水平雖然與TNFSF13B表達呈正相關，但其功能可能處于抑制狀態(tài)，無法發(fā)揮抗腫瘤效應。TNFSF13B對RCCC腫瘤微環(huán)境影響的具體機制仍有待于更詳細、更具體的體內(nèi)外研究的進一步開展。

綜上所述，TNFSF13B基因高表達與RCCC患者的不良預后顯著相關，并對RCCC腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生一定影響。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫進行研究，存在一定的局限性，如樣本量較小、未通過真實世界進行驗證等。但本研究找到了與RCCC預后及TME相關的關鍵基因，為RCCC的發(fā)病機制、早期診斷、預后評估及治療策略提供了一定的依據(jù)，為新型藥品的研發(fā)及RCCC基礎與臨床試驗提供了新思路。TNFSF13B有望成為RCCC新的潛在治療靶點和預后相關的生物學標志物。