SPE-HPLC 法快速測定食品中的米酵菌酸及其膳食風險評估

鐘玉心，陳悅銘，王 宇，黃景初，彭名軍，蘇燕瑜，陳嘉欣，蔡偉誼

（廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511405）

米酵菌酸（Bongkrekic acid, BKA），也叫黃桿菌毒素A，是椰毒假單胞菌屬產生的一種線粒體毒素，其化學結構較為穩(wěn)定（見圖1），主要存在于谷類發(fā)酵制品、薯類制品、銀耳、黑木耳及椰子發(fā)酵制品等，難以去除[1?3]。研究表明，米酵菌酸通過抑制線粒體ATP 的合成，損害肝、腦以及腎臟，人食用了被米酵菌酸污染的食物會導致嚴重的食源性疾病[4?7]。近年來，米酵菌酸中毒事件時有發(fā)生，給消費者的身體健康造成重大威脅[8?11]。

圖1 米酵菌酸的化學結構Fig.1 Chemical structure of bongkrekic acid

在GB 7096-2014《食品安全國家標準 食用菌及其制品》中，規(guī)定銀耳及其制品中米酵菌酸含量不能超0.25 mg/kg[12]，但未對其他食品作出明確的限量要求。有研究表明，攝入1～1.5 mg 米酵菌酸可使人致命[11]。由于缺乏相應技術規(guī)范，在生產過程中容易造成米酵菌酸超標，導致米酵菌酸中毒事件頻發(fā)[13?14]，因此，有必要對市場流通的銀耳及其制品、酵米面及其制品和發(fā)酵型飲料等食品中米酵菌酸的含量進行檢測，并對其膳食暴露風險進行評估。為此，建立一種準確、快速、高效的米酵菌酸檢測方法，對加強食品安全監(jiān)管尤為關鍵。

目前，米酵菌酸的測定方法主要有熒光免疫層析法[15]、高效液相色譜法[16?20]、液相色譜質譜法[21?24]等。其中熒光免疫層析法方便快檢，適用于現場快速篩查，但其假陽性率較高，難以滿足監(jiān)管執(zhí)法要求；質譜法靈敏度高、檢出限低，但設備昂貴，難以推廣。我國現行的檢測標準《GB 5009.189-2016食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》[25]只適用于銀耳及其制品、發(fā)酵米面及其制品等樣品，基質類別覆蓋面小，而且液液萃取法需要消耗大量高毒性的有機溶劑，對環(huán)境不友好，回收率低[17-18]。

本研究擬建立一種SPE-HPLC 法快速測定食品中米酵菌酸含量的方法，并結合膳食暴露風險評估技術，對不同類別食品中米酵菌酸的含量展開初步風險評估，以期客觀、科學地評估食品中米酵菌酸的含量狀況，為食品安全生產及政府相關部門的監(jiān)管提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酵菌酸標準品 純度≥99.9%，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇 LC/MS 級，美國Thermo公司；氨水（優(yōu)級純）、甲酸、乙酸、乙腈（色譜純）、無水硫酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純） 天津科密歐化學試劑公司；米粉、銀耳、玉米粉、椰子發(fā)酵飲料樣品 均購自廣州市某農貿市場。

Waters 2695 高效液相色譜儀（配PDA 檢測器）、Oasis HLB 固相萃取柱（500 mg/6 mL）、XSelect HSS T3（4.6×250 mm, 5 μm） 美國Waters 公司；CP225D 電子天平 德國賽多利斯公司；TurboVap氮吹儀 美國Caliper 公司；MIlli-Q Academic 超純水系統(tǒng) 德國默克密理博公司；MA3basic 圓周震蕩器 德國IKA 公司；臺式高速冷凍離心機3-18 KS德國SIGMA 公司；C18固相萃取柱（1000 mg/6 mL）、弱陰離子交換柱Strata?-X-AW（500 mg/6 mL） 美國Phenomenex 公司；Poly-Sery MAX 固相萃取柱（1000 mg/10 mL）、色譜柱（Athena C18-WP, 4.6×250 mm, 5 μm） 上海安譜實驗科技股份有限公司；Hypersil GOLD aQ（4.6×250 mm, 5 μm） 美國賽默飛公司；Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm） 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

