凍藏的溫度波動對三文魚化學指標值及持水力的影響

朱軼群，楊永安，劉建福，田繼源，李靜靜

（天津商業大學機械工程學院，天津 300134）

三文魚學名為大西洋鮭魚。中國對三文魚的消費需求越來越高，在2018 年的前3 周時間里，挪威出口到中國的三文魚總量上漲到了557 t[1]。三文魚屬于冷水魚類，適宜生活在溫度較低的高緯度地區，如挪威、智利、俄羅斯、美國和日本等國家[2]。

三文魚是世界名貴的食用魚類之一，肉色多為紅色或橙紅色，肉質緊密細膩，口感柔潤嫩滑，深受消費者喜愛，有重要的商業價值。其營養價值也很高，富含蛋白質、ω-3 不飽和脂肪酸、維生素等。ω-3 不飽和脂肪酸具有能有效降低血脂和血膽固醇、預防心血管疾病、腦功能退化和老年癡呆等功效[3]。100 g三文魚約含3～20 mg 的維生素A，維生素A 促進胎兒發育和生殖能力，有益于人體的視力和免疫力。100 g 三文魚約含3～9 mg 維生素B12，維生素B12對人體內新細胞的形成十分重要。100 g 三文魚能提供人體每日所需的80%～100%的維生素D。

三文魚中富含水分、蛋白質、不飽和脂肪酸等營養物質，易被細菌侵染、脂肪易發生氧化、分解。冷凍是三文魚保藏的重要方式之一，占有重要地位。遠洋捕撈后空運過來的三文魚在沒有上市前需要冷凍長期儲存。秘魯出口冷凍三文魚占出口總額的42%[4]。中國進口三文魚主要為鮮冷和冷凍三文魚，中國每年從日本進口4～6 萬噸冷凍三文魚[2]。另外，三文魚中可能含有一些寄生蟲，低溫冷凍可以殺滅寄生蟲。

凍藏溫度達到?18 ℃時，三文魚凍結率達90%。凍藏溫度在?40 ℃以下使幾乎全部自由水凍結，能夠更好的保持三文魚的品質[5?7]。由于一大部分三文魚肉被消費者生食，常以超低溫（?50 ℃以下）凍藏的方式進行保鮮[8]。而建造溫度達到?40 ℃以下的超低溫冷庫成本大，制冷系統COP 低，耗能高。超低溫凍藏過程中，溫度精準控制不易，溫度波動較高，并且會出現局部溫度偏差[9]。

溫度波動使食品中冰晶重新結晶，改變微觀結構，不可逆轉地損傷細胞和組織，加速變質[10?11]，再結晶降低了冷凍食品的質量和保質期[12]。短期冰鮮冷藏溫度波動對三文魚的品質的影響已有很多研究報道[13?15]，王一帆等[15]在4 ℃凍藏環境下，得出(4±0.1) ℃三文魚樣品的高品質貨架期比(4±2) ℃長近1 d。張寧等[16]研究表明貯運期間多次溫度變化的三文魚pH、失重率、TVB-N、菌落總數及K 均上升，感官評分下降，品質遠低于始終處于0 ℃的三文魚肉。然而，凍藏條件下，溫度波動對三文魚的化學指標及持水力的影響報道較少。

?18 ℃低溫凍藏冷庫比?50 ℃超低溫凍藏庫具有明顯的建設成本與運行成本低的優勢。本研究旨在 通 過 對 比 分 析?18 ℃組（(?18±2) 、(?18±1)、(?18±0.5) ℃）和?50 ℃組三文魚樣品的化學品質及持水力的變化，探討減小?18 ℃環境溫度波動達到?50 ℃超低溫環境的凍藏效果的可行性。即通過研究三文魚樣品在?18 ℃凍藏環境下，溫度波動對其化學品質和持水力的影響，驗證將?18 ℃三文魚樣品的溫度波動減小到一定程度，可以在短期凍藏時間內將三文魚樣品的凍藏溫度從?50 ℃提高至?18 ℃，從而降低制冷系統能耗，節約建設成本與運行成本，為開發低溫冷庫提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

挪威三文魚 當地捕撈去除內臟后，冰藏空運至天津市，由天津市紅橋區麥德隆商場的專業人員在冷藏環境對魚剔骨、魚背肉切塊，通過采用鋪碎冰的保溫箱將其快速運回并凍藏；硼酸（青海利亞達化工有限公司）；鹽酸、高氯酸（國藥集團化學試劑有限公司）；甲基紅乙醇、溴甲酚綠乙醇（上海熹垣生物科技有限公司）；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、磷酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（天津市盛鑫源偉業貿易有限公司）；腺苷三磷酸、腺苷二磷酸（湖北鴻鑫瑞宇精細化工有限公司）；肌苷酸（西安拉維亞生物科技有限公司）；腺苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤（湖北萬得化工有限公司）。

