球霰石碳酸鈣制備工藝優化及幾丁質酶對碳酸鈣的影響

呂鳳嬌，郭 悅，徐 露，施 雯，魏雨洪，孫麗丹，謝曉蘭

（泉州師范學院化工與材料學院，福建泉州 362000）

碳酸鈣是動物貝殼、甲殼、蛋殼、牙齒以及骨頭等生物體硬組織的主要成分，在生物體內由蛋白質、多糖等生物大分子調控下礦化形成[1?4]。碳酸鈣主要有方解石、文石、球霰石等3 種晶型，不同晶型具有不同形狀、性質和功能[5?6]。方解石和文石是單晶體，具有熱力學穩定、結構密實的特性，在自然界廣泛存在；球霰石是多晶體，一般是由納米級球形顆粒聚集而成的結構松軟的多孔微球，具有密度小、比表面積大、溶解性和分散性好、良好生物安全性及可吸收利用性，被廣泛用于食品和醫藥等行業領域[7?9]。如利用球霰石微球具有促進骨基質形成的特性[10]，在增加骨密度的保健食品中，碳酸鈣成為使用率最高的補鈣配方主成分[11]，同時也被用于人工骨和人造牙齒的制備[12]；利用其孔隙率高的特性，用作藥物、生物標記物、生物傳感器等生物醫藥載體[13?15]。

然而球霰石熱力學不穩定，易轉化成文石或方解石，自然界中存量稀缺，故如何合成穩定的球霰石碳酸鈣越來越受關注[7,9]。目前球霰石碳酸鈣的合成方法主要采用碳化法和復分解法，碳化法是直接往Ca2+溶液中通入CO2反應生成碳酸鈣，產品純度較高，但容易受CO2溶解速率影響導致球霰石產率較低；復分解法是利用可溶性鈣鹽和碳酸鹽混合反應制備碳酸鈣，反應快產率高，但容易引入雜質；且非仿生體系下，兩種方法合成的產品穩定性均較差，易轉化成文石與方解石導致產品純度不高[7,9]。為了提高球霰石穩定性，近年來在碳化法和復分解法合成體系里添加糖、蛋白質等有機分子做為晶型調控劑。仿生合成穩定球霰石的研究報道不少[16?24]，但研究內容基本側重于添加劑對晶型的調控，而關于添加劑對球霰石產率和純度的影響鮮少研究。

幾丁質酶是一種糖苷鍵水解酶，廣泛分布在動物、植物以及微生物等各種生物體內，具有消化幾丁質食物、調控形態發育、抗菌防御等功能，在食品、醫療、環保等方面具有廣泛應用[25?26]。蝦蟹、昆蟲等甲殼動物的幾丁質酶主要分布在胃腸等內臟和殼膜等組織部位，與圍食膜蛻換和周期性蛻殼生長發育密切相關[27?31]。韓曉梅等[2]報道蝦蟹殼約含15%～25%的甲殼素和50%礦物質等化合物，其中礦物質主要是碳酸鈣，蝦蟹殼中碳酸鈣生物合成應該與殼膜幾丁質酶的調控具有密切關系，但有關幾丁質酶對碳酸鈣仿生合成調控的研究未見報道。本文優化了鈣離子碳化合成碳酸鈣的工藝條件，并在優化工藝條件下考察了幾丁質酶對鈣離子碳化合成碳酸鈣的調控，通過掃描電鏡（SEM）、紅外光譜（IR）等表征分析了產品組成與形貌特征，研究內容對高產率高純度的球霰石仿生合成和食藥級碳酸鈣的制備具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

幾丁質酶 實驗室自制，以凡納濱對蝦內臟為材料，經pH 7.5 Tris-HCl 緩沖液抽提、硫酸銨分級沉淀、透析、Sephadex G-100 和DEAE-32 柱層析制備得電泳純制劑[26]，比活力為14.15 U/mg，備用；99.95% CO2氣體 泉州市豐澤區東流焊接材料經營部；無水氯化鈣（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、鈣羧酸指示劑（分析純） 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；氨水（分析純） 西隴科學股份有限公司；其它試劑 均為國藥集團化學試劑分析純產品；實驗用水 為去離子水。

DGG-9123A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；JY3002電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；AR124CN 分析天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；FE28 pH 計 梅特勒-托利多儀器有限公司；NICOLET iS 10 紅外光譜儀 Thermo Fisher SCIENTIFIC；ZEISS MERLIN Compact 掃描電鏡 德國Zeiss 公司；STA 409 PC 熱重分析儀 NETZSCH。

