棉花UGPase 基因鑒定與生物信息學分析

張嵐，程琦，梁士辰，鄧雨瀟，潘玉欣

（華北理工大學生命科學學院，河北 唐山 063210）

尿苷二磷酸葡萄糖 （Uridine diphosphate glucose,UDPG）作為反應底物和產物，參與蔗糖、纖維素、糖蛋白、糖脂和碳水化合物等合成代謝過程[1]。 UDP- 葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase）可逆催化葡萄糖-1-磷酸與尿苷三磷酸（Uridine triphosphate）反應形成UDPG 和焦磷酸。 在葡萄糖合成糖原過程中，UGPase 催化葡萄糖-1- 磷酸與UTP 分子合成為UDPG； 在糖原分解過程中，UGPase 催化UDPG轉化為葡萄糖-1-磷酸。

到目前為止，UGPase已經在多種植物中被鑒定，如水稻[2]、黃芪[3]、大麥[4]、馬鈴薯[5]、香蕉[6]和陸地棉[7]等。植物通常含有UGPase-A 和UGPase-B兩類蛋白。UGPase-B 蛋白與UGPase-A 沒有同源性，但具有相同的催化功能[8]。 在大麥葉片、胚胎和胚乳中僅發現1 種類型的UGPase 蛋白[4]，馬鈴薯中UGPase等位基因多態性導致cDNA 序列的微小差異[9]，在擬南芥、水稻和楊樹中均發現有2個高度同源的UGPase-A 基因[1,10]； 在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii） 和擬南芥中發現了與UGPase-A 基因具有相同催化功能的UGPase-B基因[11-12]。

棉花是世界上重要的纖維作物。 已有的研究表明UGPase基因參與纖維素的合成。 在擬南芥中過表達陸地棉（Gossypium hirsutum）GhUGP基因，可導致轉基因擬南芥的可溶性糖、淀粉和纖維素含量增加[7]。 在黃麻中過表達CcUGPase基因， 轉基因植物的株高和纖維素含量都有所增加，但木質素含量沒有變化[13]。棉花基因組在一億三千萬年前經歷了雙子葉植物共同祖先物種的1次全基因組三倍化事件，而后棉花物種又發生了獨立的全基因組五倍化事件[14-15]。 這種全基因組水平上的加倍事件增加了基因的多樣性。 而在棉花全基因組水平研究UGPase基因家族成員基因結構、進化特征、組織表達等未見報道。

本研究將在全基因組水平上鑒定亞洲棉（G.arboreum）、雷蒙德氏棉（G. raimondii）、異源四倍體陸地棉、海島棉（G.barbadense）、葡萄、榴蓮、可可等19 種植物中的UGPase基因家族成員，從系統發育、基因結構、選擇壓力、表達特性等多方面進行比較分析，以推斷其進化規律，為深入研究棉花UGPase基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源和UGPase 基因家族成員鑒定

在SGD（https://www.yeastgenome.org/）數據庫中下載1 個酵母UGPase基因。 從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）下載得到3 個擬南芥UGPase基 因（AT3G56040.1、AT3G03250.1、AT5G17310.2）序列。 二倍體的亞洲棉、雷蒙德氏棉，四倍體的陸地棉、 海島棉全基因組序列數據來源于Cotton-FGD（（https://cottonfgd.org/）[16]。 4 種雙子葉植物葡萄（Vitis vinifera）、可可（Theobroma cacao）、楊樹（Populus trichocarpa）、榴 蓮（Durio zibethinusMurr.），單子葉植物水稻（Oryza sativa），基部被子植物無油樟 （Amborella trichopoda），5 種藻類萊茵衣藻、綠色鞭毛藻（Ostreococcus lucimarinus）、膠球藻（Coccomyxa subellipsoidea）、團藻（Volvox carteri）和細小微胞藻（Micromonas pusilla），小立碗蘚（Physcomitrella patens）以及卷柏（Selaginella moellendorffii）的全基因組序列數據下載自Phytozome 網站（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