UDK159 全自動凱氏定氮儀 意大利VELP 公司；Thermo Evolution 201 紫外可見分光光度計 美國Thermo Scientific 公司；Waters e2695 高效液相色譜儀 美國Waters 公司；DHG-9140 電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；NMI20-025V-1 核磁共振成像分析儀 美國 Hunterlab Associates lab Inc 公司；SMART 200PLC 控制器 德國西門子股份公司；MBT153PT100 溫度傳感器 丹麥丹佛斯。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計 將三文魚樣品的凍藏環境溫度分為溫度波動組和對照組兩個組，溫度波動組為（?18±0.5）、（?18±1 ）、（?18±2） ℃組，對照組為（?50±0.1） ℃。實驗凍藏6 個月期間，每隔1 個月對凍藏三文魚樣品的品質指標進行分析。不同溫度波動冷柜的控制是通過獨立編程的PLC 控制系統實現的，根據溫度波動設置制冷啟停溫度，使得冰柜的溫度維持在啟停溫度之間。例如（?18±0.5） ℃，設置的制冷機開啟溫度為?17.5 ℃，停機溫度為?18.5 ℃。

1.2.2 TVB-N 值（total volatile base nitrogen, TVBN）的測定 采用GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》自動凱氏定氮法[17]。凍藏三文魚在4 ℃冰箱中解凍12 h 后絞碎，稱取10 g 放入250 mL 錐形瓶內，加100 mL 水，間歇振搖，浸漬30 min 后過濾，吸取10.0 mL 濾液滴入蒸餾管中，然后放入1 g 氧化鎂。設定蒸餾時間180 s。硼酸接收液30 mL，滴加10 滴混合指示液。使用鹽酸標準溶液（0.1000 mol/L）滴定硼酸，采用顏色變化方式判斷滴定終點。每組不少于6 個測試結果，取平均值。

三文魚樣品的揮發性鹽基氮含量按以下公式計算：

式中：X 為TVB-N 含量，mg N/（100g）；c 為鹽酸標準溶液實際濃度，mol/L；V1為消耗的鹽酸標準液的體積，mL；V0為試劑空白消耗的鹽酸標準液的體積，mL；m 為樣品質量，g；V2為樣液總體積，mL；V3為測定樣液體積，mL；14 為與1.00 mL 1 mol/L鹽酸標準液相當的氮的質量，mg。

1.2.3 TBARS（Thiobarbituric Acid Reactive Substance，TBARS）值的測定 參照Salih 等[18]的TBARS 值測定方法，稍有改動。取在4 ℃下解凍12 h 絞碎后的5.00 g 三文魚樣品于100 mL 錐形瓶中，將質量分數為25%的50 mL 三氯乙酸加入其中，搖勻密封，在恒溫振蕩器上50 ℃振搖30 min 后冷卻至室溫，過濾，稱取濾液5 mL 和標準系列溶液5 mL 分別置于25 mL 具塞比色管內，另外量取三氯乙酸5 mL 作為樣品空白，分別向其中加入TBA 溶液5 mL，將三組溶液加塞混勻后進行30 min 的90 ℃水浴，冷卻到室溫后，以樣品空白調節零點，于532 nm 處1 cm光徑測定樣品溶液的吸光度值和標準系列溶液的吸光度值[19]。

TBARS 值用丙二醛質量分數表示。三文魚樣品中丙二醛含量按以下公式計算：

式中：X 為丙二醛含量，mg/（kg）；c 為從標準系列曲線中得到的試樣溶液中丙二醛濃度，μg/mL；V 為定容體積，mL；m 為最終試樣溶液所代表的試樣質量，g。

1.2.4 K 值的測定 參照湯水粉等[20]的方法，略有改動。稱取在4 ℃下解凍12 h 絞碎后的（2.00±0.02） g 三文魚樣品于50 mL 普通離心管中，加入20 mL在4 ℃下冷卻的10%高氯酸溶液后渦旋振蕩1 min，取其在4 ℃下 8000 r/min 離心10 min 后的上清液。用20 mL 5%的高氯酸溶液重提沉淀物，取其在4 ℃下8000 r/min 離心10 min 后的上清液，合并兩次的上清液。將上清液的pH 用10 mol/L 的NaOH 溶液調節至近6.0，繼續將其pH 值用1.0 mol/L的NaOH 溶液調節至6.0～6.4，采用蒸餾水將該混合液定容到50 mL。在4 ℃下8000 r/min 離心10 min后采用0.22 μm 的微孔濾膜將上清液過濾，濾液用于高效液相色譜分析。色譜條件：ODS-sp 色譜柱，150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm。柱溫35 ℃。流動相為 0.02 mol/L KH2PO4和0.02 mol/L K2HPO4（1:1）溶液，用磷酸調節pH 至6.0。進樣量20 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm。

