棉花光敏雄性不育系psm5 的培育及其育性轉變規律

茍浩琦，馬常凱，張遷，范術麗，馬啟峰，張朝軍

（中國農業科學院棉花研究所/ 棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000）

雄性不育在植物界中較為普遍，可遺傳的雄性不育分為染色體型和基因型。 染色體型主要是由遠緣雜交引起，導致子代表現出雄性不育的性狀。基因型雄性不育又可分為核質互作雄性不育型和細胞核雄性不育型[1]，在棉花中均有發現。棉花細胞質不育系主要有哈克尼西棉胞質不育系[2-3]、亞洲棉胞質不育系、異常棉胞質不育系[4-5]、三裂棉胞質不育系[6]、陸地棉胞質不育系和海島棉胞質不育系，我國雜交棉育種中應用較多的是哈克尼西棉胞質不育系。 由于應用不育系的強優勢組合選配困難， 雖然有品種審定， 如中棉所99[7]，但未在生產上大面積應用。 已報道的棉花核不育系有17 個不同類型， 包括9 個隱性核不育系，分別是ms1、ms2、ms3、ms5ms6、ms8ms9、ms13、ms14、ms15和ms16[8-9]；8 個 顯 性 核 不 育 系，分 別 是Ms4、Ms7、Ms10、Ms11、Ms12、Ms17、Ms18以及Ms19[10]。棉花隱性核不育系在制種應用中要拔除50%的可育株，嚴重影響制種效率，因此在生產上應用較少。

環境敏感型核不育（Environment-sensitive genic male sterile，EGMS）是一種特殊的核不育系類型，參與植物的光形態建成、 開花和晝夜節律調控等[11]。 20 世紀70 年代我國首先發現了光溫敏感型水稻不育材料[12]，開啟了兩系雜交稻的生產應用。 水稻中曾發現多種溫敏核雄性不育材料，如安農S-1、廣占63S 等，已發現的基因主要有tsm1、tsm2、tsm3、tsm4、tsm5、tsm6等[13-14]。光敏雄性不育水稻主要有農墾58S、培矮64S，主要光敏不育基因有pms1、pms2、pms3、pms5等[15]；另外，還發現了反式光敏不育系、反式溫敏不育系等材料[16-17]。 此后，由溫度、光周期調控的雄性不育材料在大麥、玉米、高梁、油菜等作物中被發現。 在玉米中報道了光敏、溫敏不育系[18]；小麥中報道了光敏[19]、溫敏[20]、光溫敏[21]核不育系；大麥中發現光溫敏核雄性不育系[22]；在谷子[23]、高粱[24]、油菜[25]等作物中也發現了光溫敏雄性不育系；茄子有反向熱敏感雄性不育系[26]。 分子研究發現長鏈非編碼RNA （Long non-coding RNAs，lncRNA）、 小RNA 和功能基因參與了環境敏感型育性調控[27]。

棉花環境敏感型核不育系的研究剛起步，還未在生產上大面積應用。 在我國的主要棉區，棉花在花期和花鈴期容易受到極端高溫天氣的影響，引起棉花花粉敗育，不能正常授粉，從而造成蕾鈴脫落[28]。 湖南農業大學培育出棉花溫敏雄性不育系特棉S-1，在日平均溫度高于27 ℃時表現為不育[29]。 還有諸多棉花溫敏不育系已被發現，如TMS-2[30]、48043[31]、洞A[32]，此外還選育了對光溫敏感的雄性不育系如光溫A[33]和湘QB[34]。 中國農業科學院棉花研究所（簡稱：中棉所）喻樹迅院士團隊利用航天誘變育種技術，培育新型的棉花芽黃光敏雄性不育突變體中9106。 馬建輝等[35]研究發現，中9106 在光照時間為13～14.5 h 的長日照條件下花粉敗育，能配制雜交組合，生產雜交種； 在光照時間為11～12.5 h 的短日照，且日平均溫度大于等于21.5 ℃的條件下可育，可在短日照高溫地區自交繁殖。 張朝軍通過棉花組織培養體系利用陸地棉W10 創制了棉花光敏雄性不育突變體psm4[36]，遮光試驗表明其在日照時間大于12.5 h 條件下表現為花藥不開裂、花粉發育正常的雄性不育性狀；小于11.5 h 表現為花藥可以開裂、能正常散粉的雄性可育性狀，是典型的棉花孢子體光敏不育系。以psm4 為母本，W10 為父本，得到具有光敏不育特性，但是有正常的花粉壁、花粉活力正常的光敏不育系psm5。 本研究將結合親本的特性詳細介紹psm5的特性及其育性的轉變規律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與地點