1.2.1.1 米酵菌酸標準儲備液（1000 μg/mL） 準確稱取米酵菌酸標準品10 mg（精確至0.01 mg），用甲醇溶解后，轉移至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。置于2～8 °C 冰箱中避光保存。

1.2.1.2 米酵菌酸標準中間液（10 μg/mL） 準確吸取100 μL 米酵菌酸標準儲備液至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。置于2～8 °C 冰箱中避光保存。

1.2.1.3 米酵菌酸標準工作液 分別移取適量米酵菌酸標準中間液，用甲醇稀釋定容，配制成0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0 μg/mL 的標準工作溶液，臨用時配制。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 樣品提取 準確稱取10 g 樣品（銀耳樣品稱取5 g，精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL超純水，20 mL 1%乙酸-乙腈（V/V），4 g 無水硫酸鈉、1 g 氯化鈉，2 g 無水硫酸鎂，迅速振散混勻，渦旋提取30 min，以8000 r/min 離心3 min，取全部乙腈層濃縮至近干，3 mL 甲醇復溶，待凈化。

1.2.2.2 樣品凈化 依次用5 mL 甲醇和5 mL 水活化Poly-Sery MAX 強陰離子交換柱，保持填料濕潤。加入100 μL 氨水將3 mL 上樣液pH 調節(jié)至9～10 過柱，棄去流出液，依次用8 mL 水和8 mL 甲醇淋洗小柱后，棄去淋洗液，最后用8 mL 甲酸-甲醇溶液（4%）洗脫并將洗脫液濃縮近干后用1 mL 甲醇定容，過0.45 μm 有機微孔濾膜，上機測定。

1.2.3 色譜條件 Athena C18-WP 液相色譜柱（4.6×250 mm, 5 μm）；流動相為甲醇：1%乙酸-水（80:20,V/V）；柱溫35 °C；波長269 nm；進樣量50 μL。

1.2.4 液相色譜條件的優(yōu)化

1.2.4.1 檢測波長的選擇 檢測波長對方法的靈敏度、準確度及選擇性具有較為關鍵的影響，本實驗對米酵菌酸在190～400 nm 進行全波長掃描，根據“收最大，干擾最小吸”的原則，選擇出最佳的檢測波長。

1.2.4.2 色譜柱的選擇 色譜柱是色譜分離的核心。本實驗以甲醇：1%乙酸-水（80:20, V/V）為流動相，在其他參數相同的條件下，分別考察了米酵菌酸標溶液在Athena C18-WP、XSelect HSS T3、Hypersil GOLD aQ 及Eclipse XDB-C18 4 種不同C18 柱上的分離情況，篩選出最佳色譜柱。

1.2.4.3 流動相比例的選擇 米酵菌酸具有3 個羧基，在酸性體系可有效抑制米酵菌酸的解離，得到更對稱的峰型。因此，本實驗在甲醇：1%乙酸-水（80:20, V/V）體系中，采用米酵菌酸標準溶液，分別考察了75%、80%、85% 3 個不同比例甲醇初始流動相的出峰情況，優(yōu)化出最佳的流動相配比。

1.2.5 樣品前處理方法的優(yōu)化

1.2.5.1 樣品提取溶劑的優(yōu)化 為優(yōu)化出最佳的樣品提取溶劑，本實驗采用空白樣品加標的方式，選取米粉、銀耳、玉米粉、椰子發(fā)酵飲料為基質，以加標回收率作為評價指標，分別考察了甲醇、氨水-甲醇-水（1:80:19）、乙腈、1%乙酸-乙腈（1:99, V/V）的提取效果。

1.2.5.2 固相萃取柱的選擇 在無凈化處理的情況下，雜質干擾大，無法進行準確測定。因此，在其他條件一定的情況下，本實驗采用銀耳作為研究基質，分別考察了C18、HLB、弱陰離子交換柱strata X-AW，強陰離子交換柱CNW Poly-Sery MAX 4 種固相萃取柱的凈化效果，篩選出最佳的凈化柱。