K 值是表征魚類新鮮度的指標。通過ATP 關聯物含量的變化可計算出K 值。

式 中：MATP是 樣 品 中ATP 的 含 量，μmol/g；MADP是樣品中ADP 的含量，μmol/g；MAMP是樣品中AMP 的含量，μmol/g；MIMP是樣品中肌苷酸（Inosine Monphonsphate, IMP）的 含 量，μmol/g；MHxR是樣品中次黃嘌呤核苷（inosine, HxR）的含量，μmol/g；MHx為樣品中次黃嘌呤（Hypoxanthine, Hx）的含量，μmol/g。

1.2.5 持水力的測定 參照王碩等[21]的方法。準確稱取不同溫度波動范圍條件下凍藏的三文魚樣品2.0000 g，用定性濾紙包好，5000 r/min 離心10 min后稱量質量，按照如下公式計算質量損失率。

式中：m1是離心前魚肉質量，g；m2是離心后魚肉質量，g。

1.2.6 低場核磁共振（Low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR）T2時間測定 參考Liu 等的方法[22]，略作修改。采用NMI20-025V-1 核磁共振成像分析儀測量。質子共振頻率為20.827 MHz。設置儀器參數：采樣頻率SW 為200 kHz，采樣點數TD 為240012，重復采樣間隔時間TW 為2500 ms，累積次數NS 為4，回波時間TE 為0.2 s，回波個數NECH 為6000。

1.2.7 數據分析 實驗中分別采用Excel 軟件、Origin Pro 8.5 軟件、SPSS 20.0 軟件、ANOVA 進行實驗結果統計、繪制分析圖、Pearson 相關系數分析、單因素方差分析（P<0.05 表示差異顯著）。實驗數據都按照“平均值±標準差”來表示。

2 結果與分析

2.1 溫度波動對凍藏三文魚TVB-N 值的影響

圖1 為三文魚的TVB-N 值在凍藏期間的變化。隨著凍藏時間的延長，三文魚的TVB-N 值持續增加。TVB-N 值是測定蛋白質在微生物和酶作用下分解產生堿性含氮物質的總量，TVB-N 值可以作為肉類的腐敗指標[23]，當TVB-N 值在25 mg N/100 g以下時三文魚可以生食[15]。隨著凍藏時間的延長，在酶和細菌的作用下蛋白質分解產生氨及胺類等堿性含氮物質不斷積累，因而TVB-N 值不斷增大。

圖1 凍藏期間三文魚TVB-N 值的變化Fig.1 Changes in TVB-N value of salmon during frozen storage

三文魚TVB-N 值隨著凍藏環境的溫度波動幅度增大而顯著增加（圖1）。三文魚凍藏前的初始TVB-N 值為6.21 mg N/100 g，?18 ℃凍藏環境的溫度波動為± 0.5、± 1 ℃和± 2 ℃時，凍藏6 個月后TVB-N 值分別增大到19.06、23.25 mg N/100 g 和25.91 mg N/100 g。溫度波動越大，使得組織中冰晶重結晶和進一步生長，破壞了肌纖維結構，釋放氧化酶等促氧化因子的速率越快，使蛋白質氧化分解生成的堿性含氮物質速率越快[24?25]，所以TVB-N 值越大。另外，溫度波動為（?18±0.5）、（?18±1） 和（?18±2）℃組的三文魚樣品的TVB-N 值在凍藏時間5、4 和3 個月時與（?50±0.1） ℃組6 個月時的TVB-N 值相當，并且此時三文魚樣品的TVB-N 值在25 mg N/100 g 以下，可以生食。說明溫度波動幅度影響?18 ℃的凍藏時間，減小溫度波動至±0.5 ℃，?18 ℃凍藏環境下短期凍藏三文魚（5 個月以內）可以達到低溫凍藏（?50 ℃）三文魚TVB-N 值的效果，并且?18 ℃的凍藏能耗遠低于?50 ℃。