以擬南芥UGPase 蛋白質序列為種子序列，通過本地blastp[17]對上述所有物種基因組數據進行全基因組檢索，設置E值≤1e-5，氨基酸序列一致性≥40%，打分≥100，初步獲取各物種基因組中UGPase候選基因。 然后通過Pfam 網站（https://pfam.xfam.org,v32.0）[18]預測候選基因的結構域，具有UGPase 結構域（PF01704）的即為UGPase基因家族成員。 在ExPASy（https://www.expasy.org/） 對棉花UGPase 蛋白的理化性質進行預測。

1.2 多序列比對和進化樹構建

利用MEGA X[19]軟件對UGPase基因家族成員進行多序列比對與進化樹構建，采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）和JTT＋G（Jones-Taylor-Thornton＋Gamma-Distributed rates）模型，bootstrap 值設為1 000。

1.3 基因結構分析和蛋白質保守基序分析

根據各基因組基因位置文件，利用數據處理工具TBtools[20]繪制基因結構；利用序列分析工具MEME[21]（http://meme-suite.org/, v5.1）分 析 上 述19 個物種的UGPase 蛋白中的保守基序。 參數設置：基序最大發現數量為25，基序最大長度為50 nt（Nucleotide，核苷酸）。

1.4 同源基因鑒定及Ks 值分析

利用蛋白序列同源性分析工具OrthoMCL[22]。（參數設置：E值≤1e-5、 一致性≥50%、 膨脹系數＞1.5）鑒定亞洲棉、雷蒙德氏棉、陸地棉、海島棉、葡萄、可可和榴蓮基因組中的直系同源和旁系同源UGPase基因，并利用Circos[23]軟件繪制基因同源關系圖。

利用Perl 語言編寫程序， 計算棉花UGPase基因家族成員同源基因對間的同義替換率Ks值，并利用Circos[23]軟件圖形化展示基因間的Ks值。

1.5 選擇壓力分析

使用EasyCodeML[24]軟件位點模型方法對UGPase基因進行選擇壓力分析。ω表示Ka/Ks，ω＞1 表示進化中主要受正選擇影響，ω＜1 表示進化中主要受負選擇影響，ω＝1 表示進化中主要受中性選擇影響。

1.6 UGPase 基因在陸地棉纖維中表達分析

從CottonFGD 網站下載陸地棉UGPase基因表達數據， 基因表達量的衡量指標為RPKM（Reads per kilobases per million reads， 每百萬片段中來自某基因每千堿基長度的片段數），用TBtools 繪制基因表達熱圖。分析UGPase基因在胚珠發育的10 個時期〔－3 DPA（day post anthesis， 開 花 后 天 數）、－1 DPA、0 DPA、1 DPA、3 DPA、5 DPA、10 DPA、20 DPA、25 DPA、35 DPA〕和纖維發育的4 個時期（5、10、20、25 DPA），及在根、莖、葉、花托、花瓣、雄蕊、雌蕊、副萼的表達量。

2 結果與分析

2.1 UGPase 基因家族成員鑒定

對4 個棉種和其他15 個代表物種進行蛋白序列比對初篩和特征結構域復篩， 鑒定出79 個UGPase基因。 其中來自雷德蒙氏棉的最多（13個）；其次為海島棉（12 個）；然后依次為單子葉植物水稻（11 個）、陸地棉（9 個）、亞洲棉和小立碗蘚（各4 個）；其余低等植物和酵母中UPGase基因數目為1～3（圖1 和附表1）。 除雷蒙德氏棉和釀酒酵母外， 其余物種中均含有UGPase-B 類基因。綠色鞭毛藻和細小微胞藻不含UGPase-A 類基因，其余物種均含有UGPase-A 類基因。 總體上各物種中UGPase-A 類基因多于UGPase-B類，且UGPase-A 類基因隨著物種進化發生了明顯的基因擴張。

