紫色馬鈴薯酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及主發(fā)酵期花青素與色澤的動態(tài)變化

李水玲，趙紅倩，王文秀，馬倩云，劉亞瓊，吳晶晶，孫劍鋒,3,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定 071000；2.張家口弘基農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責任公司，河北張家口 075000；3.河北省馬鈴薯加工技術(shù)創(chuàng)新中心，河北張家口 076550）

我國是馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量的第一大國。馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)原產(chǎn)于南美洲[1]，紫色馬鈴薯是馬鈴薯當中一類特殊的品種，有它特有的經(jīng)濟價值[2]。紫色馬鈴薯中含有普通馬鈴薯中的全部營養(yǎng)物質(zhì)，除此之外還含有水溶性的天然花青素[3]。紫色馬鈴薯中的花青苷為酰基花色苷[4?5]，所以其抗氧化性較為穩(wěn)定[6?7]，具有增強免疫、降血脂、保護視力和延緩衰老等多種保健功能[8?11]。目前紫色馬鈴薯主要以鮮食為主，少數(shù)用于加工，綜合經(jīng)濟效益較低。為了順應馬鈴薯主食戰(zhàn)略，必須大力發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)品深加工產(chǎn)業(yè)，豐富產(chǎn)品品種，從而提高馬鈴薯的經(jīng)濟附加值[12]。

紫色馬鈴薯價格低廉、淀粉含量豐富，具有一定保健功能，是良好的釀酒原料。陳杰華[13]以紫色馬鈴薯為原料，通過淋飯和喂飯相結(jié)合的方法確定了紫色馬鈴薯米酒的制備工藝。張蕊等[14]在紫馬鈴薯水解液中，分別接種不同的商業(yè)酵母XR、VR5、QA23 進行發(fā)酵，比較分析香氣組分構(gòu)成。結(jié)果表明采用QA23 酵母作為菌種釀酒，產(chǎn)生的酯類類型較另兩種商業(yè)酵母多。目前馬鈴薯酒存在酒體味道單一的問題，而面粉價格低廉且蛋白質(zhì)含量豐富，在發(fā)酵過程中添加面粉其蛋白質(zhì)分解成氨基酸進而形成高級醇，從而提高酒的香氣[15?16]。

因此，本實驗以面粉為輔料，添加酒曲進行液態(tài)發(fā)酵，研制出紫色馬鈴薯酒，并研究主發(fā)酵過程中的花青素、色度、色調(diào)、褐變指數(shù)、聚合色度的動態(tài)變化，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供簡便的發(fā)酵工藝及理論指導，豐富紫色馬鈴薯的產(chǎn)品種類，促進大眾健康。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑金剛馬鈴薯 張家口弘基農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責任公司；面粉 金龍魚多用途麥芯粉；高溫α-淀粉酶（酶活力30000 U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；安琪釀酒曲 安琪酵母股份有限公司。

DK-98-11 電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；NDP-9082 恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；15R 高速冷凍離心機 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；752 紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；分析天平（CP214） 上海奧豪斯儀器有限公司；PIBI2 電磁爐 奔騰電器（上海）有限公司；MJ-BL25B2美的攪拌機 廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫色馬鈴薯酒的釀造工藝 工藝流程：紫色馬鈴薯清洗→切塊、蒸熟→加水打漿→添加面粉→添加α-淀粉酶→添加酒曲→發(fā)酵→過濾→滅菌→成品

操作要點：

原料預處理：挑選無霉斑、無芽的紫色馬鈴薯進行清洗。

蒸熟、打漿：新鮮紫色馬鈴薯切片1 cm 厚，常壓蒸至無硬心，出鍋后加水，以料水比1:1 (g/mL)打漿，加入面粉攪拌均勻。

液化：添加8.5 U/gα-淀粉酶，于90 ℃液化50 min。

發(fā)酵：酒曲用5～10 倍的35 ℃溫水活化15 min，加入發(fā)酵液攪拌均勻后倒入500 mL 三角瓶中（約瓶子的三分之二）蓋上帶軟管的膠塞，于28 ℃下發(fā)酵。