2.2 溫度波動對凍藏三文魚TBARS 值的影響

圖2 為三文魚TBARS 值隨凍藏時間的變化關系。TBARS 值用于評估脂質的氧化程度，主要檢測由不飽和脂肪酸降解產生的丙二醛含量（Malondialdehyde，MDA）[26]。隨著凍藏時間的延長，三文魚樣品的TBARS 值增大。凍藏6 個月期間，（?18±0.5）、（?18±1）和（?18±2）℃組三文魚樣品的TBARS 值從相同的初始值0.11 mg MDA/kg分別增大到1.65、1.89、1.96 mg MDA/kg。這是由于隨著凍藏時間的延長，脂質的氧化分解產物，如醛、酮、脂肪酸等具有令人難以接受的氣味物質不斷積累，使TBARS 值越來越大。

由圖2 還可知，凍藏的溫度波動幅度顯著影響三文魚的TBARS 值。溫度波動越大，冰晶增長程度越大，對肌肉組織細胞造成機械損傷程度越大，各種破裂的細胞器釋放出的氧化酶和脂肪氧化的前提物質特別是鐵離子越多，加劇了脂質的氧化，次級氧化產物不斷積累，表現為丙二醛的檢測含量多，所以溫度波動幅度越大，TBARS 值越大[25]。（?18±0.5）℃凍藏3 個月左右的三文魚樣品的TBARS 值與（?50±0.1）℃三文魚樣品凍藏6 個月時的TBARS 值基本相同。

圖2 三文魚TBARS 值變化Fig.2 Changes in TBARS of salmon

2.3 溫度波動對凍藏三文魚K 值的影響

K 值是評價魚類新鮮度的指標，K 值越大，說明三文魚越不新鮮，一般認為K 值在20%以下為可生食標準，K 值達到60%不適宜食用[16]。

凍藏期間K 值不斷增加，凍藏環境的溫度波動幅度顯著影響K 值增長（圖3）。凍藏三文魚樣品的初始K 值為9.87%，6 個月后，（?18±0.5）、（?18±1）、（?18±2）℃凍藏環境下K 值分別增大至43.28%、55.38%、63.54%。（?18±0.5）、（?18±1）、（?18±2）℃組三文魚樣品的K 值分別在凍藏5 個月時、4 個月時、3 個月時與（?50±0.1）℃組6 個月時的K 值相當。該結果表明，?18 ℃凍藏環境條件下減小溫差波動、縮短凍藏時間可達到（?50±0.1）℃的凍藏效果。凍藏期間溫度波動越大，冰晶重結晶現象越明顯，細胞結構破壞，導致肌苷酸（inosine monphonsphate， IMP） 下 降 速 率 增 大 以 及 次 黃 嘌 呤（hypoxanthine，Hx）不斷積累[27?28]，K 值增大。由圖3可以看出，雖然（?18±0.5）℃組的三文魚樣品的K 值在5 個月時與（?50±0.1）℃組6 個月時的K 值相當，但是此時K 值大于20%；而在3 個月內，（?18±0.5）℃組的三文魚樣品的K 值在20%以下，所以在保證三文魚樣品K 值品質的前提下，凍藏時間為3 個月內時，減小溫度波動幅度至±0.5 ℃，可以將凍藏溫度從?50 ℃提高至?18 ℃。

圖3 三文魚K 值變化Fig.3 Changes in K value of salmon

2.4 溫度波動對三文魚持水力的影響

持水力能直接反映肌肉抑制水分流失的能力[29]。圖4 為凍藏期間三文魚持水力的變化。凍藏6 個月時，（?18±0.5）、（?18±1）、（?18±2）℃組三文魚樣品的持水力從初始的86.31%分別下降至57.16%、53.49%和51.67%，溫度波動越大，三文魚樣品持水力下降的程度越大，溫度波動減小至±0.5 ℃時，（?18±0.5）℃組三文魚樣品的持水力凍藏5 個月時與（?50±0.1） ℃組凍藏6 個月時的持水力相當。生產上，通過減小溫度波動幅度至±0.5 ℃以內，短期內可將三文魚的凍藏溫度從?50 ℃提高至?18 ℃。隨著凍藏時間的延長以及溫度波動存在，凍融循環使得冰晶不斷增大，導致肌原纖維蛋白失水變性，對肌肉組織細胞造成機械損傷，造成大量汁液流失[30]，持水力下降。