2.2 UGPase 基因家族系統進化分析

同源性分析表明UGPase-A 類蛋白和UGPase-B 類蛋白同源性極低， 因此對上述19 個物種的UGPase-A 蛋白和UGPase-B 蛋白分別構建系統進化樹（圖2）。 UGPase-A 類蛋白分為4 組，棉花UGPase-A 類蛋白分布在A1、A2 和A3 亞組，其中A1 亞組只有棉花UGPase 蛋白，A2 亞組成員來自棉花、可可、葡萄和榴蓮4 個物種，A3 亞組成員來自棉花和無油樟，A4 亞組成員來自9 個物種。這說明棉花UGPase-A 基因可能在結構或功能上發生了分化。所有UGPase-B 類基因聚在一起（B 組），表明棉花UGPase-B 類基因并沒有表現出明顯的分化。

對比葡萄基因組進化過程，棉花基因組又經歷1 次五倍化過程（圖1），因此葡萄基因組中的單個基因， 在棉花基因組中應該有5 個對應基因。但葡萄和棉花都僅有1 個UGPase-B 基因，說明棉花中丟失了約80%的UGPase-B 基因， 在其他物種基因組中也存在類似的丟失現象 （圖2B）。這與文獻報道一致，在棉花全基因組加倍事件中發生大量的基因丟失、 染色體重排現象，有約70%基因丟失[15]。

2.3 UGPase 蛋白保守基序及對應的基因結構分析

為探究UGPase家族基因的起源和進化模式，用MEME 程序檢測了25 個基序（圖3）。結果表明UGPase-A 蛋白和UGPase-B 蛋白幾乎沒有同源性，兩者僅共有基序11 和基序23，且只存在于部分蛋白中。基序11 只存在于A3 亞組的棉花UGPase-A 中， 而在所有UGPase-B 蛋白中都存在。基序23 存在于所有高等植物的UGPase-A 蛋白， 以及雙子葉植物可可、 榴蓮、 棉花的UGPase-B 蛋白。 這些結果表明，在單雙子葉植物分化后，UGPase 蛋白功能發生了一定的變化。 值得注意的是， 基序11 和基序23 在UGPase-A 和UGPase-B 中位置不同， 而且共有的基序11 存在于不同的特征結構域中。 在UGPase-A 蛋白中，基序11 和基序25 構成Ribosomal_S2 結構域，且Ribosomal_S2 結構域僅在A3 亞組的棉花UGPase 中檢測到， 因此Ribosomal_S2 并不是這些蛋白的主要結構域。 但在UGPase-B 蛋白中，基序11 與基序14、基序13、基序16 和基序21 則構成UGPase-B 蛋白的重要結構域。

比較A1、A2、A3 和A4 四個亞組發現，棉花UGPase-A 蛋白在進化過程中存在基序丟失現象。 在A1 亞組中，棉花UGPase-A 蛋白僅保留基序4；在A2 亞組中，棉花GbD07G02825 僅保留基序20；在A3 亞組中，有3 個棉花UGPase-A 蛋白只有基序9。 上述3 個亞組中的棉花基因均來自棉花D 基因組，說明棉花D 基因組的UGPase基序丟失現象比較嚴重。

對棉花和其他15 個物種的基因結構分析顯示，低等植物中UGPase-A 基因的外顯子較長；高等植物中UGPase-A 類基因的外顯子較短。 含有Ribosomal_S2 結構域的蛋白中，其基因5'端外顯子較長。UGPase-B 類基因5'端外顯子普遍較長。無油樟和雙子葉植物UGPase-B 類基因均存在較長的內含子。

綜上，UGPase-B 類基因比較保守。 在單子葉、雙子葉植物進化分離后，UGPase-A 類基因結構差異較大。 棉花UGPase-A 類基因可能發生了結構或功能上的分化，這與系統進化分析中得到的結論一致。