1.2 實驗方法

1.2.1 碳酸鈣碳化制備工藝 用氨水調節CaCl2溶液至合適pH，再加入適量幾丁質酶（按不同酶鈣質量比或不加），混勻后，在一定溫度下通入CO2，使鈣離子碳化析出晶體，抽濾、洗滌后烘干得碳酸鈣產品。

式中：cs，EDTA 標準溶液濃度，mol/L；V2，滴定消耗的EDTA 標準溶液體積，mL；V1，樣液體積，mL。

碳化前后溶液體積變化忽略不計，鈣離子碳化率計算公式如下：

1.2.3 碳化工藝的單因素實驗 對幾丁質酶添加量（按不同酶鈣質量比添加）、溫度、CaCl2濃度、pH、碳化時間等5 個因素進行單因素實驗，平行實驗3 次，分別考察各因素對鈣離子碳化率的影響，確定較優工藝條件。

1.2.3.1 幾丁質酶對鈣離子碳化率的影響 按0:1、0.001:1、0.002:1、0.004:1、0.01:1 的酶鈣質量比，分別往30 mL pH 12.0 的1.00 mol/L 的CaCl2溶液中加入不同量的幾丁質酶，攪拌混勻后，20 ℃下，按1 L/min 氣流速度通入CO2碳化5 min 后，過濾收集樣品，測定分析計算碳化率，考察幾丁質酶添加對鈣離子碳化率的影響。

1.2.3.2 溫度對鈣離子碳化率的影響 分別在0、10、20、30、40、50、60 ℃等不同溫度下，按1 L/min氣流速度，往30 mL pH12.0 的1.00 mol/L 的CaCl2溶液，通入CO2碳化 5 min 后，過濾收集濾液和CaCO3產物，分析濾液殘余鈣離子濃度，計算碳化率，考察溫度對鈣離子碳化率影響，確定較佳碳化溫度。

1.2.3.3 CaCl2濃度對鈣離子碳化率的影響 20 ℃下，按1 L/min 氣流速度，分別往30 mL pH12.0 的0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mol/L 等不同濃度的CaCl2溶液，通入CO2碳化5 min 后，過濾收集樣品，測定分析計算碳化率，考察CaCl2濃度對鈣離子碳化率影響，確定較佳CaCl2濃度。

1.2.3.4 pH 對鈣離子碳化率的影響 20 ℃下，按1 L/min氣流速度，分別往30 mL 用氨水調節至pH 10.5、11.0、11.5、12.0、12.5 等不同pH 的1.00 mol/L 的CaCl2溶液，通入CO2碳化5 min 后，過濾收集樣品，測定分析計算碳化率，考察pH 對鈣離子碳化率影響，確定較佳pH。

1.2.3.5 碳化時間對鈣離子碳化率的影響 20 ℃下，按1 L/min 氣流速度，往30 mL pH 12.0 的1.00 mol/L的CaCl2溶液，分別通入CO2碳化1、2、3、5、7、9 min 后，過濾收集樣品，測定分析計算碳化率，考察碳化時間對鈣離子碳化率影響，確定較佳碳化時間。

1.2.4 正交試驗優化碳化工藝條件 為進一步優化碳化工藝條件，根據單因素實驗結果，選取A 碳化溫度（℃）、B 碳化時間（min）、CpH、DCaCl2濃度（mol/L）等4 個因素作為試驗因素，以鈣離子碳化率為指標，按L9（34）正交表制定正交方案并實驗，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 幾丁質酶對碳酸鈣晶型調控的研究 在優化的碳化工藝條件下，分別按0:1、0.002:1、0.004:1、0.01:1 酶鈣質量比往30 mL 的碳化體系中加入幾丁質酶，充分攪拌混勻后，以1 L/min 氣體流速持續通入CO2碳化，碳化結束后過濾收集濾液和CaCO3產物，分析濾液殘余鈣離子濃度，計算碳化率，洗滌收集CaCO3固體，并置于105 ℃下干燥至恒重，稱重并取樣分析產品幾丁質酶含量及表征產品形貌特征，與同等條件下不加幾丁質酶碳化制備的CaCO3形貌比較，考察幾丁質酶對碳酸鈣晶型的調控。

1.2.6 碳酸鈣產品表征

1.2.6.1 掃描電鏡形貌分析 用直接分散法處理樣品：先把裁剪好的尺寸適中的導電膠粘在銅片上，接著將烘干的待測樣品借外物直接散落附著于導電膠。進樣，觀察各樣品在放大1000～20000 倍下的形貌，晶型及粒徑大小。

