復凝聚法制備西番蓮果皮花色苷微膠囊及其性質分析

孫 雪，張 蕊，范方宇，郭 磊，張雪春

（西南林業大學生命科學學院，云南昆明 650224）

西番蓮是一種營養豐富的熱帶水果，其在加工中產生的大量果皮造成了一定的環境污染。西番蓮果皮富含花色苷，花色苷具有抗氧化、抗腫瘤，預防糖尿病和心血管疾病等功效[1]，是一種優秀的天然可食用色素。以西番蓮果皮為原料利用其花色苷，不僅可開發優秀的天然色素，還可解決廢棄物的綜合利用難題。

目前對西番蓮果皮花色苷的研究以提取、分離純化及對其穩定性的研究為主。如陳旭丹等[2]研究了西番蓮果皮色素穩定性，揭示了西番蓮果皮花色苷的穩定性較差。微膠囊技術可保護芯材，防止其被外界環境破壞，控制芯材釋放[3]，微膠囊技術可為西番蓮果皮花色苷的穩定性提供保障[4]。微膠囊的制備方法有原位聚合法、噴霧干燥法、復凝聚法、界面聚合法等[5]。其中復凝聚法是用兩種或多種水溶性高分子材料的溶液，在適當的條件下，電荷中和，材料在溶液中凝聚，并將芯材包埋形成微膠囊。復凝聚法制備微膠囊工藝簡單、條件溫和、成本低高產率等[6]，在花色苷制備微膠囊技術中大量使用[7]。復凝聚法制備西番蓮果皮花色苷微膠囊，可保障花色苷的穩定性，且為花色苷產品的多樣化提供技術支撐。

基于此，以西番蓮果皮花色苷為芯材，明膠和阿拉伯膠為壁材，采用復凝聚法制備西番蓮果皮花色苷微膠囊，并分析了微膠囊的粒徑、水分含量、形態及熱穩定性等性質，以期為西番蓮花色苷的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西番蓮 云南省景洪市；乙醇（純度≥99.7%）分析純，廣東光華科技股份有限公司；明膠 化學純，國藥集團化學試劑有限公司；阿拉伯膠 生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；鹽酸 分析純，成都金山化學試劑有限公司；冰乙酸（純度≥99.5%） 分析純，廣東光華科技股份有限公司；100 U/g 的谷氨酰胺轉氨酶（TG 酶） 泰興市東圣食品科技有限公司。

HH-S4 磁力攪拌水浴鍋 常州朗越儀器制造有限公司；JRA-650 超聲波細胞破碎儀 無錫杰瑞安儀器設備有限公司；FJ200-SH 數顯高速分散均質機上海滬析實業有限公司；B-290 噴霧干燥機 瑞士Buchi 公司；760CRT 紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Hydro 2000Mu 激光粒度儀 英國Malvern 儀器有限公司；SK2009 光學顯微鏡 深圳賽克數碼科技開發公司；SPX-150B 恒溫恒濕培養箱天津泰斯特儀器有限公司；SC-4800 掃描電鏡 日本日立；DSC204F1 差示量熱掃描儀 德國耐馳儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西番蓮果皮花色苷的制備 參考楊宗玲[8]的方法制備西番蓮果皮花色苷。選取新鮮、色澤一致的西番蓮果皮。50 ℃干燥12 h，干燥果皮粉碎，過60 目篩，取篩下樣品，4 ℃密封保存。取干燥西番蓮果皮粉，以液料比10 mL/g，加入86%酸性乙醇(0.054%鹽酸+0.100%檸檬酸)，以提取溫度50 ℃、超聲時間37 min、超聲功率190 W 提取花色苷，提取液5000 r/min 離心10 min。取上層清液，濃縮，將濃縮液（即粗提物）于?18 ℃避光保存備用。

1.2.2 花色苷微膠囊制備 參考紀秀鳳[9]的研究方法，略有修改。分別配制一定濃度的明膠和阿拉伯膠溶液，按比例將明膠溶液與西番蓮果皮花色苷混勻，10000 r/min 高速分散1 min，40 ℃水浴，加入一定比例阿拉伯膠溶液，混勻；10%冰乙酸調節反應pH，在一定反應溫度下，200 r/min 攪拌30 min；將溶液迅速冷卻至15 °C，加入一定量TG 酶固化3 h 即得復凝聚微膠囊。取反應后底部微膠囊溶液進行噴霧干燥，得西番蓮果皮花色苷微膠囊樣品。噴霧干燥條件：進風溫度180 °C，出風溫度90 ℃，進料流速9 mL/min。