2.4 UGPase 基因同源性及Ks 值分析

同源基因分為直系同源基因和旁系同源基因。 直系同源基因是指2 個物種中來源于共同祖先的同源基因，旁系同源則是基因復制產生的同源基因。 為了解棉花UGPase家族基因的同源進化問題，引入葡萄、可可和榴蓮作為參考物種進行分析。 在葡萄和可可中未檢測到UGPase旁系同源基因，在榴蓮中發現1 對旁系同源基因。 在榴蓮和可可間有3 對同源基因，在榴蓮和陸地棉間有1 對直系同源基因。 棉花中的同源基因對較多，包括32 對直系同源基因和12 對旁系同源基因（圖4）。 由此推斷棉花中UGPase基因主要由共同祖先基因組加倍產生。

Ks是基因的同義置換率，反映了基因的分歧時間。 棉花A 和D 基因祖先分歧時間對應的Ks值為0.032， 異源四倍體棉花形成時間對應的Ks值為0.007～0.009， 陸地棉和海島棉分歧時間對應的Ks值為0.003（480 萬年前）[25]。 因此，按棉花各祖先基因組形成時間和各物種的分歧時間，可將Ks分為4 個區間0～0.003、0.003～0.009、0.009～0.032 和大于0.032。43.2%同源基因對（19對）Ks值大于0.032，38.6%同源基因對（17 對）Ks值處于0.009～0.032，11.4%的同源基因對（5 對）Ks值處于0～0.003，6.8%的同源基因對 （3 對）Ks值處于0.003～0.009。 這說明棉花大部分UGPase基因產生于異源四倍體棉花形成前，也證明了棉花UGPase基因主要來源于棉花基因組的加倍。

2.5 棉花UGPase 基因家族適應性進化分析

為研究UGPase基因在棉花中是否發生了適應性進化， 利用EasyCodeML 程序按照A1、A2、A3 和B 四個亞組分別進行UGPase基因的選擇壓力分析。 位點模型結果顯示，棉花中的UGPase基因主要受到純化選擇影響， 以同義突變為主。在A3 亞組UGPase基因中檢測到11 個位點受到顯著正選擇影響（表1），且均分布于基因的5'端。但在A1、A2 和B 亞組UGPase基因中未發現顯著正選擇位點。這表明，雖然UGPase基因在進化中主要受到純化選擇影響， 但在A3 亞組UG Pase基因中仍有少量位點受到正選擇， 這些顯著位點可能引起UGPase基因在結構或功能上的分化。

表1 棉花UGPase 基因選擇壓力位點模型檢測結果Table 1 Results of model test for selecting pressure sites in cotton UGPase genes

2.6 UGPase 基因在陸地棉中表達分析

從棉花數據庫CottonFGD 網站下載陸地棉（JGI assembly）UGPase基因的轉錄組數據， 包括根、莖、葉、花托、花瓣、雄蕊、雌蕊、副萼和胚珠發育的10 個時期以及纖維發育的4 個時期的表達量。 利用TBtools 軟件展示表達結果見圖5。 9 個陸地棉UGPase基因的表達模式和表達量有明顯的差別。 在A1 亞組中GhD11G03015 和GhA11G03147 在各發育時期和檢測的各組織中表達量都較高；GhD11G03160 和GhD04G00927在棉纖維發育的不同時期及器官中表達量都極低。 表達量極低的2 個基因編碼產物中僅包含基序4， 說明UGPase 保守基序的丟失可能影響其基因的表達。 通過比較陸地棉UGPase-A 類基因和UGPase-B 類基因的表達模式，發現UGPase-A類在根、葉中表達量較高，同時UGPase-A 類基因在雌蕊和雄蕊中表達較高；UGPase-B 類基因在雄蕊中表達量較低，在花萼和花托中高表達。 在纖維和胚珠發育的各時期，UGPase-A 類基因表達量較UGPase-B 類基因高，UGPase-A 類基因在5 DPA 表達量最高；UGPase基因在3～25 DPA 的胚珠中表達量較高。 這暗示棉花UGPase基因，尤其是UGPase-A 類基因在棉花纖維細胞的起始和伸長中起重要作用。