1.2.6.2 紅外光譜定性分析 按50:1～100:1 的質量比取適量KBr 粉末和少量碳酸鈣樣品于瑪瑙研缽中，研磨后壓片，以KBr 空白片劑為參照，掃描4000～400 cm?1之間的紅外光譜，表征分析產物組成。

1.3 數據處理

所有工藝優化實驗均做3 個平行，用Excel 2007、SPSS 18.0、Grapher 8.0 等軟件進行數據處理與分析，實驗結果以平均值±標準差表示，單因素方差分析（ANOVA）按P<0.05 分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 幾丁質酶對鈣離子碳化率的影響 蛋白質類調控劑的側鏈一般都含有—COOH 等可解離基團，會與鈣離子產生靜電與配位作用，影響碳化反應。由圖 1 可見，按不同酶鈣質量比分別往相同的碳化體系中加入不同量幾丁質酶后，鈣離子碳化率基本在98.31%～98.54%間波動，對實驗數據進行單因素方差分析，P=0.775>0.05，說明幾丁質酶添加對鈣離子的碳化率不具有顯著性影響。

圖1 幾丁質酶添加量對鈣離子碳化率的影響Fig.1 Effect of chitinase addition on the rate of carbonation of calcium ion

2.1.2 溫度對鈣離子碳化率的影響 溫度會影響化學反應速度和化學反應平衡，溫度升高可以提升體系中離子運動速率促進離子之間碰撞結合的機會，有利碳化反應；但溫度升高也會降低CO2的溶解度，導致體系中CO32-離子濃度下降，不利鈣離子的碳化反應。由圖2 可見，在固定碳化體系下，溫度低于30 ℃時，鈣離子碳化率隨著溫度升高而輕微上升；溫度高于30 ℃時，鈣離子碳化率隨溫度升高而出現下降趨勢；整體變化趨勢顯示，低溫體系下的鈣離子溶液碳化率優于高溫體系；說明隨著溫度升高，CO2的溶解度對碳化率影響漸趨主導，在30 ℃下，具有較好的碳化效果，鈣離子碳化率達97.89%；單因素方差分析P=0.00657<0.05，說明溫度對鈣離子碳化率具有顯著性影響。

圖2 溫度對鈣離子碳化率的影響Fig.2 Effect of temperature on the rate of carbonation of calcium ion

2.1.3 CaCl2濃度對鈣離子碳化率的影響 固定碳化時間、CO2通入流速時，體系CaCl2初始濃度直接影響到CO32?/Ca2+的比例，從而影響鈣離子的轉化率。圖3 顯示，隨CaCl2濃度上升，鈣離子碳化率呈現先增大后趨于平穩的趨勢。當鈣離子濃度小于1.0 mol/L 時，體 系 局 部CO32?/Ca2+的 比 例 較 高，CO32?過飽和，碳化結束時可能導致碳化成的碳酸鈣少量轉化成碳酸氫鈣，從而導致鈣離子碳化率較低；但隨著CaCl2濃度上升，體系CO32?/Ca2+比例下降，CO32?過飽和度下降并逐漸趨于穩定，體系鈣離子基本都碳化成碳酸鈣并穩定存在，故鈣離子碳化率隨鈣離子濃度增大而上升，并趨于穩定；當鈣離子濃度為1.00 mol/L 時，就具有較佳的碳化效果，碳化率為98.37%。單因素方差分析P=4.56×10?10<0.05，說明CaCl2濃度對鈣離子碳化率的影響具有顯著性。

圖3 CaCl2 濃度對鈣離子碳化率的影響Fig.3 Effect of CaCl2 concentration on the rate of carbonation of calcium ion

2.1.4 pH 對鈣離子碳化率的影響 碳化體系的pH 直接影響二氧化碳的溶解度以及碳酸的解離趨勢（碳酸二級解離常數，pKa2=10.2），進而影響著體系鈣離子的碳化反應效果。實驗采用氨水調節碳化體系pH，考察pH 對鈣離子碳化率的影響，由圖4 可知，鈣離子碳化率隨著體系pH 增大呈現先增大后趨于平穩的趨勢；pH<12.0，體系鈣離子碳化率隨著pH 增大快速增大；pH>12.0，鈣離子的碳化率隨pH 增大變化不明顯；當pH=12.0 時，鈣離子碳化率為98.14%。單因素方差分析P=1.25×10?17<0.05，說明pH 對鈣離子碳化率的影響具有顯著性?？紤]強酸強堿設備成本，確定碳化體系較佳pH 為12。