過濾、滅菌：經(jīng)14 d 發(fā)酵結(jié)束后，過濾、滅菌制得紫色馬鈴薯酒。

1.2.2 紫色馬鈴薯酒釀造工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗 a.面粉添加量的確定：以酒精度為指標，考察紫色馬鈴薯與面粉的添加量的質(zhì)量比分別為1:0、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6，料液比為1:1.25 (g/mL)，添加α-淀粉酶8 U/g，添加酒曲0.4%，于28 ℃發(fā)酵7 d，對發(fā)酵液酒精度的影響。酒精度的影響。

b.料液比的確定：以酒精度和花青素含量為指標，考察紫色馬鈴薯與面粉的添加量的質(zhì)量比為1:0.6，料液比分別為1:0.75、1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75 (g/mL)，α-淀粉酶添加量8 U/g，酒曲添加量0.4%，于28 ℃發(fā)酵7 d，對發(fā)酵液酒精度和花青素的影響。

c.α-淀粉酶添加量的確定：以酒精度和花青素含量為指標，考察紫色馬鈴薯與面粉的添加量的質(zhì)量比為1:0.6，料液比分別為1:1 (g/mL)，α-淀粉酶添加量分別為4、6、8、10、12 U/g，酒曲添加量0.4%，于28 ℃發(fā)酵7 d，對發(fā)酵液酒精度和花青素的影響。

d.酒曲添加量的確定：以酒精度和花青素含量為指標，考察紫色馬鈴薯與面粉的添加量的質(zhì)量比1:0.6，料液比1:1 (g/mL)，α-淀粉酶添加量8 U/g，酒曲添加量分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，于28 ℃發(fā)酵7 d，對發(fā)酵液酒精度和花青素的影響。

1.2.2.2 響應面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，運用軟件Design-Expert 7.0，分別以料水比（A）、α-淀粉酶添加量（B）、酒曲添加量（C）為響應變量，以花青素含量為響應值（Y），通過三因素三水平的Box-Behnken 響應面設(shè)計方法進行試驗，優(yōu)化出最佳的發(fā)酵工藝。各組試驗的編碼水平與取值見表1。

表1 Box-Behnken 響應面設(shè)計因素水平及編碼Table 1 Box-behnken response surface design factor level and coding

1.2.2.3 紫色馬鈴薯酒感官評定方法 參考張文等[17]和李剛鳳等[18]方法，感官評定分別從色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)4 個方面進行評分，請10 名食品科學與工程專業(yè)學生，對樣品進行綜合感官評分。評分標準見表2。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory scoring criteria

1.3 指標測定方法

1.3.1 酒精度測定 根據(jù)GB 5009.225-2016《酒中乙醇濃度的測定》進行測定。

1.3.2 花青素含量測定 采用pH 示差法[19]測定花青素含量，并略有改動，取1 mL 發(fā)酵酒液分別用pH1.0 緩沖溶液和pH4.5 的緩沖溶液定容至10 mL，置于暗處平衡2 h，以空白樣作對照，用分光光度計測定兩種溶液520 nm 和700 nm 波長處的吸光度（A），按以下公式計算得出花青素含量（C）。

式中A=（A520?A700）pH1.0-（A520?A700）pH4.5，MW-矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；DF-稀釋因子；ε-矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900；L-比色皿光程，1 cm。

1.3.3 色度、色調(diào)測定 發(fā)酵液經(jīng)4500 r/min 離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，用去離子水調(diào)零，分別于420 、520 nm 及620 nm 波長處測定吸光度A，用去離子水做空白對照[20]。

1.3.4 聚合色度、褐變指數(shù)測定 取2 mL 經(jīng)離心、0.45 μm 膜過濾后的酒樣，加10 mg NaHSO3，靜置1 min，以去離子水為參比，測定其在420 nm 和520 nm波長下的吸光度[21]，褐變指數(shù)和聚合色度按以下公式計算[22]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert V 8.0.6 設(shè)計響應面進行優(yōu)化與分析試驗，SPSS 17.0 用于數(shù)據(jù)方差分析，Origin 2018 作圖，每組試驗重復測量3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 面粉添加量的確定 表3 為面粉添加量對紫色馬鈴薯酒發(fā)酵的影響。由表3 可知，隨著面粉添加量的增加，酒精度呈上升趨勢，面粉中淀粉含量多，α-淀粉酶水解淀粉轉(zhuǎn)化成酵母菌生長和繁殖需要的還原糖及總糖，酒精度逐漸增大。一般來說，酒精度在10% vol 以上時，微生物難以滋生，有利于酒的儲存，但面粉添加過多時會掩蓋紫色馬鈴薯酒的特征風味。雖然在紫色馬鈴薯與面粉比為1:0.5 時酒精度也超過10% vol，但出于更易儲存的角度，最終選擇紫色馬鈴薯與面粉1:0.6 的比例，進行下一步的試驗。

表3 面粉添加量對紫色馬鈴薯酒發(fā)酵的影響Table 3 Effect of flour addition on the fermentation of purple potato wine