1.2.3 花色苷含量測定 微膠囊中總花色苷測定[10]：取0.50 g 微膠囊樣品溶于15.0 mL 蒸餾水，振蕩溶解；濾液分別用pH 1.00 鹽酸-檸檬酸緩沖液和pH 4.50 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋4 倍[11]；置于暗處平衡30 min，510 nm 和700 nm 測吸光值，利用公式（1）計算微膠囊中總花色苷含量。

微膠囊表面花色苷含量測定[12]：取0.50 g 微膠囊樣品，用15.0 mL 振蕩洗滌、過濾；濾液分別用pH1.00 的鹽酸-檸檬酸緩沖液和pH4.50 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋4 倍；置于暗處平衡30 min，510 nm和700 nm 測定吸光值，利用公式（1）計算微膠囊表面花色苷含量。

采用pH 示差法[13?14]測定花色苷含量，以式（1）計算：

式中：ΔA-吸光度值之差，（A510–A700）pH1.00–（A510–A700）pH4.50；V-稀釋最終體積，L；DF-稀釋倍數，4；M-矢車菊素-3-葡萄糖苷相對分子質量，449.2；ε-矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數，26900；m-樣品質量，g。

1.2.4 單因素實驗 以包埋率為指標，固定條件為：芯壁比1:4、壁材質量比（明膠:阿拉伯膠質量比）1:1、壁材濃度1.5%、復凝聚pH 3.50、反應溫度40 °C、反應時間30 min、TG 酶25 U/g 明膠。分別研究芯壁比1:2、1:3、1:4、1:5、1:6，壁材質量比2:1、3:2、1:1、2:3、1:2，壁材濃度0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，pH 2.50、3.00、3.50、4.00、4.50，反應溫度20、30、40、50、60 ℃，反應時間15、30、45、60、75 min，TG 酶添加量15、20、25、30、35 U/g 明膠對西番蓮果皮花色苷微膠囊包埋率的影響。

1.2.5 Box-behnken 響應面優化試驗 根據單因素實驗結果，選擇對微膠囊包埋率影響顯著的芯壁比、壁材質量比和復凝聚pH 為自變量，以包埋率為響應值，設計三因素三水平的響應面分析實驗，優化工藝參數。因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken 實驗設計Table 1 Experiment design of Box-Behnken

1.2.6 性質的測定

1.2.6.1 包埋率 參考唐璐等[15]的方法，測定微膠囊包埋率，以式（2）計算：

1.2.6.2 粒徑測定 將花色苷微膠囊在乙醇介質中分散均勻，采用激光粒度儀測定樣品粒徑。

1.2.6.3 水分含量 參考GB5009.3-2016《食品中水分的測定》直接干燥法測含水量。

1.2.6.4 形貌分析 將樣品粘結在含導電膠的觀測臺，噴金，采用掃描電鏡（SEM）在放大倍數3000 倍條件下觀察微膠囊形態。加速電壓設定10 kV。

1.2.6.5 熱穩定性 利用差示掃描量熱儀（DSC）分析微膠囊的熱穩定性。取5～10 mg 微膠囊樣品于鋁制坩堝中，空坩堝為空白對照，掃描溫度25～200 ℃，升溫速度10 ℃/min，氮氣流速20 mL/min[16]。

1.3 數據分析

實驗數據均進行3 次平行。利用軟件Design-Expert.V8.0.6.1 進行設計，軟件IBM SPSS Statistics 20 對數據進行顯著性分析，軟件Origin 2017 對實驗數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 芯壁比對微膠囊包埋率影響 圖1 可見，隨壁材增加，微膠囊包埋率呈先上升后下降趨勢。芯壁比為1:5 時，微膠囊包埋率達到最大，為96.00%，芯壁比為1:6 時微膠囊包埋率顯著（P<0.05）下降。原因為壁材用量較低時，溶液中壁材含量較少，復凝聚反應時形成的凝聚物較少[17]，芯材未被完全包裹，造成芯材泄露附著在微膠囊表面，包埋率下降；當壁材過多時，微膠囊芯材相對較少，形成部分空囊，造成壁材浪費[18]。為確定適宜的芯壁比，選擇1:4、1:5、1:6為響應面三水平。

圖1 芯壁比對微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effects of core/wall ratio on embedding efficiency of microcapsules