圖4 pH 對鈣離子碳化率的影響Fig.4 Effect of pH on the rate of carbonation of calcium ion

2.1.5 碳化時間對鈣離子碳化率的影響 固定碳化體系下，碳化時間直接影響著鈣離子與通入的二氧化碳的碳化反應程度。圖5 顯示，隨碳化時間延長，鈣離子碳化率呈現先增大后趨于平穩的趨勢。當碳化時間小于3 min 時，碳化率隨碳化時間延長而快速上升，說明在這個時間范圍內，鈣離子不能達到完全的碳化效果；當碳化時間為3、5、7、9 min，體系鈣離子碳化率分別達97.60%、98.57%、99.11%、99.22%；即碳化時間大于3 min 后，鈣離子的碳化率上升緩慢，基本趨于穩定，說明碳化3 min 后體系大部分鈣離子已基本完成碳化反應；單因素方差分析P=1.45×10?21<0.05，說明碳化時間對鈣離子碳化率具顯著性影響。考慮碳化程度，確定較佳碳化時長為5 min。

圖5 碳化時間對鈣離子碳化率的影響Fig.5 Effect of reaction time on the rate of carbonation of calcium ion

2.2 正交試驗優化碳化工藝條件

2.2.1 正交試驗與結果分析 由于添加少量幾丁質酶不影響碳化率，故確定A 碳化溫度（℃）、B 碳化時長（min）、C pH、D CaCl2濃度（mol/L）等四因素進行正交試驗，根據單因素優化結果，分別在A 碳化溫度（℃）、B 碳化時長）min）、C pH、D CaCl2濃度（mol/L）等4 個因素的較佳值周邊選擇三個水平，按L9（34）正交表設計組合出9 個實驗方案，以鈣離子碳化率為指標，進一步優化碳化工藝條件。具體的實驗方案及實驗結果極差分析見表2，實驗結果的SPSS 方差顯著性分析見表3。

表2 鈣離子碳化制備碳酸鈣的正交實驗方案及實驗結果Table 2 The schemes and results of orthogonal experiments for the preparation of calcium carbonate by calcium ion carbonization

表3 正交試驗結果方差統計分析Table 3 Statistical analysis of variance of orthogonal test results

由表2 實驗結果可知，按A1B3C3D3組合的工藝條件，即在體系pH12.5，碳化溫度25 ℃下，對30 mL 1.1 mol/L CaCl2溶液碳化時間6 min，可取得最佳碳化效果，碳化率達99.82%。但對實驗結果進行極差分析，結果顯示最佳碳化工藝條件組合應該為A3B3C3D2，即體系pH 為12.5、碳化溫度為35 ℃、CaCl2濃度為1 mol/L、碳化時間為6 min；通過比較R 值可知，四個因素對鈣離子碳化率的影響主次順序為：B>C>D>A，即碳化時間>pH>CaCl2濃度>碳化溫度。表3 的SPSS 統計分析結果顯示，四個因素對鈣離子碳化率影響均具有顯著性，影響主次順序同極差分析結果基本一致。

2.2.2 鈣離子碳化最佳工藝條件驗證 由于正交實驗結果顯示最佳反應條件為A1B3C3D3組合，而正交實驗結果極差分析得出的最佳反應條件為A3B3C3D2組合，結果不一致。故在A3B3C3D2組合條件下進行驗證實驗，平行實驗三次，得鈣離子碳化率達99.88%±0.02%，比A1B3C3D3組合條件下的碳化率99.82%稍高一點，故確定鈣離子最佳碳化工藝條件為體系pH 為12.5、碳化溫度為35 ℃、CaCl2濃度為1 mol/L、碳化時間為6 min。

2.3 幾丁質酶對碳酸鈣晶型的調控

在優化的碳化工藝條件下，分別按0:1、0.002:1、0.004:1、0.01:1 的酶鈣質量比，往35 ℃、pH 12.5、30 mL 的1 mol/L CaCl2溶液中加入幾丁質酶，攪拌混勻后，持續通入二氧化碳碳化6 min，碳化結束分析計算鈣離子碳化率，不同體系下的碳化率在99.85%～99.92%范圍內波動，結果進一步顯示幾丁質酶的添加確實不影響鈣離子的碳化率。產品經洗滌、烘干至恒重后，取適量產品酸溶后，根據蛋白質的紫外特征吸收性質，測定樣品液在280 nm 的吸光度值判斷產品是否夾雜幾丁質酶，結果顯示不同酶鈣質量比的碳化體系制備的產品均無夾雜幾丁質酶。在此基礎上，取樣進行掃描電鏡、紅外光譜等性能表征測試，進一步了解幾丁質酶對碳酸鈣晶型的調控及產品組成情況。