2.1.2 料水比對酒精度和花青素的影響 圖1 為料水比對酒精度和花青素的影響。由圖1 可知，料水比在1:1 (g/mL)時酒精度達到最大值13.3%vol，1:1～1:1.75 (g/mL)時酒精度逐漸下降，可知當料水比為1:1 (g/mL)時能使α-淀粉酶充分發(fā)揮作用，將淀粉進行酶解。酒精度低時，不利于花青素的溶出[23]。料水比為1:1～1:1.75(g/mL)時，隨著料水比的增大花青素的含量逐漸下降。綜合考慮選取料水比1:0.75、1:1、1:1.25 (g/mL)，進行下一步的響應面試驗。

圖1 料水比對紫色馬鈴薯酒發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of material-water ratio on purple potato wine fermentation

2.1.3α-淀粉酶添加量對酒精度和花青素的影響圖2 為α-淀粉酶添加量對酒精度和花青素的影響。由圖2 可知，添加α-淀粉酶可以使紫色馬鈴薯發(fā)酵液黏度下降[24]，利于花青素的溶出，提高花青素含量[25]。α-淀粉酶添加量為4～8 U/g 時，隨著α-淀粉酶添加量的增多酒精度及花青素的含量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，8 U/g 后酒精度及花色苷的含量趨于平緩。因此，選取淀粉酶添加量為6 、8 、10 U/g，進行下一步的響應面試驗。

圖2 α-淀粉酶添加量對酒精度和花青素的影響Fig.2 Effect of alpha-amylase on alcohol content and anthocyanins

2.1.4 酒曲添加量對酒精度和花青素的影響 圖3為酒曲添加量對酒精度和花青素的影響。由圖3 可知，酒曲添加量在0.2%～0.4%時，酒精度和花青素含量均呈上升的趨勢。酒曲中有曲霉和酵母，酒曲添加量增大會使發(fā)酵液中酵母含量增多，可促使發(fā)酵液中葡萄糖轉(zhuǎn)換為酒精[26]。隨著發(fā)酵的進行葡萄糖含量逐漸減少，在酒曲添加量為0.4%后酒精度趨于平緩，而花青素含量0.5%開始下降。所以為了盡可能提高花青素的含量。選取酒曲添加量為0.4%、0.5%、0.6%，進行下一步的響應面試驗。

圖3 酒曲添加量對酒精度和花青素的影響Fig.3 Effect of koji addition on alcohol content and anthocyanin

2.2 響應面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 模型的建立及方差分析 表4 為Box-Behnken設(shè)計試驗方案及結(jié)果。如表4 方差分析結(jié)果可知，該模型P=0.0002（P<0.01），說明該二次模型方程極顯著。回歸方程失擬項P=0.5049 不顯著，表明該方程對試驗擬合程度較好，因此可以用回歸方程對紫色馬鈴薯酒發(fā)酵后的花青素進行預測和分析。回歸方程中的α-淀粉酶添加量（B）、酒曲添加量（C）以及二次項A2、B2、C2和交互項α-淀粉酶添加量與酒曲添加量（BC）均達到極顯著水平（P<0.01），料液比（A）達到顯著水平[26]。各因素對紫色馬鈴薯酒花青素的影響的大小順序為：α-淀粉酶的添加量>料水比>酒曲添加量。

表4 Box-Behnken 設(shè)計試驗方案及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 交互作用分析 根據(jù)回歸方程繪制關(guān)于紫色馬鈴薯酒花青素含量的三維響應面圖。圖4 為交互項對于紫色馬鈴薯酒花青素顯著的響應面圖。由圖4的三維響應曲面圖可看出3 個因素變量及其交互作用對紫色馬鈴薯酒花青素含量的影響，響應曲面越陡峭，說明兩者交互作用越顯著。從表5 中可以看出，交互項AB 和AC 的交互作用不顯著，交互項BC 的交互作用極顯著。

圖4 交互項對于紫色馬鈴薯酒花青素顯著的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of interaction terms to anthocyanins in purple potato

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance in regression models

2.2.3 響應面最優(yōu)條件及其驗證 經(jīng)單因素試驗與模型方程預測相結(jié)合得到最佳發(fā)酵參數(shù)料液比為1:1.05、淀粉酶添加量8.47 U/g、酒曲添加量0.45%，為了方便實際生產(chǎn)選取料液比1:1 (g/mL)、淀粉酶添加量8.5 U/g、酒曲添加量0.45%，經(jīng)驗證發(fā)酵所得花青素含量為179.22 mg/L，與預測值184.75 mg/L相近，且在此條件下紫色馬鈴薯酒的酒精度為13.5%vol、綜合感官評定得分90 分，說明該模型可靠，可用于預測花青素與發(fā)酵條件的關(guān)系。