2.1.2 壁材質量比對微膠囊包埋率影響 圖2 可見，隨著阿拉伯膠用量增加，微膠囊包埋率呈先上升后下降的趨勢。明膠:阿拉伯膠=1:1 時，包埋率上升至最高，為94.25%；當壁材比小于1:1 時，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）下降，在明膠與阿拉伯膠質量比為1:2 時，包埋率下降到75.54%，下降了19.85%。明膠含量逐漸增加時，溶液中正電荷增多，正電荷與負電荷結合形成的復合物增加，當明膠:阿拉伯膠為1:1 時，溶液中凈電荷含量最低，故包埋率最大，明膠含量逐漸減少，體系正電荷減少，包埋率降低[19]。為確定適宜的壁材質量比，選擇3:2、1:1、2:3 為響應面三水平。

圖2 壁材質量比對微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effect of gelatin/gum Arabi ratio on embedding efficiency of microcapsules

2.1.3 壁材濃度對微膠囊包埋率的影響 圖3 可見，壁材濃度0.5%～1.5%時，隨壁材濃度的增加，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）增加，壁材濃度在1.5%時，出現峰值，包埋率為94.18%。因為壁材濃度過低，未能形成足夠包裹芯材的微膠囊，存在空白復聚物，因此包埋率低。當壁材濃度大于1.5%時，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）下降。因為壁材濃度過大，囊壁變厚，離子濃度增加，壁材自身形成大塊凝膠，使包埋率下降[20]。故壁材濃度1.5%為宜。

圖3 壁材濃度對微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effects of the wall material concentration on embedding efficiency of microcapsules

2.1.4 pH 對微膠囊包埋率的影響 圖4 可見，當pH為3.50 時，包埋率最大，為94.23%。pH<3.5 時，與pH為3.5 相比，微膠囊包埋率差異不顯著（P>0.05）。因為阿拉伯膠分子結構上帶有的-COOH 使其水溶液呈弱酸性，在水溶液中帶負電[21]。明膠屬于兩性天然高分子材料，適當降低pH，可以使明膠分子電離正離子，加入與其電荷相反的阿拉伯膠，使明膠溶解度下降，形成微膠囊[20]。pH>3.50 時，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）下降，因為明膠所帶凈電荷較少，難以與阿拉伯膠反應，微膠囊難以形成[22]，包埋率降低。為確定適宜的復凝聚pH，選擇3.00、3.50、4.00 為響應面三水平。

圖4 pH 對微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effects of pH value on the embedding efficiency of microcapsules

2.1.5 反應溫度對微膠囊包埋率的影響 圖5 可見，在20～40 ℃時，隨著反應溫度的升高，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）上升。當反應溫度在40 ℃時，包埋率最大，為94.18%。原因為較低溫度使壁材分子運動減弱[23]，不能形成完整微囊，芯材流出，包埋率下降。當溫度大于40 ℃時，包埋率顯著（P<0.05）下降，原因為溫度過高，壁材穩定性下降，更易溶于溶液中，使壁材更易被破壞[24]，造成包埋率下降。故反應溫度選擇40 ℃為宜。

圖5 反應溫度對微膠囊包埋率的影響Fig.5 Effects of temperature on the embedding efficiency of microcapsules

2.1.6 反應時間對微膠囊包埋率的影響 圖6 可見，在15～30 min 時，隨著反應時間的延長，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）上升，在30 min 時包埋率最大為94.23%，當時間超過30 min 時，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）下降，在反應溫度在75 min 時，包埋率下降為79.87%，下降了14.36%。原因為適當延長反應時間有利于微膠囊形成，但時間過長，已形成微膠囊黏連聚集，導致囊壁有破裂[25]，包埋率下降。故反應時間選擇30 min 為宜。

圖6 反應時間對微膠囊包埋率的影響Fig.6 Effects of time on the embedding efficiency of microcapsules

2.1.7 TG 酶添加量對微膠囊包埋率的影響 圖7可見，TG 酶添加量在15～25 U/g 明膠時，隨著TG 酶添加量增大，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）上升，當TG 酶添加25 U/g 明膠時，包埋率最高為94.19%。因為酶與蛋白質的作用位點充分結合，發生共價交聯，微膠囊結構穩定[26]，包埋率達到最高；TG 酶添加量大于25 U/g 明膠時，微膠囊包埋率顯著（P<0.05）下降，因為TG 酶添加量持續增加，酶添加量過高，使蛋白質交聯過度，微膠囊粘連[27]，包埋率降低。故TG 酶添加量選擇25 U/g 明膠為宜。

圖7 TG 酶添加量對微膠囊包埋率的影響Fig.7 Effects of transglutaminase dosage on the embedding efficiency of microcapsules

2.2 響應面試驗設計結果分析

2.2.1 模型建立與顯著性分析 西番蓮果皮花色苷微膠囊包埋率的響應分析實驗根據Box-behnken 設計得到17 組實驗，設計方案及結果見表2。利用軟件Design-Expert.V8.0.6.1 進行回歸擬合，得出以包埋率為響應值的回歸方程（3）：

