靈芝多糖對結直腸癌細胞的調控作用研究

劉偉志，洪 偉，李金龍

0 引言

結直腸癌(CRC)是全球常見癌癥，是癌癥相關死亡的主要原因[1-4]。結直腸癌在我國也是發病率較高的癌種，且發病率和死亡率呈逐年遞增趨勢[5]，因此，通過改善結直腸癌的治療方案來降低結直腸癌患者的死亡率是目前的熱點問題。

靈芝是我國著名的中草藥之一，研究顯示，靈芝具有抗腫瘤作用，在前列腺癌、肺癌和乳腺癌等不同類型的癌癥中均被證實具有治療和改善預后作用[6-11]。靈芝多糖是靈芝的重要活性成分，是從靈芝活性成分中分離純化出的一種高分子化合物，是多糖與蛋白質的復合體[10-11]。臨床研究顯示，靈芝多糖同樣對多種腫瘤細胞起到抑制作用，尤其是在乳腺癌治療中效果明顯[12]。最近有研究指出，靈芝多糖可能具有預防結直腸癌的作用[13-14]，但目前針對靈芝多糖對結直腸癌細胞的具體生物學功能影響的資料較少。

本研究分別經靈芝多糖和常用治療藥物卡培他濱作用于結直腸癌細胞，對比不做任何處理的結直腸癌細胞，檢測靈芝多糖對結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力和細胞凋亡的影響，以此探究靈芝多糖在結直腸癌中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 準備人結直腸癌細胞系T84(貨號：BNCC100495)和DiFi(貨號：BNCC339556)，購自北納生物細胞庫。分別置于Ham′S F12培養基和DMEM培養基的1∶1混合物培養基、含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱的實驗環境中培養，每2 d傳代1次，在本次實驗中均使用培養的第4代細胞。

1.2 制備GLP 使用破碎機將靈芝制成粉末,經水浸泡24 h，然后進行冷碾壓處理，對得到的碾壓液進行層析，進而分離特定區間分子量的靈芝多糖。稱量0.1 g靈芝多糖粉末,用100 ml超純水溶解。于70 ℃下離心(300 r/min) 12 h后，經0.45 μm濾膜在砂芯過濾器中濾去不溶雜質，收集濾液，通過50 kD超濾管在6 400 r/min的轉速下離心30 min。最后收集超濾管內濃縮藥液，使用H051冷凍干燥器(LaboGene，Lynge，Denmark)進行冷凍干燥，獲得用于后續實驗的靈芝多糖。

1.3 MTT實驗 選擇處于對數生長期的T84和DiFi結直腸癌細胞，經胰蛋白酶常規消化后,加入培養基重懸細胞并調整細胞濃度為1×104個/ml，然后在每孔中接種200 μl的細胞懸液，于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24 h，等到細胞貼壁后，根據試驗要求分別設置空白組(即GLP和卡培他濱濃度為0的正常培養基)、GLP組、卡培他濱組3組，設置4個濃度梯度。在不同濃度梯度的GLP和卡培他濱作用24 h后，清除原培養基。加入新鮮培養基200 μl和10 μl MTT試劑，等待細胞貼壁2 h。于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中繼續培養4 h，吸去孔內培養液，每孔加入200 μl DMSO溶液，避光置于搖床10 min進行振蕩混勻，經酶聯免疫檢測儀(Multiskan MK3，Thermo)在490 nm波長下檢測各孔的OD值，實驗重復3次。計算結直腸癌細胞存活率及對細胞增殖能力的影響。增殖抑制率=(1-處理組OD值/空白對照組OD值)×100%，細胞存活率=處理組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.4 劃痕愈合實驗 分為空白對照組、GLP組 (加入濃度為2 mg/ml GLP的培養基) 和卡培他濱組 (加入濃度為0.1 μmol/L卡培他濱的培養基)。器械進行常規滅菌，胰蛋白酶消化細胞后,將細胞濃度調整為4×105個/ml，然后取2 ml T84和DiFi結直腸癌細胞,分別和3組培養基作用24 h后接種于6孔板中，待細胞貼壁6 h后，棄去培養基。用100 μl無菌移液管槍頭筆直刮擦其路徑上的細胞，用PBS洗滌3次清除被刮擦下來的細胞。在0 h、24 h后，在顯微鏡下拍照，記錄細胞劃痕區域變化，并通過Image J計算細胞遷移率，細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。實驗重復3次。

1.5 Transwell實驗 實驗分為空白對照組、GLP組 (加入濃度為5 mg/ml GLP的培養基) 和卡培他濱組 (加入濃度為50 nmol/L卡培他濱的培養基)。在Transwell小室中加入基質膠，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養1 h，待基質膠凝固后吸去殘余的液體，在上室中加入三組培養基培養24 h后的T84和DiFi結直腸癌細胞，胰酶消化后調整細胞密度為2×105個/孔，下室加入正常培養基。取出小室后，用濕潤的棉簽清除小室上室中殘留的細胞，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛固定30 min，經0.1%結晶紫染色細胞約20 min，PBS再洗滌3次。晾干后置于倒置顯微鏡下，每孔隨機選擇5個視野進行拍照并進行細胞計數。實驗重復3次。