2.3 主發(fā)酵期花青素含量與色澤的動態(tài)變化

2.3.1 主發(fā)酵期花青素含量的變化 圖5 為主發(fā)酵過程中花青素含量的變化。由圖5 可知，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵液中花青素的含量呈先增加后降低的趨勢。在發(fā)酵的0～5 d，酒精度逐漸增大，隨著酒精度增加，提高了花青素的浸出率[27]，所以酒體中花青素含量也隨之增加，在第5 d 達到最大值。隨后，花青素的含量隨發(fā)酵時間的增加逐漸降低。由于花青素分子結(jié)構(gòu)的特殊性，會受發(fā)酵體系中pH、殘?zhí)橇俊⒕凭鹊纫恍┮蛩氐挠绊懀ㄇ嗨氐男螒B(tài)發(fā)生一系列變化甚至降解，所以隨著發(fā)酵的進行，花青素含量在達到最大值后開始下降。

圖5 主發(fā)酵過程中花青素含量的變化Fig.5 The changes of anthocyanin content during main fermentation

2.3.2 主發(fā)酵期色度、色調(diào)變化 色度表示發(fā)酵液中的顏色，酒顏色越深色度值越大。色度的變化與酒樣中花青素、單寧等酚類物質(zhì)的變化有關(guān)[28]。圖6為主發(fā)酵過程色度、色調(diào)的變化。如圖6 所示，色度呈先下降后趨于平緩的趨勢，在紫色馬鈴薯酒的發(fā)酵過程中，發(fā)酵液逐漸從濃稠到稀薄，即發(fā)酵液密度逐漸減少，花青素可溶于的溶液變大。當花青素溶出率小于發(fā)酵液密度變小的速率時，色度呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖6 主發(fā)酵過程中色度的變化Fig.6 The change of chroma during main fermentation

色調(diào)表示發(fā)酵液中黃色與紅色的比例，即發(fā)酵液中黃色比例增加色調(diào)值增大，如圖7 所示，發(fā)酵液的色調(diào)呈快速上升后趨于平緩的趨勢。可能是因為花青素在發(fā)酵過程中聚合反應生成沉淀，使紅色比例降低黃色比例升高，呈現(xiàn)出相對穩(wěn)定的顏色，并逐漸向磚紅色轉(zhuǎn)變。

圖7 主發(fā)酵過程中色調(diào)的變化Fig.7 The change of Hue during main fermentation

2.3.3 主發(fā)酵期褐變指數(shù)、聚合色度變化 在發(fā)酵過程中花青素等酚類物質(zhì)的聚集，引起褐變指數(shù)與聚合色度的增大。褐變指數(shù)越低，褐變程度小，顏色好[29]。如圖8、圖9 所示在主發(fā)酵期間褐變指數(shù)與聚合色度均呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，且趨勢大致相同，與李甜等[30]的研究結(jié)果一致，由于前期發(fā)酵劇烈發(fā)酵液溶氧量增多，造成褐變指數(shù)和聚合色度增長迅速，后期發(fā)酵穩(wěn)定，褐變指數(shù)和聚合色度平穩(wěn)增長。

圖8 主發(fā)酵過程中聚合色度的變化Fig.8 The change of polymerization chroma during main fermentation

圖9 主發(fā)酵過程中褐變指數(shù)的變化Fig.9 The change of browning index during main fermentation

3 結(jié)論

采用響應面法優(yōu)化了紫色馬鈴薯酒的發(fā)酵工藝參數(shù)，最終確定的工藝參數(shù)為：紫色馬鈴薯與面粉比為1:0.6、料水比1:1 (g/mL)、α-淀粉酶添加量為8.5 U/g、酒曲添加量為0.45%。此工藝在28 ℃發(fā)酵14 d。得到的紫色馬鈴薯酒酒精度13.5%vol，花青素含量166.34 mg/mL，綜合感官評定得分90 分。為該品種的開發(fā)應用奠定了理論基礎(chǔ)。分析了主發(fā)酵過程中花青素和色澤的變化，在發(fā)酵過程中花青素的不穩(wěn)定，會隨著發(fā)酵的進行先升高后降低，由此會造成紫色馬鈴薯酒的色澤變淺，飽和度下降、發(fā)生氧化褐變等。因此，需要進一步控制在發(fā)酵過程中花青素含量的損失。

今后，可通過改變酒的發(fā)酵條件或添加花青素保護劑的方法，來調(diào)控花青素的降解和氧化褐變程度。從而提高紫色馬鈴薯酒中花青素的含量，使成品酒色澤達到理想的色澤，為紫色馬鈴薯為工業(yè)化生產(chǎn)紫色馬鈴薯酒提供理論基礎(chǔ)。