1.2.6 米酵菌酸穩(wěn)定性考察 有關文獻提到米酵菌酸在酸性環(huán)境及光照情況下不穩(wěn)定[16]，本實驗選取米酵菌酸五個濃度（0.1～2.0 μg/mL）的標準品分別置于冰箱避光保存、室內光照3 d、酸性條件保存3 d，在最佳色譜條件下，分別進行上機檢測，通過對比其峰面積的變化，考察米酵菌酸穩(wěn)定性。

1.2.7 方法學考察

1.2.7.1 線性范圍及檢出限 取系列米酵菌酸標準工作液，經高效液相色譜分析，以米酵菌酸的濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸分析，繪制標準曲線；以3 倍S/N 為檢出限，10 倍S/N 為定量限。

1.2.7.2 回收率和精密度 選擇米粉、銀耳、玉米粉、椰子發(fā)酵飲料4 種基質空白樣品，加入低、中、高（米粉、玉米粉及椰子發(fā)酵飲料：0.030、0.060、0.10 mg/kg；銀耳：0.060、0.012、0.10 mg/kg）3 個水平的米酵菌酸標準溶液，每個加標水平進行6 次平行測定，按照1.2.2 節(jié)進行前處理后，進行高效液相色譜測定，根據測定結果對其回收率及精密度進行分析。

1.3 膳食風險評估

在食品安全風險評估方面，我國已取得一些成果，但仍處于初級階段，相關工作仍參考國外膳食暴露風險評估技術[26?27]。本研究參照文獻[28]的評價方法，計算米酵菌酸的危害商HQ，當HQ>1 時，表明米酵菌酸的膳食暴露風險較大；反之，當HQ<1 時，則其暴露風險較小。HQ 的具體計算公式如下：

其中“理論含量”采用食品中米酵菌酸的含量，在未檢出的樣品中，米酵菌酸的含量以上述所建方法檢出限的一半計算；參照文獻及國家食品安全風險評估委員會的相關規(guī)定，米粉、銀耳、玉米粉、椰子發(fā)酵飲料的每日平均膳食量分別按300、300、300、500 g 計算；平均體重按60 kg 計算；ADI 為每日允許攝入量。

1.4 數據處理

本實驗采用SPSS Statistics 22（美國IBM 公司）及Microsoft Excel（美國Microsoft 公司）對檢測結果進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇 由米酵菌酸的全波長掃描圖（圖2）可知，在269 nm 處出現最大吸收峰，235 nm次之，根據“收最大，干擾最小吸”的原則，本實驗采用269 nm 為米酵菌酸的最佳檢測波長。此結果與李紅艷等[16]報道的一致。

圖2 米酵菌酸吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectrum of bongkrekic acid

2.1.2 色譜柱的選擇 分別采用Athena C18-WP、XSelect HSS T3、 Hypersil GOLD aQ 及 Eclipse XDB-C184 種不同型號的C18柱對米酵菌酸標準溶液進行分析，結果見圖3。由圖3 可知，米酵菌酸在pH 耐受范圍為1.5～10 的Athena C18-WP 液相色譜柱上能夠得到最佳的分離效果和穩(wěn)定的響應值，基質峰不對目標峰造成干擾，因此本實驗選擇Athena C18-WP 色譜柱進行分離。

圖3 不同C18 柱的分離效果Fig.3 Separation efficiency of different C18 Columns

2.1.3 流動相比例的選擇 按照1.2.4.3 節(jié)的方法進行試驗，結果見圖4。由圖4 可知，當甲醇比例為75%時，米酵菌酸的出峰時間為13.2 min，且峰寬較大，分離度差；當提高甲醇的比例85%時，米酵菌酸的出峰時間提前至6.2 min，峰形較好，但空白基質樣品在6.3 min 附近有干擾峰，不利于準確測定。因此將流動相調節(jié)為1%乙酸水-甲醇（20:80）等度洗脫，米酵菌酸在9.5 min 出峰，出峰時間短，且無雜質干擾。

