響應面法優化水熱酸控提取紫蘇梗中木犀草素工藝

唐付杰，王星敏,,*，何孟陽，李 鑫，張家樂，李秋東，龔興鑫，陳泓岐

（1.重慶工商大學環境與資源學院, 重慶 400067；2.重慶市特色農產品加工儲運工程技術研究中心, 重慶 400067）

木犀草素（Luteolin）是一種天然黃酮類化合物，多以糖苷形式存在于紫蘇（梗）、花生、金銀花、菊花等植物中，具有較強的抗氧化、抗炎、抗菌等功效，被廣泛應用于食品、醫藥等行業[1]。紫蘇梗（Perillastem）為紫蘇的干燥莖，富含木質纖維素和高附加值的天然活性成分，如迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草素等[2?4]，且紫蘇梗資源除少量入藥外，大多數被丟棄或焚燒[5]，造成高價值天然活性成分喪失。目前國內外提取木犀草素多以花生殼、金銀花為原料，從紫蘇梗中提取報道尚少。

現有木犀草素提取技術主要有水提法、有機溶劑法、離子液體輔助微波法等。陳方園等[6]將1 g 花生殼粉末溶解在體積分數81.6%甲醇溶液中經80 ℃水浴鍋恒溫2.3 h，可提取木犀草素30.64 μg/g，提取率低、有機溶劑用量大；丁佳等[7]采用［C10mim］Br 離子液體溶液作提取溶劑， 微波輔助提取花生殼中木犀草素，提取量達80.11%，但提取成本高；現有提取技術或多或少存在著提取率低、有機溶劑用量大與生產成本高等不足。水熱酸控法運用在植物提取技術領域，具有高效、環境友好、簡便等優點[8]，一方面，營造的高溫（壓）浸提環境不僅加劇木質纖維素分子間或分子內部基團振動[9]，降低纖維素結晶度[10]，還可促使溶劑水處于亞臨界狀態易電離產生氫和氫氧根離子[11]，從而增強植物纖維組織水解能效，打破組織致密三維網狀結構，減少木犀草素等天然活性物質溶出的傳質阻力，如李杰等[12]利用水熱法提取黃芩中黃酮類物質發現，在適宜條件下黃酮總得率為161 mg/g，比水煎煮法提高了18.63%；另一方面，酸性溶劑提取，既加大纖維素中糖苷鍵水解，又維持溶出的天然活性物質穩定[13]，如逯紅林等[14]采用酸水解提取工藝，水解黃酮糖苷成相應的苷元，100 mg天山茶藨莖粉末經5%鹽酸甲醇溶液在70 ℃酸水解100 min 可提取木犀草素達1.25 mg/g。如何應用水熱酸控法提取優勢，提高紫蘇梗中木犀草素等活性成分溶出效率，對實現紫蘇梗資源高值轉化尤顯重要。

基于此，本文提出水熱酸控法浸提紫蘇梗中天然活性物質，選取木犀草素提取量為評價指標，考察水熱時間、水熱溫度、料液比、檸檬酸質量濃度等因素對木犀草素提取量的影響，通過響應曲面法優化獲得木犀草素適宜提取參數，分析提取影響因素間交互作用，采用FTIR 及SEM 表征分析水熱酸控前后的紫蘇梗粉末物相結構，以期為提升紫蘇梗資源利用度提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇梗粉末 紫蘇梗采自重慶市忠縣德劼中藥材種植園，室溫陰干后，粉碎并過80 目篩，保存備用；木犀草素（批號 B20888） 純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）、磷酸（分析純）、甲醇（色譜純）、溴化鉀（色譜純） 重慶川東化工集團有限公司。

EL104 電子天平（0.0001 g） 塞多利斯科學儀器有限公司；TDZ5-WS 高速離心機 上海君竺儀器制造有限公司；CJF-0.05 小型高壓反應釜 北京鞏義予華儀器有限公司；循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；1260 高效液相色譜儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；臺式電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；Nexus 670 傅里葉變換紅外光譜儀 美國 Nicolet 公司；SU1510 掃描電鏡日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水熱酸控提取紫蘇梗中木犀草素 稱取紫蘇梗粉末2.0 g 于水熱反應釜中，以體積分數為50%的乙醇水溶液為提取溶劑。將原料按照一定料液比、檸檬酸質量濃度加入反應釜中，在一定溫度下的烘箱中水熱反應一段時間，取出冷卻至室溫，得紫蘇梗提取液，將紫蘇梗提取液轉入錐形瓶中，在超聲波功率250 W、溫度60 ℃下超聲30 min 后真空抽濾，濾液于4000 r/min 離心15 min，取上清液，待測。

