UPLC-MS/MS 法同時測定動物源性食品中37 種獸藥殘留

譚高好，王承業(yè)，鄭金明，尹青春，徐 彬，吳基任

（海南省食品檢驗檢測中心，海南海口 570314）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）和硝基咪唑類藥物（Nitroimidazoles，NMZs）因具有性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、高效、療效好、價格低和使用方便等優(yōu)點而被廣泛應用到養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)上，用來治療和預防動物的疾病感染[1?4]、促進動物的生長[5?6]。SAs 易在動物組織中富集進而通過食物鏈傳遞的方式危害人體健康，具體表現(xiàn)在破壞人的造血系統(tǒng)，導致毒性損傷及激素障礙變態(tài)反應等危害[7?9]。NMZs 長期攝入則會引起消化道不良反應，嚴重時會出現(xiàn)如變態(tài)反應、過敏性休克、泌尿系統(tǒng)損害等[10]，動物源性食品中的磺胺類和硝基咪唑類藥物的殘留對消費者身體健康構成直接威脅。

我國和歐盟將硝基咪唑類藥物列為動物性食品不得檢出的對象。《GB 31650-2019 食品中獸藥最大殘留限量》[11]明確規(guī)定地美硝唑、甲硝唑允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出；同時也規(guī)定了動物源性食品以及組織中磺胺類總量最大殘留限量（MRLs）為100 μg/kg；甲氧芐氨嘧啶MRLs 為50 μg/kg（馬肉組織為100 μg/kg）。但不合理濫用和違法使用等現(xiàn)象屢禁不止，抽檢中出現(xiàn)不合格樣品時有發(fā)生。

食品中磺胺類和硝基咪唑類藥物殘留的檢測方法報道主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）[12?15]和超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）[16?17]等。LC-MS/MS 具有快速、高效、高特異性、高靈敏度等特點，是目前檢測磺胺類及硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留常用的分析。樣品前處理方法主要有加壓液體萃取（Pressurized liquid extraction，PLE）、基質(zhì)固相分散（MSPD）、固相萃取（Solid phase extraction，SPE）等[18?21]，但都存在操作步驟多、檢測成本高、耗時長等問題，很難實現(xiàn)快速高效檢測需求；而QuEChERS 能有效除去食品基質(zhì)中的絕大部分干擾物，且具有操作簡單、快速，環(huán)境污染少等特點，因此常與LC-MS/MS 相結合分析食品中的獸藥。目前，研究報道大多數(shù)是針對磺胺類和硝基咪唑類單一種類藥物測定，或者其中少部分藥物殘留的分析，但隨著同類獸藥和具有抗菌增效作用藥物被廣泛使用，現(xiàn)有檢測方法不能滿足檢測需求。本文從質(zhì)譜條件、色譜柱、流動相、提取溶劑、凈化方式、復溶液等參數(shù)進行優(yōu)化，以期建立QuEChERS 凈化結合UPLCMS/MS 同時測定動物源性食品中37 種獸藥殘留批量檢測的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16 種硝基咪唑混標（詳見表1 序號2～17，其中羥基甲硝唑為甲硝唑代謝物）、19 種磺胺類混標（詳見表1 序號18～36） 100 μg/mL，A ChmTek. Inc；磺胺二甲異嘧啶、羥甲基甲硝咪唑（羥甲基甲硝咪唑為二甲硝咪唑、洛硝噠唑代謝物） 純度均≥99.0%，購于Dr Ehrenstorfer 公司；乙腈、甲醇 色譜純，德國Merck 公司；甲酸 色譜純，美國恩科化學（ACS）；鴨肉中磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶質(zhì)控樣品 中國檢驗檢疫科學院測試評價中心；QuEChERS 提取鹽包 安捷倫科技有限公司，部件號5982-1010、5982-0101；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，50 μm） 博納艾杰爾科技有限公司；N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm） Agela Technologies；氨基（NH2）吸附劑（40～63 μm） 逗點生物技術有限公司；陶瓷均質(zhì)子安捷倫科技有限公司；Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm） 沃特世科技有限公司；Thermo Accucore C18（2.6 μm，2.1×100 mm）賽默飛世爾科技有限公司；ACE Ultra Core 2.5 Super C18（2.5 μm，2.1 mm×100 mm） 英國ACE；HYPERSEP Rotain-PEP 固相萃取柱、EMR-Lipid 固相萃取柱（3 mL，300 mg） 安捷倫科技有限公司；Waters PRIME HLB 固相萃取柱（6cc，200 mg） 沃特世科技有限公司；羅非魚、海蝦、海蟹、螺、豬肉 海口市某農(nóng)貿(mào)市場。