圖4 不同流動相中米酵菌酸的標準色譜圖Fig.4 Standard chromatograms of BKA in different mobile phase

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取溶劑的優(yōu)化 以米粉、銀耳、玉米粉、椰子發(fā)酵飲料為基質，分別考察甲醇、氨水-甲醇-水（1:80:19, V/V）、乙腈及1%乙酸-乙腈（1:99,V/V）4 種不同提取溶劑的提取效果，回收率結果見表1。由表1 可知，采用甲醇及乙腈作為提取溶劑時，對4 種基質中米酵菌酸的回收率只有40%～65%，不能滿足分析要求；采用氨水-甲醇-水作為提取溶劑時，米粉、玉米粉及椰子發(fā)酵飲料中的回收率較高，但是在銀耳中的回收率只有60%，而且甲醇和水相不分離導致氮吹濃縮時間較長；另外，對于成分復雜的銀耳樣品，由于多糖（中性多糖和酸性多糖）含量較高，堿性條件下提取會導致多糖及色素大量溶出，且提取液體較為粘稠，在過柱時容易導致固相萃取柱堵塞或者過載；1%乙酸-乙腈對4 種樣品基質中米酵菌酸的提取效果較好，回收率均大于90%，而且，在酸性條件下，米酵菌酸的解離受到抑制，有利于從水相轉移到有機相，另外，水相層可以去除部分水溶性干擾物，減少固相萃取柱過載現象，因此，本實驗1%乙酸-乙腈（1:99, V/V）作為最佳提取溶劑。

表1 不同提取劑對米酵菌酸的回收率Table 1 The recovery rate of bongkrekic acid by different extractants

2.3 固相萃取柱的選擇

本實驗考察了C18、HLB、弱陰離子交換柱strata X-AW，強陰離子交換柱CNW Poly-Sery MAX 4 種固相萃取柱的凈化效果，結果見圖5。由圖5 可知，米酵菌酸在C18、HLB 固相萃取柱上幾無保留，而在陰離子交換柱strata X-AW，Poly-Sery MAX 有保留，而非文獻報道的米酵菌酸于弱陰離子交換柱上無法保留[29]。

圖5 不同型號SPE 小柱凈化效果Fig.5 Purification efficiency of different SPE

Strata X-AW 為混合弱陰離子交換柱，含有弱堿性基團，包括伯胺基（-NH2），仲胺基（-NHR），叔胺基（-NR2），在水中能解離出OH-而呈弱堿性，可在中性和酸性條件下使用，其正電基團能與目標化合物的羧基相結合而使得米酵菌酸保留；Poly-Sery MAX 為混合性強陰離子交換柱，含有強堿性季胺基團，pH 耐受范圍為2～12，在水溶液中任何pH 條件下都能使硅膠鍵合相帶上正電荷，正電基團能與米酵菌酸的羧基相結合，所以上樣液pH 調節(jié)至9～10 可使得米酵菌酸完全離子化為陰離子，與強陰離子交換柱的季胺正離子發(fā)生高效的離子相互作用而使得米酵菌酸保留。從圖5 可知，Strata X-AW 及Poly-Sery MAX柱子的凈化效果較好，米酵菌酸出峰位置無其他雜質峰干擾。

另外，本實驗對strata X-AW 及Poly-Sery MAX固相萃取柱的加標回收率進行了考察，結果顯示，弱陰離子交換柱子strata X-AW 的加標回收率為76%，回收率較低；而Poly-Sery MAX 強陰離子交換柱子的加標回收率達98%，滿足檢測要求。因此，本實驗選用Poly-Sery MAX 固相萃取柱用于樣品的凈化處理。凈化步驟為：依次用5 mL 甲醇和5 mL 水活化小柱；用氨水將待凈化液的pH 調節(jié)至9～10 過柱，棄去流出液，依次用水和甲醇淋洗小柱，除掉糖類及蛋白質，棄去淋洗液；最后用4%甲酸-甲醇溶液洗脫，并將洗脫液濃縮近干后用1 mL 甲醇定容。