1.2.2 單因素實驗 按照 1.2.1 中木犀草素提取方法，固定料液比1:10 g/mL、水熱溫度210 ℃、檸檬酸濃度0.50%，考察水熱時間（60、80、100、120、140 min）對木犀草素提取量的影響；固定水熱時間100 min、料液比1:10 g/mL、檸檬酸濃度0.50%，考察水熱溫度（170、190、210、230、250 ℃）對木犀草素提取量的影響 ；固定水熱溫度為230 ℃、水熱時間100 min、檸檬酸濃度0.50%，考察料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對木犀草素提取量的影響；固定水熱溫度為230 ℃、水熱時間100 min、料液比1:20 g/mL，考察檸檬酸質量濃度（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%）對木犀草素提取量的影響。在考察單因素變化時，固定乙醇體積分數50%、超聲波功率250 W、超聲溫度60 ℃、超聲時間30 min、離心轉速4000 r/min、離心時間15 min 等條件不變。

1.2.3 響應曲面試驗設計 在單因素實驗基礎上，采用CCD 模塊設計，選取水熱時間（A）、水熱溫度（B）、料液比（C）、檸檬酸質量濃度（D）為自變量，以木犀草素提取量（Y）為響應值，設計4 因素5 水平的響應面分析試驗，響應曲面因素水平見表1。

表1 響應曲面因素水平Table 1 Response surface factor level

1.2.4 木犀草素含量測定 色譜條件[15]：色譜柱為Agilent 5 TC–C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） ；流動相為甲醇（A）、0.1%磷酸（B）；梯度洗脫：0～5 min，

35%～45% A；5～10 min，45%～50% A；10～15 min，50%～52% A；15～20 min，52%～60% A。流速1 mL/min；檢測波長330 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。以進樣濃度對峰面積作圖，繪制木犀草素標準曲線回歸方程為Y=43.98X?7.80，R2=0.9999，在2.24～53.76 μg/mL 內線性關系良好。木犀草素提取量計算公式如下：

式中：Y 為木犀草素提取量，μg/g；c 為木犀草素質量濃度，μg/mL；v 為提取液體積，mL；m，紫蘇梗質量，g。

1.2.5 物相表征

1.2.5.1 FTIR 分析 采用衰減全反射模式測定水熱酸控法浸提前后紫蘇梗粉末的傅里葉變換紅外光譜，采用KBr 壓片，測定波數為4000～500 cm?1。

1.2.5.2 SEM 分析 采用掃描電子顯微鏡分析水熱酸控法浸提前后紫蘇梗粉末的表面形貌結構，其電鏡工作電壓為15 kV、放大700 倍。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3 次，結果取平均值并計算標準誤差，使用 Origin 9.0 軟件繪制趨勢曲線圖。響應面優化試驗采用Design-Expert v8.0.6 軟件進行二次回歸擬合及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 水熱時間對木犀草素浸提影響 由圖1 可知，在60～140 min 范圍內，木犀草素提取量隨著水熱時間增加呈先上升后下降，在100 min 時達最大值為310.0 μg/g，是水浴鍋恒溫浸提2.3 h（提取量為30.64 μg/g）的10 倍[6]。原因在于，相對于水浴恒溫條件，水熱反應釜的高溫（壓）促使溶劑水處于亞臨界狀態，產生的H+促進木質纖維組織裂解完全[11]，被包裹的木犀草素充分溶出；隨著水熱時間延長，水的介電常數、表面張力和極性都逐漸降低[16]，與紫蘇梗基質孔隙充分接觸，加大水分子與木犀草素間傳質速率，木犀草素提取量增加；但水熱至100 min 后，木犀草素變得不穩定，易被分解或氧化成其他物質[17]，使木犀草素提取量降低，故選取100 min 為適宜水熱時間。

圖1 水熱時間對木犀草素提取量影響Fig.1 Effect of hydrothermal time on the extraction amount of luteolin

2.1.2 水熱溫度對木犀草素浸提影響 由圖2 可知，在170～250 ℃范圍內，木犀草素提取量隨水熱溫度升高一直呈增加趨勢，這一趨勢與Min 等[18]報道相一致。原因在于，在升溫過程中，反應體系熱能增加，水分子和木犀草素分子間運動速率加快，氫鍵強度降低，加劇了相互碰撞結合；繼續升高溫度，水的粘度會不斷下降，滲透性增強[19]，從而導致木犀草素等黃酮醇類物質的快速溶解、擴散，增加木犀草素提取量，但溫度為250 ℃時由于溫度太高會影響木犀草素穩定性和生物活性[18]，增加生產能耗，故選取230 ℃為適宜水熱溫度。

圖2 水熱溫度對木犀草素提取量影響Fig.2 Effect of hydrothermal temperature on the extraction amount of luteolin