2.3.1 掃描電鏡分析 采用掃描電鏡（SEM）測定不同量幾丁質酶調控下碳化而成的碳酸鈣的形貌和粒徑。圖6 中的a、b、c、d 分別是未加酶、按0.002:1、0.004:1、0.01:1 的酶鈣質量比添加幾丁質酶調控碳化形成的碳酸鈣的SEM 圖像。

由圖6a 可見，未添加幾丁質酶調控碳化制備的碳酸鈣是由約110 nm 的球狀顆粒和少部分尺寸近1 μm的菱形塊狀自組裝形成的直徑為2 ～ 8 μm 左右的大小不一的微球。圖6b 顯示，按0.002:1 的酶鈣比添加幾丁質酶制備得到的碳酸鈣微球尺寸變小，且菱形塊狀形貌消失，碳酸鈣基本由80 nm 的納米級球狀顆粒團聚而成的粒徑約為2 ～ 4 μm 的大小較均勻的微球。進一步增大幾丁質酶加入量，由圖6c、6d 可知，碳酸鈣基本顆粒和微球粒徑隨著酶添加量增大而減小，納米球基本顆粒的團聚由緊密趨向蓬松；按0.004:1 的酶鈣比添加酶調控，可得到70 nm 的納米顆粒團聚組成的粒徑約為1.5 μm 的大小均勻的微球；當比例增到0.01:1，得到60 nm 的納米顆粒團聚組成的粒徑小于1 μm 的蓬松微球。SEM 表征結果說明幾丁質酶的添加不僅能改變碳酸鈣基本顆粒的晶型與尺寸，還會影響碳酸鈣顆粒團聚的緊密度與團聚微球粒徑，這對食品、保健等輕工業新型鈣制劑的制備與應用具有重要意義。幾丁質酶對碳酸鈣晶型的調控效應與高平章等[17]用胰蛋白酶調控碳酸鈣晶型的效果類似，肯定了蛋白質類物質對碳酸鈣的仿生制備過程具有實際的調控作用。

圖6 不同量幾丁質酶調控制備的碳酸鈣的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscope of calcium carbonate prepared under the control of different amounts of chitinase

2.3.2 紅外光譜分析 方解石型碳酸鈣的紅外光譜特征吸收峰為876 cm?1和712 cm?1[4,32]。圖7 是未加幾丁質酶調控CaCl2碳化形成的碳酸鈣紅外光譜圖，由圖可見，在3436、1421、875 cm?1和714 cm?1處出現特征吸收峰，與竹文坤等[22]以CaCl2和碳酸鈉為原料在純水體系下復合合成的方解石型碳酸鈣的紅外譜圖基本一致，均具有876 cm?1和712 cm?1的紅外特征峰，說明未加幾丁質酶調控碳化形成的碳酸鈣為方解石型。圖中3436 cm?1是H-O 鍵的伸縮振動吸收峰，表明碳酸鈣含有水分；而1421 cm?1是方解石型碳酸鈣中的C-O 鍵的伸縮振動特征吸收峰；875 cm?1和714 cm?1是方解石型碳酸鈣中C-O鍵的彎曲振動特征吸收峰。目前大部分實驗制備的方解石基本是密實菱形，但電鏡圖顯示未加幾丁質酶碳化制備的碳酸鈣為球形；實驗結果與徐煥煥等[32]采用復分解法，用豆腐廢水調控制備出球形方解石碳酸鈣的形貌相似，表明特定條件下制備的方解石碳酸鈣并不完全是菱形。