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

式中，A 為芯壁比，B 為壁材比，C 為復凝聚pH。

對模型進行方差分析，結果見表3。由表3 可以看出，實驗選用模型具有高度的顯著性（P<0.0001），失擬項=0.1817>0.05，失擬項不顯著，表明回歸方程對實驗擬合較好，無失擬因素存在，各因素之間存在較強的交互作用；決定系數R2=0.9858，實驗誤差非常小，表明該模型擬合程度好，可對復凝聚法制備西番蓮果皮花色苷微膠囊工藝過程的分析及預測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

該模型可以看出A、B、C、A2、B2、C2對西番蓮果皮花色苷微膠囊包埋率影響極顯著（P<0.01），BC影響顯著（P<0.05），AB、AC 不顯著。

2.2.2 響應面交互作用分析 通過Design-Expert.V8.0.6.1 軟件分析，各因素對西番蓮果皮花色苷微膠囊包埋率影響的大小可通過響應面3D 圖曲面圖陡峭程度判斷，曲面越陡峭，影響越大，反之則越小。由圖8（a）響應面最為平滑，說明A、B 交互作用最小；圖8（b）響應面較平滑，說明A、C 交互作用較弱；圖8（c）響應面較陡峭，說明B、C 之間的交互作用最大。響應面結果與表3 中方差分析結果相吻合。根據表3 的分析結果，各交互因素對西番蓮果皮花色苷微膠囊包埋率影響程度排序為：BC>AC>AB。

圖8 各因素交互作用的響應面圖Fig.8 Response surface plots for the interaction of various factors

2.2.3 驗證試驗 在壁材濃度1.5%、反應溫度40 °C、反應時間30 min、 TG 酶25 U/g 明膠時，響應面實驗結果表明，復凝聚法制備西番蓮果皮花色苷微膠囊優化工藝參數為：芯壁比1:4.7，壁材質量比6:7，復凝聚pH 3.31，微膠囊預測包埋率為97.43%。

驗證實驗中，pH 取3.30 作為較佳的工藝參數。三次驗證實驗的微膠囊包埋率為96.83%±0.21%，與預測值相比，包埋率減小0.6%，結果基本一致，表明采用響應面法優化工藝獲得的參數可靠，具有一定的實用價值。

2.3 西番蓮果皮花色苷微膠囊的性質

2.3.1 微膠囊的基本性質 研究中西番蓮果皮花色苷微膠囊的包埋率為96.83%±0.21%。微膠囊平均粒徑為12.15±0.85 μm。Mahdavi 等[28]研究指出，微膠囊產品的水分對微膠囊的流動性、黏性及貯存期都有較大影響，本實驗測得微膠囊水分含量僅為2.69%±0.35%，低于食品應用中粉末最低要求（4.00%）[29]。低水分能有效防止產品結塊，使其具有良好的儲藏穩定性。

2.3.2 表面形態分析 圖9 可見，西番蓮果皮花色苷微膠囊呈球形和橢圓球形，表面存在凹陷，褶皺較多，因為噴霧干燥過程中，水分快速蒸發，壁材不均勻收縮[30]。從圖9 中分散的微膠囊可以看出，表面無裂痕、孔洞，結構完整，表明壁材對西番蓮果皮花色苷具有良好的保護作用。

圖9 微膠囊SEM 照片Fig.9 The SEM pictures of microcapsules

2.3.3 熱穩定性分析 溫度對微膠囊的穩定性有重要的影響。有研究表明西番蓮果皮花色苷適宜在50 ℃以下保存[8]。圖10 可見，微膠囊熔融溫度為82.51 ℃，高于普通儲藏溫度（25 ℃），也高于西番蓮果皮花色苷的適宜儲藏溫度（50 ℃）。研究表明微膠囊技術可以保護芯材，確保花色苷貯藏過程中的熱穩定性，對西番蓮果皮花色苷起到更好的保護作用。

圖10 微膠囊DSC 曲線Fig.10 DSC curves of microcapsules

3 結論

本文通過Box-Behnken 響應面法優化西番蓮果皮花色苷微膠囊的制備工藝，以包埋率為指標，建立的工藝為：芯壁比1:4.7，壁材質量比6:7，壁材濃度1.5%，復凝聚pH3.30，反應溫度40 ℃，反應時間30 min，TG 酶25 U/g 明膠，此條件下，微膠囊的包埋率為96.83%。其粒徑為12.15 μm、水分含量為2.69%，掃描電鏡分析顯示該微膠囊的表面光滑且呈球形結構、其熔融溫度為82.51 ℃，常溫下利于保存。