2.1.3 料液比對紫蘇梗木犀草素浸提影響 由圖3可知，在1:10～1:30 g/mL 范圍內，木犀草素提取量隨料液比增加呈先增加后減少，在料液比1:20 g/mL時達最大值為687.08 μg/g。原因在于，乙醇和水均含有–OH，可與含有四個酚羥基的木犀草素相互溶解；料液比過低時，體系溶液粘稠度高，存在飽和現象，木犀草素無法完全溶解；隨著溶劑用量增加，會適度擴大紫蘇梗表面與溶劑間濃度差，有助于木犀草素的充分擴散和溶出，但料液比超過1:20 g/mL 時，繼續升高料液比，體系固體物含量減少，木犀草素溶出速率達動態平衡，導致其他活性成分與木犀草素產生相互溶出的競爭關系，木犀草素提取量反而降低。另外，過多的提取溶劑，會造成浪費和使生產費用增加，故選取1:20 為適宜料液比。

圖3 料液比對木犀草素提取量影響Fig.3 Effect of the ratio of material on the extraction amount of luteolin

2.1.4 檸檬酸質量濃度對紫蘇梗木犀草素浸提影響

由圖4 可知，不同檸檬酸質量濃度對木犀草素提取量的影響有所不同，在0.5%～1.0%范圍內，木犀草素提取量大幅度增加，由570.47 μg/g 增至756.87 μg/g，比單一乙醇超聲法提取（68.76 μg/g）高11 倍[20]；在1.0%～1.5%范圍內，在1.25%時達最大為802.98 μg/g，但木犀草素提取量僅比1.0%時增加46.11 μg/g。原因在于，酸性乙醇水溶液界面張力低于單一乙醇水溶液[21]，容易使得木犀草素上的酚羥基與檸檬酸上的羧基或羥基形成較強的分子間氫鍵，加大在水中分配系數，增加木犀草素提取量，而且酸性水熱體系可防止大多數植物組織中固有的過氧化酶、糖苷酶、多酚氧化酶等酶促氧化作用[22]，使木犀草素等活性物質更穩定，避免發生氧化分解；檸檬酸中COOH 基團的H+易電離[23]，協同超聲渦流空化作用，加速木犀草素傳質和溶出，但檸檬酸濃度超過1.0%時多余的H+繼續水解作用纖維組織，使其轉化成木糖、葡萄糖等小分子物質，阻礙木犀草素溶出，導致在1.25%時木犀草素提取增加量較小，故選取1.0%為適宜檸檬酸質量濃度。

圖4 檸檬酸質量濃度對木犀草素提取量影響Fig.4 Effect of citric acid concentration on the extraction amount of luteolin

2.2 水熱酸控提取木犀草素的響應曲面分析

2.2.1 回歸模型構建及顯著性檢驗 采用Design-Expert v8.0.6 軟件回歸擬合，由表2 可知，響應面試驗的設計和結果。由表3 方差分析可知二次模型極顯著P<0.0001，F=15.78，失擬項誤差不顯著（P=0.0597>0.05），決定系數R2= 0.9364>0.8，表明約93.64%的木犀草素提取量變異分布在所選取因素中，說明模型擬合情況較好，合理可靠。由F值檢驗可獲得影響木犀草素溶浸的主次因素為：水熱溫度（B）>水熱時間（A）>檸檬酸質量濃度（D）>料液比（C）。此外，A、B、D2對提取量的影響極顯著（P<0.001），D、A2、B2、C2均對提取率具有顯著性（P<0.05），其他因素不顯著，說明水熱溫度、水熱時間、檸檬酸質量濃度平方效應對紫蘇梗提取木犀草素影響最大，各因素間不是簡單的線性關系。回歸擬合得出木犀草素提取量（Y）回歸方程為:

表2 RSM 實驗設計與結果Table 2 The experimental design and results of RSM

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

Y=706.38+91.67A+176.89B+0.50C+44.37D+26.36 AB?1.99AC-10.32AD+12.76BC+4.11BD+22.13CD?33.59A2?57.82B2?44.12C2?74.81D2

2.2.2 提取因素響應面及交互作用分析 響應面可反映各因素的交互作用，響應曲面越陡峭，表明該因素對響應值影響越大；響應曲面越平穩，說明該因素對響應值影響越小[24?25]。分析圖5 可知，響應面坡面陡峭順序為AB>CD>BC>AD>BD>AC，即水熱溫度和水熱時間交互作用響應面最陡峭，與表3 中方差分析所反映的結果一致，因為水熱溫度決定水熱反應體系中熱能大小，高溫提供的熱能可有效裂解木質纖維素；而當水熱溫度不變時料液比-水熱時間，檸檬酸質量濃度-水熱時間兩交互因素的響應面變化趨勢都較平緩，對木犀草素提取量不顯著，因為延長水熱時間雖能提高溶劑對植物細胞滲透作用，但溶劑量會蒸發降低，不利于木犀草素分子發生傳質擴散和溶浸[26]。