表1 37 種獸藥質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Detection parameters of 37 veterinary drugs

Thermo TSQ Quantiva 三重四極桿質(zhì)譜儀（配有ESI 源）、Ultimate 3000 超高效液相色譜儀 美國Thermo Fisher 公司；Centrifuge 5804R 高速冷凍離心機 Eppendorf 公司；Multi Reax 多管渦旋混合器 德國Heidolph 公司；Mettler XS204 型十萬分之一分析天平 美國Mettler Toledo 公司；SCIENTZ-950E 超聲波提取器 寧波新芝生物科技公司；Milli-Q 超純水儀 美國Millipore 公司；AutoVap S60 多樣品自動濃縮儀 美國ATR 公司；0.22 μm 有機相針式濾器 尼龍。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作溶液的配制 分別準確稱取適量磺胺二甲異嘧啶、羥甲基甲硝咪唑標準品，用甲醇溶解配制成為濃度為100 μg/mL 標準使用溶液。

混合標準使用溶液（1.00 μg/mL）：準確吸取濃度均為100 μg/mL 的16 種硝基咪唑混標溶液、19 種磺胺類混標和100 μg/mL 的磺胺二甲異嘧啶、羥甲基甲硝咪唑標準使用溶液各100 μL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容。所有標準使用溶液置于?18 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 樣品前處理 將樣品切成小塊后用勻漿機粉碎，準確稱取2 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL 塑料離心管中，加入3 粒陶瓷均質(zhì)子，再加入10 mL 1%甲酸乙腈提取液[22]，漩渦10 min，超聲（超聲波功率800 W）10 min，4 ℃ 10000 r/min 離心5 min；凈化：取上清液2.0 mL，加入凈化鹽包（含約100 mg C18、200 mg PSA、100 mg NH2），漩渦10 min，4 ℃10000 r/min 離心5 min，取上清液1.0 mL 置于氮吹儀中，40 ℃氮吹至近干。加入1.0 mL 甲醇-水溶液（50:50, V/V），超聲溶解5 min，過0.22 μm 有機相濾膜，上機測定。

1.2.3 基質(zhì)匹配混合標準工作溶液配制 取空白樣品，按照“1.2.2 項”處理方法制得空白基質(zhì)溶液，并用其稀釋混合標準使用溶液，配成濃度分別為1、5、10、20、50、100、200 ng/mL（分別相當于測試樣品中含有5、25、50、100、250、500、1000 μg/mL 的目標化合物）系列混合標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 分析條件

1.2.4.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫35 ℃；進樣量3.0 μL；梯度洗脫程序見表2 中運行時間為16 min 的梯度。

表2 7 min 和16 min 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of 7 min and 16 min

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：H-ESI 源，正離子模式；掃描模式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；噴霧電壓3500 kV；汽化溫度350 ℃；離子傳輸管溫度350 ℃；鞘氣（氮氣）流速32 L/min；輔助氣（氮氣）流速5 L/min；碰撞氣：高純氬氣，壓力為200 KPa。優(yōu)化后37 種目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計軟件Excel 2007 和Thermo TSQ Quantiva 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配備的定量分析軟件對檢測結果進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 質(zhì)譜條件中的碰撞能量和RF Lens 電壓對離子豐度具有較大影響，對方法靈敏度有決定性作用。碰撞能量過高時，由母離子生成的碎片過多，子離子響應過低；碰撞能量過低時，不能生成所需的子離子[23]。RF Lens 電壓的優(yōu)化有利于得到更穩(wěn)定的化合物響應。本實驗通過針泵以流動注射的方式對“1.2.1 配制”中濃度均為（1.0 μg/mL）的混合標準液進行優(yōu)化，接入三通接頭并通入分析時使用的初始流動相，使優(yōu)化條件同分析條件一致，儀器默認碰撞能范圍為5～55 V 的條件下進行母離子全掃描，為每個待測藥物選取響應最高的兩對離子對及相應的最佳RF Lens 電壓和碰撞能量，并確定其定量與定性離子對（具體優(yōu)化后參數(shù)見表1）。

