產膽固醇酯酶畢赤酵母發酵條件優化及酶學性質研究

權浩嚴，王 鵬，位正鵬，杜春影，沈照鵬，張京良，喬樂克,,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.青島市市立醫院，山東青島 266011；3.海洋功能食品國家地方聯合工程實驗室，山東榮成 264309；4.青島海洋生物醫藥研究院，山東青島 266071）

膽固醇酯酶（EC 3.1.1.13），又稱甾醇酯酶，是酯酶家族中的一員，可以催化膽固醇類物質合成膽固醇酯類，也可以將膽固醇酯類水解為膽固醇和相應的脂肪酸，具有廣泛應用價值。在食品加工方面，膽固醇酯酶可催化植物甾醇合成為甾醇酯，提高其在油相中的溶解度與穩定性，應用于功能性食品添加劑的產品開發[1]。在醫藥方面，膽固醇酯酶可應用于酶法檢測血液中總膽固醇含量[2]；在造紙方面，膽固醇酯酶主要通過水解廢紙中所含的甾醇酯，提升廢紙利用率[3]。隨著生物工業綠色可持續發展的需要，膽固醇酯酶的市場需求也逐漸增加。

膽固醇酯酶的來源主要分為兩個方面。一方面是從生物組織中獲取，肝臟、胰臟、腎上腺、性腺、乳腺、腦、腦黃體等均有分布[4?6]。另一方面是由細菌、放線菌、真菌等微生物發酵培養獲得[7?10]。不同來源的膽固醇酯酶具有不同的制備特點。從動物內臟中提取，成本高產量低。相比之下，利用微生物發酵方式獲取，能夠有效降低生產成本，提高產量。然而，微生物來源的膽固醇酯酶酶活力較低，韓廷玉等[11]從莓實假單胞菌中得到膽固醇酯酶，經發酵條件優化后酶活力僅為0.48 U/mL，孫柳青等[12]從伯克霍爾德菌中獲得的膽固醇酯酶水解活力也僅為1.04 U/mL，如何有效提高酶活已逐漸成為研究熱點。

本研究以課題組成功異源表達的產膽固醇酯酶的畢赤酵母工程菌株為主要研究對象，通過單因素和正交試驗設計，有效提高菌株產酶活力，建立搖瓶水平的最優產酶工藝，同時探究其酶學性質。為膽固醇酯酶的規模化生產及應用提供了良好的理論技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株來源 獲自課題組成功異源表達的畢赤酵母工程菌株P.pastorisX-33；培養基 固體培養基：酵母浸粉 1.0%、胰蛋白胨 2.0%、葡萄糖 2.0%、瓊脂1.8%；種子培養基：酵母浸粉 1.0%、胰蛋白胨2.0%、葡萄糖 2.0%；發酵培養基：酵母浸粉 1.0%、蛋白胨 2.0%、甘油 1.5%、K2HPO40.3%、KH2PO41.18%、生物素 4×10?5%、YNB 1.34%；酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨 分析純，北京雙旋微生物培養基制品廠；乙酸對硝基苯酯 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對硝基苯酚 分析純，天津市光復精細化工研究所；葡萄糖、甘油、K2HPO4、KH2PO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉等 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

LDZX-30KBS 立式蒸汽壓力滅菌器 上海申安醫療器械廠；ZHJH-C1115B 型超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；pH400 pH 計 安萊立思儀器科技（上海）有限公司；LRH-70F 生化培養箱、HWS12 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；ZWY-2102C 智誠恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；UV-6000PC 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養 從菌種保藏管中挑取一環菌體接入固體培養基中，30 ℃恒溫培養48 h，活化菌株。再從固體培養基上挑取一環活化后的菌體接入種子培養基，30 ℃、200 r/min 搖床培養24 h。以1%接種量接入發酵培養基中，培養96 h，每24 h 加入1%甲醇誘導產酶。

1.2.2 酶活力測定 參照Dong 等的方法[13]，酶活力測定采用對硝基苯酚乙酸酯（p-NPA）法。酯酶能夠水解乙酸對硝基苯酯為對硝基苯酚及乙酸，對硝基苯酚在405 nm 處有特征吸收峰。酶活力單位定義為：在50 ℃ 和pH8.0 條件下，每分鐘水解底物生成1 μmol對硝基苯酚所用的酶量為一個酶活力單位（U）。酶活反應體系為1.03 mL，在1 mL Tris-HCl 緩沖液中加入50 mmol/L 乙酸對硝基苯酯溶液20 μL，10 μL 酶液，50 ℃ 反應10 min，加入1 mL 1% SDS溶液終止反應，405 nm 處測定吸光值，以不加酶的反應體系作為對照。