圖5 各因素兩兩交互作用對紫蘇梗粉末提取量的響應面Fig.5 Response surface of pair-to-pair interaction of various factors on the extraction amount of Perilla stem powder

2.2.3 模型驗證 根據模型預測紫蘇梗粉末木犀草素最佳提取工藝為: 水熱時間120 min、水熱溫度230 ℃、料液比1:21.01 g/mL、檸檬酸質量濃度1.07%，此時理論木犀草素提取量為916.431 μg/g。結合實際情況，將木犀草素最佳提取工藝調整為水熱時間120 min、水熱溫度230 ℃、料液比1:20、檸檬酸質量濃度1%，進行3 次平行驗證試驗，測得紫蘇梗粉末的平均木犀草素提取量為（901.049±0.60） μg/g，與理論預測值相近，說明該模型具有重現性、可行。

2.3 水熱酸控前后紫蘇梗粉末表征分析

2.3.1 紫蘇梗粉末水熱酸控前后表面官能團分析對比圖6 發現，紫蘇梗粉末水熱酸控前后表現出相似的特征吸收峰，包括3340 cm?1處寬而強的羥基O?H 伸縮振動[27]、2946 cm?1處強而窄的?CH3、-CH2上C?H 不對稱伸縮振動、1045 cm?1附近弱而窄的C?O 伸縮振動的典型多糖物質吸收峰[28]，說明水熱酸控法不會影響紫蘇梗粉末主體結構，但會改變其內部木質纖維素化學結構。紫蘇梗粉末水熱酸控后波數3340 cm?1附近的O?H 伸縮振動減弱，說明半纖維素與纖維素間部分氫鍵、結晶結構被破壞；1750 cm?1處半纖維素上非共軛的酮、羰基和脂中的C=O 伸縮振動[29]，1120 cm?1羧基上C?O 伸縮振動、893 cm?1處纖維素中典型β-1,4 糖苷鍵上C?O?C 特征吸收峰均減弱，說明水熱體系破壞了木質纖維素組織交聯網狀結構。檸檬酸酸水解木質素、半纖維素，導致1360 cm?1纖維素中葡萄糖上O?H[30]和半纖維素中木聚糖結構分子上的?CH2彎曲振動[31]的吸收峰增強，說明多聚糖間結構發生了解聚。在1629 cm?1處與酯羰基（?COOR）和羧酸根離子（?COO?）基團伸縮振動相關的兩個吸收峰增強，表明木質纖維素部分水解轉化形成了糖醛酸[32]，1506 cm?1是木質素的特征吸收峰，來源于苯環骨架振動[33]，波數1244 cm?1附近表征木質素酚醚鍵C?O?C 伸縮振動的吸收峰增強，說明芳構化成分和取代芳香結構增加，木質纖維素發生了解聚。圖譜反映出，水熱酸控法可破壞紫蘇梗木質纖維素中C?O?C、C=O 結構單元，促進活性物質溶出。

圖6 紫蘇梗粉末底物紅外光譜分析Fig.6 Infrared spectroscopy analysis of Perilla stem powder substrate

2.3.2 紫蘇梗粉末水熱酸控前后組織形貌分析 由圖7 可知，紫蘇梗粉末原料結構完整致密，排列整齊；經處理后的紫蘇梗（圖8）表面受到一定程度的破壞，組織結構疏松，孔隙變大且出現較深的孔洞，說明水熱酸控法能破壞紫蘇梗致密組織結構，減少木犀草素溶出傳質阻力，進而增加木犀草素提取量。

圖7 紫蘇梗粉末原料SEMFig.7 SEM figure of Perilla stem powder materials

圖8 水熱酸控后紫蘇梗粉末殘渣SEMFig.8 SEM figure after pretreatment of Perilla stem powder

3 結論

本實驗采用水熱酸控法提取紫蘇梗粉末中木犀草素，在單因素實驗的基礎上結合響應面優化其提取工藝。結果表明：響應面分析的二次模型極顯著，由F值檢驗能得到影響木犀草素溶浸的因素主次為：水熱溫度>水熱時間>檸檬酸質量濃度>料液比，獲得的適宜工藝參數為：水熱時間120 min、水熱溫度230 ℃、料液比1:20、檸檬酸質量濃度1%，此時2.0000 g 紫蘇梗粉末可提取出木犀草素（901.049±0.60） μg/g。FTIR 解析可得水熱酸控能破壞紫蘇梗木質纖維素中C?O?C、C=O 結構單元，減少木犀草素溶出阻力；SEM 表明水熱酸控能打破紫蘇梗致密的組織結構，利于木犀草素溶出。