W10 和psm4[31]來源于中棉所轉基因創新小組。psm4是W10 無菌苗下胚軸組織培養獲得的突變體。 利用psm4與W10 雜交，在127 株F2后代中發現12 株生長健壯的雄性不育植株。 將不育株的果枝嫁接到W10 砧木上， 移入安陽工學院人工氣候室， 在光周期為11.5 h（光）/12.5 h（暗）、 晝夜溫度為35 ℃/20 ℃的條件下生長結鈴。 同年將種子在海南三亞中棉所南繁基地擴繁。次年3 月底分單株收獲自交種。一部分種子在河南省安陽縣中棉所試驗農場種植， 與正常棉花同樣種植管理，觀察育性。一部分種子繼續南繁種植，在后代植株中選出結鈴性好、花粉量接近W10的株系，命名為psm5。 在安陽市中棉所試驗田和安陽工學院人工氣候室對psm5進行系統研究。

1.2 育性穩定性試驗

2018―2019 年分別在安陽大田進行psm5、psm4育性穩定性試驗，以W10 為對照，每個處理1 行，行長8 m，行距0.8 m，株距0.25 m，設置3個重復，管理同大田正常管理模式。 7 月20 日至9 月10 日進行自交，10 月5 日調查自交結鈴數。

1.3 花藥散粉觀察、花藥石蠟切片觀察及花粉活力檢測

在大田選取當天盛開的花朵，用鑷子剝去花瓣，暴露出花藥與柱頭，用體式顯微鏡Olympus BX51TF 進行觀察并拍照。

在大田取W10 開花當天待散粉但仍未散粉的花藥，取psm4、psm5開花當天的花藥，用甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液固定24 h，再用體積分數分別為70%、85%、95%、100%的乙醇依次脫水，用二甲苯透明，然后經滲蠟、包埋，最后進行切片（厚度為8 μm），經番紅-固綠染色，中性樹膠封片，制成永久切片。用Olympus BX51 顯微鏡觀察并拍照。

在大田取樣， 分別取W10、psm4及psm5植株開花當天的花藥。 W10 植株的花藥此時已開裂，可以直接用鑷子夾取花藥將花粉抖落到載玻片上，吸取100 μL 亞歷山大染色劑，滴至載玻片上， 然后蓋上蓋玻片。 一般1～2 h 后即可用Olympus BX51 光學顯微鏡觀察并拍照。 由于psm4和psm5植株開花當天的花藥不開裂，需要用雙面刀片將花藥切開，以便花粉散出。 切開后，后續步驟同W10 植株的花藥處理。

1.4 花粉萌發試驗

在大田選取W10 和psm5當天開放的花蕾，利用固體培養基進行花粉萌發試驗，具體參考梁滿中等[37]的方法。

1.5 光溫響應試驗

將psm4、psm5和W10 種植在培養缽中，在中棉所露天生長到開花期，各取5 株移入人工氣候室進行觀察。 2 個人工氣候室光周期分別設為12.5 h（光）/11.5 h（暗）、11.5 h（光）/12.5 h（暗），每30 d 轉換1 次光周期， 光/暗處理溫度分別為35 ℃/20 ℃、25 ℃/15 ℃兩個處理，溫度誤差為±2 ℃。 記錄不同溫度下育性轉變所需時間。

2 結果與分析

2.1 psm5 的育性穩定性

大田取樣觀察發現：W10 花藥正常開裂，有大量花粉散出；psm5和psm4花藥不開裂， 無花粉散出（圖1）。可見，psm5保持了psm4在安陽花藥不開裂的特性。2018―2019 年連續2 年在安陽自交， 均未得到psm5的自交鈴， 說明psm5與psm4一樣具有穩定的雄性不育特性。

2.2 psm5 與psm4 花藥及花粉的區別

在開花當天取花藥做石蠟切片，觀察成熟的花粉狀態及花藥裂口組織狀況。W10 花藥壁箭頭部位可見即將開裂的花藥裂口組織， 而psm5和psm4的裂口組織無開裂的跡象。psm5和W10 的花粉粒上可見正常的刺凸， 花粉發育正常；psm4的花粉粒上無刺凸，畸形花粉較多，其可能是由于花粉粒無包被保護，在固定液浸泡過程中內部細胞質從裸露的萌發孔滲出導致的（圖2A～C）。染色結果表明， 與W10 花粉相比，psm4和psm5的花粉染色略淺，活力稍低，且psm4存在畸形的花粉粒（圖2D～F）。 由此可知，psm5的花藥具有花粉粒包被， 但同樣呈現出與psm4相同的花藥不開裂特性。

2.3 psm5 與W10 的離體花粉萌發活力分析

psm5與W10 的花粉萌發試驗結果表明：psm5的花粉萌發率（34.48%）與W10 的花粉萌發率（45.79%）存在顯著差異；與W10 相比，psm5花粉活力較弱，但仍有一定的活力。