2.1.2 色譜柱的篩選 色譜分離優(yōu)化考慮的主要因素有共流出物分離情況和采集時間。本文對比了Waters ACQUITY UPLC BEH C18、Thermo Accucore C18和ACE Ultra Core 2.5 Super C18三種色譜柱分離效果，發(fā)現(xiàn)Waters 柱分析大部分目標物響應強度均比Thermo 和ACE 柱高。同時考察Waters 柱洗脫梯度程序對37 種目標物分離的影響，比較了運行7 和16 min 時各色譜峰的分離效果（洗脫程序見表2），由圖1 可以看出運行7 min 時總離子圖多數(shù)峰形較寬，大部分目標物都集中重疊在5～6.5 min時出峰；而運行時間調(diào)至16 min 時目標化合物峰形變尖銳，出峰分布更均勻，分離效果較好；且Waters柱對分離磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶；磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪；磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲異嘧啶三組異構體效果較好，均能達到基線分離（見圖2）。綜合分離及響應效果、峰形、色譜柱保留時間等[22,24]因素，最終選用Waters柱進行實驗分析。

圖1 37 種獸藥運行7 min 和16 min 時總離子流色譜圖（Waters BEH 柱）Fig.1 37 veterinary drugs at 7min and 16min of total ion chromatograms (Waters BEH column)

圖2 三組磺胺類異構體質(zhì)量色譜圖Fig.2 Mass chromatogram of three groups sulfonamides isomers

2.2 流動相的篩選

本研究對比了水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇、5 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈和5 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-乙腈5 種不同流動相體系對37 種獸藥的分離及響應效果。結果表明：由于乙腈洗脫能力較強，目標化合物整體出峰時間提前，存在色譜峰重疊現(xiàn)象，而且不能完全將磺胺類中磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪三種異構體色譜峰分開。在流動相中加入5 mmol/L 乙酸銨溶液時可以適當?shù)母纳品逍危瑫r大多數(shù)硝基咪唑及其代謝物的響應效果均下降，尤其是對羥甲基甲硝咪唑、羥基甲硝唑和氯甲硝咪唑三種物質(zhì)影響最大。磺胺類在酸性溶液中以分子狀態(tài)存在，從而很好地與固定相作用而被保留和分離，因此需在流動相中加入一定量的甲酸[25]。

綜合考慮，采用0.1%甲酸水-甲醇作為流動相時對大部分磺胺類和硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離效果均較好，色譜峰型、信號響應、穩(wěn)定性最優(yōu)。張鴻偉[16]、勵炯[26]等分別在分析磺胺類和硝基咪唑類藥物殘留的方法時，均發(fā)現(xiàn)流動相采用0.1%甲酸水-甲醇時各目標物分離度和質(zhì)譜響應效果最佳。因此本文選擇是0.1%甲酸水-甲醇作為體系的流動相。

2.3 樣品提取液的篩選

以空白基質(zhì)加標回收率為指標，添加100 μg/kg加標量考察各目標物回收率。本研究分別以1%甲酸-乙腈、2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈、80%乙腈-水（含1%甲酸）、1%甲酸-甲醇、2%甲酸-甲醇6 種有機溶劑作為提取液。由圖3 可知，采用5%甲酸-乙腈、80%乙腈-水（含1%甲酸）、1%甲酸-甲醇、2%甲酸-甲醇做提取溶劑時，羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的提取率均小于40%，可能是兩種物質(zhì)結構上的羥基官能團導致在酸度過高和甲醇提取體系中不易被提取出來；2%甲酸-乙腈提取時阿苯噠唑亞砜、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉5 種回收率均小于40%；選用1%甲酸-乙腈提取時37 種獸藥的回收率均在70%～100%之間。與文獻[27?29]中結果相同，綜合考慮，本文選擇1%甲酸-乙腈作為提取液。