3 討論

UGPase 是糖代謝過程中的一類重要酶，在植物的生長發育過程中起重要作用[26]。 而目前植物中鑒定該類基因的研究較少[27]。 本研究在亞洲棉、雷蒙德氏棉、陸地棉以及海島棉中分別鑒定出4、13、9 和12 個UGPase基因，在葡萄、可可和榴蓮中分別鑒定出2、2 和3 種UGPase基因。 基因數目上的差異表明棉花中的UGPase基因家族成員與其它3 種雙子葉植物相比，有較為明顯的擴增。

UGPase 分為UGPase-A 與UGPase-B 兩類，2類蛋白結構差異較大，各類蛋白保守性較高[26,28]。本研究中的UGPase基因結構分析可知，棉花、擬南芥、葡萄等植物含有2 類UGPase 蛋白，且不同植物間同類UGPase 結構保守性較高。 棉花UGPase-A 類基因分布在A1、A2、A3 亞組中，而水稻UGPase-A 類基因全部聚在A4 亞組， 暗示UGPase基因在單雙子葉植物之間存在不同的進化軌跡。 A3 亞組UGPase-A 蛋白的氨基端包含1個特殊的含有基序11 和基序25 的結構域，這個結構域在其他組是不存在的。 在棉花A3 亞組發現11 個顯著正選擇位點， 這些正選擇位點主要分布在基因5'端。 這與A3 亞組基因在5'端的新結構域一致，說明UGPase基因在棉花中發生了分化。 棉花與葡萄、可可、榴蓮UGPase基因的同源性分析顯示，棉花中存在較多同源基因，且大部分的棉花UGPase基因的Ks值大于0.009， 推斷棉花UGPase基因大部分來源于棉花基因組加倍事件。

UGPase存在于植物光合組織和非光合組織中，參與營養生長以及生殖生長[26-27,29]。 擬南芥AtUGP1和AtUGP2突變體影響擬南芥生長[30]。水稻中OsUpg1和OsUpg2調控花粉不育和育性轉換過程[31]。除此，在擬南芥、楊樹、番茄等多種植物中均證實UGPase 影響細胞壁成分[32-34]。UGPase基因在陸地棉中的表達分析結果顯示， 其在根、莖、葉、花、纖維、胚珠等不同器官都有表達，這與文獻報道結果類似，GhUGP（即GhD11G03015）在擬南芥中的過表達試驗證實，UGPase基因參與調控葡萄糖向葡萄糖-1- 磷酸的轉化，GhUGP的表達對擬南芥莖中纖維素含量增加有促進作用[7]。 表達量較高的GhD11G03015、GhA11G03147和較低的GhD11G03160、GhD04G00927 都屬于A1 亞組，推測保守基序的改變及丟失可能影響該類基因的表達。 UGPase-B 類基因在雄蕊中表達量高，這揭示了2 類基因功能上的差異。

4 結論

在全基因組水平上鑒定了亞洲棉、雷蒙德氏棉、陸地棉和海島棉等19 種植物中的UGPase基因家族成員。UGPase基因包含UGPase-A 和UGPase-B 兩個類型。 隨著棉花的全基因組加倍，棉花UGPase-A 類基因發生了明顯的基因擴張，且在結構和功能上發生分化； 棉花UGPase-B 類基因在進化上十分保守。 同源性分析顯示，棉花UGPase基因主要來源于棉花四倍體形成前的基因組加倍。 表達分析顯示，UGPase基因尤其是UGPase-A 類基因在棉花纖維細胞的生長發育中起重要作用。 棉花UGPase基因家族鑒定及進化分析為深入了解UGPase基因功能奠定了基礎。

附表：

附表詳細內容參見https://journal.cricaas.com.cn

附表1 棉花UGPase 蛋白的理化性質

Table S1 The physicochemical properities of UGPase proteins in cotton