2.4 psm5 與psm4 育性轉變規律

從4 月28 日出苗至7 月上旬開花， 安陽的光照時間為13.5～14.5 h。 將開花期的psm5、psm4植株移入晝夜溫度為35 ℃/20 ℃的人工氣候室， 在12.5 h/11.5 h 光周期條件下培養30 d。W10 的花藥正常開裂散粉，能自交結鈴；psm5和psm4的花藥不開裂，保持雄性不育性狀，自交不結鈴。 光周期轉變為11.5 h/12.5 h 時，W10 的花藥仍正常開裂散粉；10 d 后，psm5和psm4個別單株花朵中少量花藥開裂、 散粉； 到15 d 時，psm4、psm5所有單株均表現為花藥開裂、正常散粉。 到第30 天將光周期重新調回12.5 h/11.5 h，12～16 d 后，2 個不育系植株花藥由開裂狀態重新轉化為不開裂狀態。 30 d 后重新調整回11.5 h/12.5 h，12 d 后psm5、psm4逐漸開裂散粉（表1）。W10 的花藥在轉換期間始終保持正常散粉狀態。psm4和psm5在花粉開裂散粉期間均能自交結鈴。

表1 不同溫度和光周期條件下psm4 與psm5 育性轉變規律Table 1 The fertility transition characiers of psm4 and psm5 under different temperature and photoperiod conditions

將開花期的psm5、psm4植株移入25 ℃/15 ℃條件下的人工氣候室， 在12.5 h/11.5 h 光周期條件下培育30 d，2 個材料花藥均不開裂，保持雄性不育性狀，與在35 ℃/20 ℃條件下的人工氣候室表現相同。當光周期轉變為11.5 h/12.5 h 的第15天，有的單株花藥開始開裂、散粉。 第22 天，所有單株均表現為花藥開裂、正常散粉。 第30 天，將光 周 期 重 新 調 回12.5 h/11.5 h，15 ～23 d 后，psm4、psm5的花藥重新轉化為不開裂、不散粉狀態。 30 d 后重新調整光周期為11.5 h/12.5 h，15 d后psm5、psm4逐漸恢復花藥開裂、 散粉狀態（表1）。W10 的花藥始終正常開裂并散粉。在花粉開裂散粉期間，psm4和psm5仍能自交結鈴。

3 討論

psm4與姊妹系W10 雜交， 獲得了psm5光敏不育系。psm5不育系花粉粒有發育正常的花粉包被， 說明psm4光敏不育性狀與無花粉包被無關。 在不同溫度條件下進行光周期轉換試驗，說明psm5、psm4光敏不育特性不受溫度影響。在低溫下育性轉換時間延長，可能與低溫下蕾發育變慢有關。 在安陽大田連續2 年種植psm4和psm5， 直到霜降后也沒有發現花藥開裂的現象；在三亞大茅溫室中和氣溫達到40 ℃以上的夏季大田，psm5和psm4均保持雄性不育特性。 結合人工氣候室育性轉換試驗， 可以認定psm4和psm5的花藥不開裂性狀不受溫度影響， 僅受光周期誘導，是典型的光敏不育系。 同時，也首次證明了光周期對棉花花藥開裂有調控作用。

由于我國各主要植棉區棉花正常生長階段日照時間均大于12 h，psm5在這些棉區均表現為雄性不育。 本研究中對于2 個光照時間節點（12.5 h 和11.5 h）的選擇，主要基于三亞光周期的限制。 因為10 月份三亞光照時間從12 h 轉變為11.5 h，此時棉花正值苗期；2 月中旬到3 月中旬棉花吐絮期， 光照時間從11.5 h 轉變為12 h。3－10 月份，psm4、psm5在三亞田間均表現為雄性不育。 關于psm4與psm5在11.5～12.5 h 光照條件下的育性及其具體響應周期還應深入研究。加強對這2 種光敏不育材料的分子試驗，探討光周期與花藥開裂之間的調控機制，為光敏雄性不育系的應用奠定堅實的理論基礎。

psm5作為棉花光敏雄性核不育材料， 與之前報道的光敏不育材料中9106 在表型及光敏特性方面均有明顯的不同。 中9106 的雄性不育表型為花藥不開裂，花粉無活力[35]；而psm5花藥不開裂， 其花粉活力與野生型花粉相比較弱，但仍可萌發。 在光敏特性方面，中9106 在長日照條件（13～14.5 h）下花粉敗育；在短日照（11～12.5 h），且日平均溫度大于等于21.5 ℃的條件下可育[35]。而psm5在日照時間大于12.5 h 時不育， 在日照時間小于11.5 h 時可育，且不受溫度影響。 因此，psm5作為兩系法制種材料具有更大的應用潛力。

4 結論

棉花光敏不育系psm4的育性是由花藥不能正常開裂引起的， 與花粉粒外包被發育缺陷無關。psm4棉花花藥不開裂性狀受光周期控制，與溫度無明顯關系。 在低溫下花藥開裂性狀轉變所需時間較長，推斷是低溫下花蕾發育進程變慢所致。從psm4和psm5育性轉變時間推斷其花藥在長日照條件下不開裂的性狀，是在棉蕾發育中后期形成的，與蕾前期發育和花粉發育無關。 本研究證明psm4花粉粒包被缺失與花藥不開裂的光敏不育性狀是2 個獨立遺傳性狀。 利用雜交技術可以將2 個性狀分離，培養花粉粒正常的光敏不育系psm5。psm4和psm5是典型的孢子體光敏不育系材料。psm5的創制對揭示棉花光敏不育機理和育種應用具有重要意義。