圖3 不同提取溶劑對37 種獸藥回收率的影響Fig.3 Effects of different extraction solvents of adsorbent on recoveries of 37 veterinary drugs

2.4 凈化方式的篩選

以空白基質(zhì)加標回收率為指標，添加100 μg/kg加標量考察各目標物回收率。基于文獻[16?17,26,30?32]報道，本文比較了C18+PAS 混合吸附劑、C18+PSA+NH2混合吸附劑、HYPERSEP Rotain-PEP 固相萃取柱、安捷倫QuEChERS 提取鹽包、EMRLipid 固相萃取柱、Waters PRIME HLB 固相萃取柱6種方式的凈化效果。由圖4 可知，HYPERSEP Rotain-PEP 柱、安捷倫QuEChERS 提取鹽包、EMR-Lipid柱、Waters PRIME HLB 柱進行凈化時，大部分磺胺類回收率均小于60%，而甲氧芐氨嘧啶和硝基咪唑及其代謝物回收率均大于70%，可能是甲氧芐啶磺胺結構中苯環(huán)上的三個甲氧基的影響，使其化學性質(zhì)與其他磺胺類產(chǎn)生較大的差異。采用C18+PSA（100 mg+100 mg）和C18+PSA+NH2（100 mg+100 mg+150 mg）進行凈化時所得回收率均在60%～95%之間；通過進一步研究三種吸附劑的配比和用量：C18吸附劑含量（100、200 mg），PSA 吸劑含量（100、200 mg），NH2吸附劑含量（50、100 mg）時，從圖5 中可見當C18+PAS+NH2三種吸附劑配比為100 mg+200 mg+100 mg 時，37 種目標物回收率總體較好。因此，本試驗采用C18+PSA+NH2（100 mg+200 mg+100mg）的填料進行樣品凈化。

圖5 不同吸附劑加入量凈化對37 種獸藥回收率的影響Fig.5 Effects of different mass of adsorbent on recoveries of 37 veterinary drugs

2.5 復溶液的選擇

以空白基質(zhì)加標回收率為指標，添加100 μg/kg加標量考察各目標物回收率。按1.2 項下進行樣品前處理，取1 mL 凈化后的提取液，置于氮氣儀45 ℃吹至近干后復溶，對比不同比例的甲醇/水和乙腈/水作為復溶液對目標物回收率的影響。使用不同比例的乙腈/水作為復溶液時大部分硝基咪唑及其代謝物的峰型較差，其中羥甲基硝咪唑、羥基甲硝唑還出現(xiàn)峰分叉現(xiàn)象；由圖6 可知，隨著乙腈比比例的增大，大部分目標物回收率呈下降趨勢，其中甲硝唑、甲氧芐氨嘧啶、羥甲基甲硝咪唑下降最為明顯。采用不同比例甲醇/水復溶時，隨著甲醇比例的增加，甲苯硝唑、奧苯噠唑、氟苯咪唑、芬苯達唑4 種硝基咪唑類回收率提高至80%～90%；當甲醇比例達80%時，磺胺醋酰、羥基甲硝唑、地美硝唑、磺胺嘧啶回收率下降顯著。10%甲醇/水作為復溶液小部分硝唑咪唑及其代謝物的峰型不好，且較使用50%甲醇/水時回收率低，可能是增加甲醇的比率有利于硝基咪唑類的溶出率，但當甲醇比率太大會引起溶劑效應。綜合考慮，本試驗采用50%甲醇/水溶液為復溶液。

圖6 不同復溶液對37 種獸藥回收率的影響Fig.6 Effects of different dissolved solution on recoveries of 37 veterinary drugs