1.6 流式細胞術 分為空白對照組、GLP組(加入濃度為5 mg/ml GLP的培養基) 和卡培他濱組(加入濃度為50 nmol/L卡培他濱的培養基)，取處于對數生長期的T84和DiFi結直腸癌細胞，分別在3組培養基中培養24 h后接種于6孔板中，將細胞密度調整為2×105個/孔，等細胞貼壁4 h后去除原培養基，然后經不含EDTA的胰酶消化后，離心后用PBS清洗。根據FITC Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)操作說明，用碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC對細胞進行染色。加入1 ml稀釋為1×的Binding Buffer，隨后沖懸細胞并轉移到流式管里，然后將PI和Annexin V-FITC(5 μl)加入細胞懸浮液(100 μl)中，室溫下于避光條件下孵育15 min。離心5 min后棄上清液，加入5 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入5 μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，并通過Guava EasyCyte流式細胞儀進行分析。

2 結果

2.1 靈芝多糖抑制結直腸癌細胞的增殖能力 MTT實驗結果顯示,不同濃度梯度的靈芝多糖和卡培他濱作用于T84和DiFi細胞時，相較于空白對照組，細胞在OD490nm的吸光值均顯著降低(圖1A)，指示結直腸癌細胞的增殖功能和細胞活力受到抑制，且隨著靈芝多糖和卡培他濱濃度增加，對結直腸癌細胞的增殖抑制率也明顯增加，細胞存活率降低(圖1B-C)。即靈芝多糖和卡培他濱的效果相近，能夠抑制結直腸癌細胞的增殖能力。

2.2 靈芝多糖抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力 劃痕愈合實驗結果顯示，靈芝多糖或卡培他濱作用后，T84和DiFi細胞的遷移速率相比空白對照組顯著降低(圖2A)，提示結直腸癌細胞的遷移能力受到靈芝多糖或卡培他濱抑制；Transwell實驗結果同樣顯示，經靈芝多糖或卡培他濱作用后的T84和DiFi細胞，其侵襲能力和空白對照組相比明顯受到抑制(圖2B)。結果顯示，靈芝多糖能夠抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力。

圖1 靈芝多糖抑制結直腸癌細胞的增殖能力

圖2 靈芝多糖抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力

2.3 靈芝多糖促進結直腸癌細胞的凋亡 流式細胞術檢測細胞凋亡率結果顯示，靈芝多糖或卡培他濱作用后的T84和DiFi細胞，細胞凋亡率顯著高于空白對照組(圖3)。結果顯示，靈芝多糖和卡培他濱的作用相似，能夠促進結直腸癌細胞的凋亡。

圖3 靈芝多糖促進結直腸癌細胞的凋亡

3 討論

結直腸癌是世界上最常見的癌癥和癌癥致死原因之一[15]，目前其主要治療手段包括手術切除和化療，然而由于療效的有限性和器官毒性，這些療法可能受到限制。尋找不良反應小的抑制結直腸癌細胞生長的天然化合物成為目前研究的熱點。

最近研究顯示，靈芝多糖具有抑制結直腸癌細胞活力的作用，可以通過Akt/ERK和MAPK/ERK信號通路誘導結直腸癌細胞的凋亡[16-17]。本研究顯示，結直腸癌細胞T84和DiFi經靈芝多糖作用后，細胞凋亡率明顯高于空白對照組，且與卡培他濱作用后的細胞凋亡率相近。即靈芝多糖可以誘導結直腸癌細胞的凋亡，且效果與卡培他濱差異無統計學意義，具有作為結直腸癌治療中新型抑癌天然化合物的潛力。

此外，本研究結果顯示，靈芝多糖作用后，結直腸癌細胞的增殖能力顯著降低，隨著靈芝多糖濃度的增加，對結直腸癌細胞的增殖抑制率呈上升趨勢，結直腸癌細胞的活力不斷下降，且靈芝多糖作用的總體趨勢和卡培他濱相近；在對結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力影響上，靈芝多糖的抑制效果同樣與卡培他濱相近?？ㄅ嗨麨I用于結直腸癌的治療過程中，毒副作用較大，不良反應率較高[18]，而在靈芝多糖提取和使用方法逐漸成熟的情況下[19]，將靈芝多糖用于結直腸癌的治療中具有一定的可行性。

綜上所述，靈芝多糖對結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力有抑制作用，促進結直腸癌細胞的凋亡，效果與卡培他濱接近，在結直腸癌治療上具有潛力，具有研究前景。