1.2.3 發酵條件優化

1.2.3.1 碳源篩選優化 在發酵培養基的基礎上，分別添加1%的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，探究不同碳源種類對發酵效果的影響；同步探究不同濃度甘油（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對發酵效果的影響[14]。以初始的發酵培養基作為對照。

1.2.3.2 氮源篩選優化 在發酵培養基的基礎上，分別添加1%的（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3，探究不同無機氮源種類對發酵效果的影響；同步探究不同濃度蛋白胨（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對發酵效果的影響[14]。以初始的發酵培養基作為對照。

1.2.3.3 初始pH 優化 用100 mmol/L 的HCl 和NaOH分別調節發酵培養基的初始pH 至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，探究不同初始pH 對發酵效果的影響[15]。

1.2.4 正交試驗設計優化培養基組分 根據單因素實驗結果，以甘油、蛋白胨、初始pH 為因素，以酶活力和為檢測指標，采用L9（34）正交設計進行培養基組分優化[16]。確定最佳產酶條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 產酶條件優化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiments for enzyme production

1.2.5 丙酮沉淀 取等體積的粗酶液，按1:0.5、1:1、1:2 和1:3 體積比分別加入丙酮，4 ℃靜置，離心取沉淀，用Tris-HCl 緩沖液等體積復溶，測定酶活力，確定最佳丙酮沉淀比例。以原膽固醇酯酶粗酶液的酶活力值為100%作為對照。

1.2.6 酶學性質探究

1.2.6.1 最適反應溫度及溫度穩定性 采用p-NPA 法分別在30、35、40、45、50、55 ℃條件下測定酶活力；在pH8.0 Tris-HCl 緩沖液體系中，分別將酶液于40、45、50、55 ℃條件下靜置1 h 后測定酶活，以原酶液酶活力值100%作為對照[17]。

1.2.6.2 最適反應pH 及pH 穩定性 采用p-NPA法 分 別 在 pH4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0條件下測定酶活；分別將酶液于50 mmol/L pH 為6.0、7.0、8.0、9.0 的Tris-HCl 緩沖液體系中靜置1 h后測定酶活，以原酶液酶活力值100%作為對照[17]。

1.2.6.3 金屬離子的影響 在pH8.0 Tris-HCl 緩沖液體系和50 ℃條件下，分別向酶液中加入K+、Na+、Li+、Ba2+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+金屬離子至終濃度為5 mmol/L，室溫靜置1 h 后測定酶活，以原酶液酶活力值100%作為對照[15]。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次。采用Microsoft Excel 2016 和GraphPad Prism 9 進行數據的圖表處理。使用正交助手軟件進行正交實驗分析。使用SPSS 22.0 進行正交實驗設計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 發酵條件單因素優化

2.1.1 碳源對酶活力的影響 碳源是微生物生長繁殖代謝過程中必要的營養物質和誘導物質，不同的微生物的碳源代謝酶系不同，因此可利用的碳源也互不相同[18]。不同碳源對畢赤酵母發酵的影響如圖1A所示。作為對照的初始發酵培養基，酶活力最高（P<0.01），在其基礎上添加其他碳源，不利于酶活力的積累。圖1B 為不同甘油濃度對菌種發酵產酶的影響，當甘油濃度從0.5%增加到1.0%時，酶活力緩慢上升，進一步增加酶活力顯著下降（P<0.01）。這可能是由于過高的甘油濃度會導致關鍵基因轉錄水平的下降，進而導致酶活力降低[19]。因此，選擇對酶活力較大的甘油含量（1.0%、1.5%、2.0%）作為正交水平進行進一步交互作用的探究。

圖1 碳源對畢赤酵母產膽固醇酯酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on cholesterol esterase produced by Pichia pastoris

2.1.2 氮源對酶活力的影響 氮源是微生物生長和代謝所必需的重要原料，它也是構成微生物核酸和蛋白質等諸多含氮化合物的原料[20]。如圖2A 所示，添加無機氮源實驗組的酶活力與對照組相比提高不顯著（P>0.05）。所以，在發酵過程中，主要以有機氮作為主要氮源。不同蛋白胨濃度對酶活力影響如圖2B所示，當蛋白胨濃度為2%時，酶活力幾乎達到最大值，進一步提高蛋白胨含量，酶活力增加不顯著（P>0.05）。因此，分別選擇1.5%、2.0%、2.5%的蛋白胨濃度作為進行后續交互作用的探究水平。

圖2 氮源對畢赤酵母產膽固醇酯酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on cholesterol esterase produced by Pichia pastoris