2.6 線性范圍、檢出限、定量限

采用優(yōu)化好的UPLC-MS/MS 參數(shù)進行方法學研究，基質(zhì)匹配標準曲線法定量。移取適量的混合標準溶液，用空白樣品提取液分別配制成不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)標準溶液，具體見1.2.3 項；以各組分濃度與其色譜峰面積進行線性回歸，結果37 種目標化合物均呈現(xiàn)良好的線性關系，線性范圍為1.0～200 μg/L，相關系數(shù)r≥0.9980。在空白羅非魚基質(zhì)樣品中進行低濃度加標試驗，直到目標化合物濃度添加量至信噪比為3 和10 獲得方法檢出限（LOD）為0.01～0.16 μg/kg，定量限（LOQ）0.01～0.54 μg/kg，具體數(shù)值列于表3。與現(xiàn)行相關標準比較[33?35]，本方法中硝基咪唑類及其代謝物和磺胺類的檢出限均分別低于《SN/T 2624-2010 動物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、《SN/T 1626-2019 出口肉及肉制品中甲硝唑、替硝唑、奧硝唑、洛硝噠唑、二甲硝咪唑、賽克硝唑殘留量測定方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》方法中的測定低限和《農(nóng)業(yè)部1025 號公告-23-2008 動物源食品中磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》方法中的檢測低限，說明本檢測方法靈敏度較高。

表3 37 種獸藥的線性關系、相關系數(shù)和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficents (r) and quantitative limit of 37 veterinary drugs

2.7 回收率實驗和精密度實驗

將“1.2.1 配制”的混合標準使用液添加到空白羅非魚樣品進行5、50、100 μg/kg 三個水平的添加回收實驗，每個水平取6 個平行樣，在優(yōu)化條件下進行處理后測定，平均回收率為70.1%～97.7%，方法的相對標準偏差RSD 為0.9%～5.6%，說明本方法回收率及重復性較好。對質(zhì)量濃度為20.0 ng/mL 的37 種目標物標準溶液進行重復測定6 次，RSD（n=6）為0.4%～2.3%，說明儀器具有良好的精密度。

2.8 樣品測定

為考察方法準確性和科學性，運用該方法對中國檢驗檢疫科學院測試評價中心的質(zhì)控樣品進行測定，檢測結果均在特性值區(qū)間范圍內(nèi)（見表4）。通過本文建立的方法對海口市某農(nóng)貿(mào)市場購買的152 批動物源性食品樣品中37 種獸藥殘留量的進行測定，每個樣品平行測定2 次，發(fā)現(xiàn)羅非魚1 號樣磺胺類總量和甲氧芐氨嘧啶兩個項目均不合格，羅非魚2 號樣磺胺類總量不合格，硝基咪唑及其代謝物類藥物均未檢出（見表5）。

表4 質(zhì)控樣品檢測結果Table 4 Results of quality control sample

表5 樣品中硝基咪唑類及其代謝物和磺胺類的檢出結果Table 5 The results of nitroimidazoles and their metabolites, sulfonamides in the samples

3 結論

本文通過對質(zhì)譜條件、色譜柱、流動相、提取溶劑、凈化方式、復溶液等參數(shù)進行了優(yōu)化，采用基質(zhì)匹配標準曲線外標法定量，結合UPLC-MS/MS 方法檢測，建立了UPLC-MS/MS 測定動物源性食品中37 種獸藥殘留的測定方法。運用該方法對質(zhì)控樣中磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶進行分析，結果都在特征范圍值區(qū)間之內(nèi)；并通過檢測海口市某農(nóng)貿(mào)市場購買的152 批動物源性食品樣品，發(fā)現(xiàn)兩批問題樣品。該方法前處理簡單，具有較好的準確度、靈敏度和精密度；與現(xiàn)行標準相比，縮短了前處理和分析的時間，同時降低方法檢出限和定量限，為大批量動物源性食品中硝基咪唑類藥物及其代謝物和磺胺類獸藥殘留的快速篩查和定量分析檢測提供了可靠的技術支持。