圖4 三文魚持水力變化Fig.4 Changes in water holding capacity of salmon

2.5 水分遷移變化

圖5 三文魚樣品T2 分布Fig.5 T2 distribution in transverse relaxation time of salmon

表1 為利用LF-NMR 技術測得的三文魚水分弛豫時間變化情況。由表1 可以看出，溫度波動組T2b隨著凍藏時間的延長變化較小，這是由于結合水是與蛋白質緊密結合的水分子，凍融循環不易使其與蛋白質解離；T21隨著凍藏時間的延長而減小，這是因為凍融循環使得冰晶長大，肌原纖維蛋白的空間結構發生變化，蛋白質持水性變差，不易流動水的移動性降低；T22呈現先減小后增大的趨勢，與李玫等[34]的實驗結果一致。與（?50±0.1) ℃對照組的T2b、T21、T22相比，（?18±2）℃組的三文魚樣品在凍藏6 個月期間的T2b、T21、T22三種弛豫時間均極顯著減?。≒<0.01），(?18±1) ℃組凍藏三文魚的T2b、T21、T22均顯著減?。≒<0.05），（?18±0.5）℃組凍藏三文魚的T2b、T21、T22均差異不顯著（P>0.05）。所以溫度波動越大，對自由水、不易流動水及結合水的影響越大，其中結合水不易解離或蒸發，不易受肌肉蛋白質結構以及電荷變化的影響，即溫度波動對結合水的影響最小。

表1 溫度波動對三文魚橫向弛豫時間的影響Table 1 The effect of temperature fluctuation on the transverse relaxation time and water content of salmon

2.6 相關性分析

表2 所示為三文魚各項化學品質指標的相關性。表中數據有正有負，表示各項指標之間存在正相關或負相關。每個數據的絕對值大小代表兩項化學指標的相關性強弱，數據越大，越接近于1，代表兩項化學指標相關性越強。

表2 三文魚樣品各品質指標間的相關性分析Table 2 Correlation analysis of quality indexes of salmon samples

TBARS 值與K 值之間的相關系數為0.904，TBARS 值與TVB-N 值之間的相關系數為0.817，TVB-N 值與K 值的相關系數為0.885，可以看出三項化學指標兩兩互相呈強正相關。表明凍藏三文魚的各項品質指標都不是獨立存在的，各項化學品質指標在凍藏時間、凍藏溫度和凍藏溫度波動幅度等因素的共同影響下，導致三文魚發生肌肉纖維松散、蛋白質變性、含氮物質增多、脂質氧化以及持水力下降等變化。特別是在溫度波動組中，在反復的凍融循環的影響下，三文魚的各項化學品質指標及持水力劣化更為嚴重。

三文魚樣品的水分弛豫時間與三項化學指標均呈較強的負相關，表示隨著凍藏時間的延長以及凍融循環的延續，T2b、T21和T22整體呈減小趨勢，持水力下降；K 值、TVB-N 值和TBARS 值呈不同程度的增大，蛋白質、脂質及新鮮度劣化。T2b與三項化學指標相關性最強，其中與TVB-N 值相關性達到0.857。這是由于隨著凍藏時間的延長，在酶和細菌的作用下蛋白質分解產生氨及胺類等堿性含氮物質不斷積累，TVB-N 值不斷增大，與蛋白質緊密結合的結合水呈減少趨勢，二者共同反映凍藏過程中蛋白質的腐敗程度。

2.7 持水力的多元線性回歸擬合方程

對三文魚的持水力通過Origin 軟件進行二因素方差分析，隨著凍藏時間的延長，在不同的溫度波動幅度之間三文魚的持水力有顯著差異（P<0.05）。自變量為凍藏時間和溫度波動幅度（實驗中為0.5、1、2 ℃），因變量為持水力，采用MATLAB 軟件建立了多元線性回歸擬合方程（4）：

式中：y 為持水力，%；ΔT 為溫度波動幅度，℃；t 為凍藏時間，月。

表3 為對擬合方程的驗證?？梢钥闯鰯M合結果與實驗結果平均相差1.0%以下，擬合方程準確可靠，為建立貨架期預測提供依據。

表3 擬合方程結果驗證Table 3 Verification of the result of the fitting equation

3 結論

凍藏（?50、?18 ℃）6 個月期間，溫度波動越大，三文魚TVB-N 值、TBARS 值和K 值等化學指標值上升越劇烈，持水力下降趨勢越明顯。三文魚樣品的TVB-N 值、TBARS 值及K 值之間兩兩互相呈強正相關，三項弛豫時間與三項化學指標呈較強負相關。隨著三文魚凍藏時間的延長，在不同的凍藏溫度（?18 、?50 ℃）及溫度波動幅度范圍（±0.5、±1、±2 ℃）之間持水力有顯著差異（P<0.05）。

在保證三文魚各項化學指標及持水力品質的前提下，在3 個月短期凍藏期間，將溫度波動幅度減小至±0.5 ℃，可以將三文魚的凍藏溫度從?50 ℃提高至?18 ℃，從而降低能耗，節約建設與運行成本。