2.1.3 初始pH 對酶活力的影響 培養基的初始pH 對菌體的生長、代謝及物質運輸等過程有重要影響[21]。畢赤酵母在不同初始pH 條件下的產酶結果如圖3 所示，當培養基的初始pH 為8.0 時，酶活力幾乎達到峰值。不同的pH 會影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態，改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養物質的吸收和代謝產物的分泌[22]。因此，選擇出現酶活力峰值的pH 值范圍（6.0、7.0、8.0）作為下一步正交因素的探究水平。

圖3 初始pH 對畢赤酵母產膽固醇酯酶的影響Fig.3 Effect of initial pH on cholesterol esterase produced by Pichia pastoris

2.2 正交試驗設計及方差分析

根據單因素優化結果，選擇甘油、蛋白胨和初始pH 三個因素進行L9（34）正交設計，實驗結果見表2。根據極差值可知各因素對畢赤酵母產酶的影響次序為甘油>蛋白胨>初始pH，最優產酶組合為A1B1C2，即甘油1.0%，蛋白胨1.5%，初始pH7.0。由表3 方差分析可知甘油、蛋白胨和初始pH 對畢赤酵母產酶差異均為極顯著（P<0.01）。

表2 產酶條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analyses of orthogonal experiments for enzyme production

表3 正交設計方差分析表Table 3 The variance analysis form of orthogonal design

2.3 最佳優化培養基驗證

為了進一步探究培養基優化的可靠性和穩定性，采用正交實驗中的最佳條件進行驗證，并與優化前發酵結果進行比較，結果見表4。優化后酶活力較于優化前提高3.65 倍。

表4 驗證實驗對比結果Table 4 Comparison results of validation experiments

2.4 膽固醇酯酶的酶學性質

2.4.1 酶液的制備 不同體積倍數丙酮沉淀酶液的酶活力變化曲線如圖4 所示。當丙酮添加倍數為1.0 倍時，沉淀中的酶活力基本達最大值，之后再提高丙酮添加倍數，復溶液的酶活力不再增加。選擇1.0 倍作為丙酮添加最佳倍數。

圖4 丙酮沉淀曲線Fig.4 Acetone precipitation curve

2.4.2 最適反應溫度及溫度穩定性 溫度是影響酶蛋白性質的重要因素之一，溫度過高，會引起酶分子高級結構發生變化，溫度過低，分子運動緩慢，酶解反應速度下降[23]。如圖5A 所示，在30～55 ℃測定酶活，最適溫度為50 ℃。當溫度為30 ℃時，酶活力僅為最高值的68%。

酶溫度穩定性的研究結果如圖5B，在40 ℃和45 ℃時，酶具有較好的穩定性，45 ℃保溫300 min，酶活力仍能保持在89%以上；50 ℃保溫15 min，酶活力基本保持不變，繼續延長時間，酶活力迅速降低，在300 min 時酶活力保持在52%左右；而55 ℃保溫，酶活力顯著降低，保溫300 min 后，酶活力僅保持39%。

圖5 溫度對膽固醇酯酶的影響Fig.5 Effect of temperature on cholesterol esterase

2.4.3 最適反應pH 及pH 穩定性 不同pH 對酶活力的影響結果如圖6A，最適反應pH 為8.0。當pH 為7.0 時，酶活力能保持74%以上；當pH 高于8.0 時，酶活力顯著降低，因為酶蛋白所處環境的酸堿度，影響酶活性中心結合位點和催化位點的解離程度，導致酶催化作用降低[24]。

pH 穩定性的研究結果如圖6B。在pH6.0～9.0 之間，該酶活力整體變化較小。pH 穩定性良好。

圖6 pH 對膽固醇酯酶影響Fig.6 Effect of pH on the stability of cholesterol esterase

2.4.4 金屬離子的影響 金屬離子對酶活力影響結果如表5 所示。K+、Na+、Li+、Ba2+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Ca2+、Mg2+和Al3+對酶活力影響較小；Mn2+和Fe3+對酶活力具有弱促進作用；Zn2+對酶活力有一定的抑制作用。覃擁靈等[25]研究結果顯示，Zn2+對酯酶具有一定抑制作用，可能是由于Zn2+影響了酯酶催化活性中心與底物的結合，從而導致酯酶活性降低。

表5 金屬離子對膽固醇酯酶穩定性的影響Table 5 Effect of metal ions on the stability of cholesterol esterase

3 結論

本研究以課題組成功異源表達的產膽固醇酯酶的畢赤酵母工程菌株為主要研究對象，對其發酵條件進行優化，確定最適培養基組成。優化后酶活力達到11.21 U/mL，較優化前3.65 倍。該酶酶學性質較為穩定，Zn2+對其具有一定的抑制作用。與其他產膽固醇酯酶的菌株相比，該酶酶活力較高，酶學性質優良，穩定性好。下一階段將從膽固醇酯酶的分離純化以及酶制劑的開發方面進行深入探究，以期為其規模化制備和應用奠定技術基礎。