2.4 米酵菌酸穩(wěn)定性考察

按照1.2.6 節(jié)進行米酵菌酸的穩(wěn)定性試驗，結果見圖6。由圖6 可知，在室內燈光照射與酸性條件下米酵菌酸較為穩(wěn)定，實驗過程使用的酸性條件及室內燈光照射不會影響檢測結果。

圖6 保存條件對米酵菌酸穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of storage conditions on stability of bongkrekic acid

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍及檢出限 配制系列標準工作液，在上述最佳分析條件下進行上機檢測，以濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性方程為y=1.49×105x?319（R2=0.9999）。結果表明，在0.01～2.0 μg/mL 濃度范圍內線性良好。米酵菌酸的檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為2.0 μg/kg和6.7 μg/kg。

2.5.2 回收率和精密度 采用米粉、銀耳、玉米粉、椰子發(fā)酵飲料4 種不同基質，考察所建方法的回收率及精密度（n=6），結果見表2。由表2 可知，4 種樣品平均加標回收率在90.0%～104.0%，相對標準偏差小于5%，結果表明所建方法精密度高，重現性好，可適用于四種高危基質中米酵菌酸的測定。

表2 米酵菌酸回收率及精密度結果（n=6）Table 2 Results of recovery and relative standard deviation（n=6）

2.6 膳食風險評估

為評估廣州市在售食品中米酵菌酸膳食風險水平，從廣州市市場隨機抽取米粉、銀耳、玉米粉、椰子發(fā)酵飲料樣品各10 份，采用所建立的方法進行分析。結果顯示，所抽取的40 分樣品中，共有8 個樣品檢出米酵菌酸，含量在10.6～50.8 μg/kg，均低于GB 7096-2014《食品安全國家標準 食用菌及其制品》中0.25 mg/kg 的限量，其中銀耳樣品檢出米酵菌酸最高達50.8 μg/kg，其余樣品均未檢出米酵菌酸（含量低于2.0 μg/kg）。

目前，國內外對米酵菌酸的ADI 值未有明確的規(guī)定。本文根據風險最大化原則，參考GB 7096-2014《食品安全國家標準 食用菌及其制品》規(guī)定銀耳及其制品米酵菌酸理化指標，中國居民的平均體重以60 kg 計，每日平均膳食量按0.5 kg 計，估算出米酵菌酸的ADI 值為2.08 μg/（kg bw）；以隨意抽取的40 份樣品中米酵菌酸的含量為對象，按1.3 節(jié)的方法對米酵菌膳食風險進行評估，結果見表3。由表3可知，米酵菌酸的膳食危害商值為0.0747，遠低于臨界值1，即米酵菌酸的膳食風險較低，對消費者的膳食安全構成威脅的概率較低。

表3 米酵菌酸膳食風險評估計算結果Table 3 The results of the dietary risk assessment of bongkrekic acid

3 結論

本研究建立了食品中米酵菌酸含量的檢測方法。本方法處理簡單快速、有機試劑消耗量少、準確性高、適范圍較廣，方法學指標滿足實際檢測要求，是現有標準的細化和補充，適用于對米酵菌酸的風險監(jiān)控，對檢測部門開展相應的常規(guī)分析檢測具有重要的意義；以隨意抽取的40 份樣品中米酵菌酸的含量為對象，結合膳食風險評估方法，初步評估了米酵菌酸的膳食暴露風險水平。結果顯示，米酵菌酸的膳食暴露風險概率為0.0747，遠低于臨界值1，對一般消費者的健康產生威脅的概率較低。

目前，我國只針對銀耳及其制品中米酵菌酸含量作出限量要求，而其他食品中的米酵菌酸含量仍未有明確的規(guī)定。因此，建議相關研究人員針對其他食品中米酵菌酸含量進行全面、科學的安全風險評估，并建立相關食品安全標準規(guī)范，以加強對米酵菌酸的安全監(jiān)控，保障消費者的健康。