圖7 未加幾丁質酶的碳酸鈣紅外譜圖Fig.7 Infrared spectrum of calcium carbonate without chitinase

球霰石型碳酸鈣的紅外光譜特征吸收峰為876 cm?1和745 cm?1[4]。圖8 是按0.01:1 酶鈣質量比加入幾丁質酶調控CaCl2碳化形成的碳酸鈣紅外光譜圖，由圖可知，在1456～1409 cm?1之間出現了較寬的分裂吸收峰，1089、874 cm?1和745 cm?1處也出現特征吸收峰，特征峰與馬曉明等[23]在胃蛋白酶調控下水醇體系中用CaCl2和碳酸氫銨仿生合成的球霰石碳酸鈣的紅外特征吸收峰基本一致，也與王芬等[33]利用CO2碳化制備的球霰石型碳酸鈣的紅外特征峰基本吻合。圖中1456～1409 cm?1之間的分裂吸收峰是球霰石型碳酸鈣中C-O 鍵反對稱伸縮振動吸收峰；1089、874 cm?1和745 cm?1分別是球霰石型碳酸鈣中C-O 鍵的對稱伸縮振動、面外彎曲振動和面內彎曲振動吸收峰。結果說明幾丁質酶存在影響了Ca2+碳化形成的碳酸鈣的晶型，可調控碳化形成的球霰石型碳酸鈣，紅外譜圖表征結果與SEM 觀測結果相一致。

圖8 加幾丁質酶的碳酸鈣紅外譜圖Fig.8 Infrared spectrum of calcium carbonate with chitinase

幾丁質酶對碳酸鈣晶型的調控機理應該與大部分蛋白質與氨基酸的調控機理類似，借助分子中的—COOH 實現，該基團在中性或堿性條件下解離成—COO-，與Ca2+發生靜電和配位作用，提高體系局部Ca2+濃度，為碳酸鈣結晶提供成核位點，降低成核活化能，調控球霰石型晶體形成[5,17]。目前報道的水體系中蛋白質調控制備的碳酸鈣晶型基本以球霰石為主，且晶體中會夾雜有水分和蛋白質[17,22?23]，但由圖8 可見，幾丁質酶調控制備的碳酸鈣不僅未出現水分子H-O 鍵的伸縮振動峰，也沒有出現蛋白質酰胺鍵的特征峰，說明幾丁質酶雖調控碳酸鈣晶型，但在晶體生長過程中確實沒有夾雜入幾丁質酶。

產品未夾雜幾丁質酶可能是所用的幾丁質酶雖含有較多天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸，等電點為5.2[26]，在碳化體系下幾丁質酶側鏈酸性基團基本解離成負離子，加入少量即可與鈣離子相互作用起到良好的晶型調控效果，但由于加入量少又可使結合在幾丁質酶上的鈣離子重新被置換碳化，從而防止碳化過程中的夾雜；故按0.01:1 酶鈣質量比加入少量幾丁質酶調控碳化，既可制出較純的干燥的球霰石型碳酸鈣。

3 結論

以CaCl2為原料碳化合成碳酸鈣，以鈣離子碳化率為指標，單因素考察了碳化溫度、CaCl2濃度、pH、碳化時間和幾丁質酶添加等五個因素對鈣離子碳化率的影響，結果顯示碳化溫度、CaCl2濃度、pH、碳化時間等4 個因素對鈣離子碳化率有顯著性影響，但幾丁質酶添加基本不影響鈣離子的碳化率。采用正交試驗對4 個顯著影響因素進行優化，確定了最佳碳化工藝條件為：35 ℃下，以1 L/min 氣體流速往pH 12.5 的1.00 mol/L CaCl2溶液持續通入CO2碳化6 min，鈣離子碳化成碳酸鈣可獲最佳效果，碳化率達99.88%。極差分析與SPSS 統計分析均顯示四個因素對碳化率的影響主次順序為：碳化時間>pH>CaCl2濃度>碳化溫度，四個因素對鈣離子碳化率影響均具有顯著性。

在優化工藝條件下，分別按0:1、0.002:1、0.004:1、0.01:1 的酶鈣質量比往體系中加入不同量幾丁質酶后，碳化制備碳酸鈣，考察幾丁質酶對碳酸鈣晶型的調控。蛋白成分測定分析顯示，碳化過程未夾入幾丁質酶；SEM 和IR 等表征結果顯示，未加幾丁質酶時，碳化得到的是由球狀顆粒和少部分菱形塊狀組裝形成的直徑為2 ～ 8 μm 的大小不一的方解石型碳酸鈣微球；加入幾丁質酶后，菱形塊狀形貌消失，且隨著幾丁質酶的添加比例增大，碳酸鈣微球尺寸逐漸下降；當酶鈣質量比為0.01:1 時，可制備得直徑小于1 μm 的大小較均一的高純度蓬松球霰石型碳酸鈣微球。說明幾丁質酶調控下可以改變碳酸鈣的晶型與尺寸，是高產率高純度碳化法制備球霰石型碳酸鈣仿生合成的良好調控劑。