超聲波處理對采后甜柿品質及相關酶活性的影響

劉夢培，孫文文，韓衛娟，傅建敏，索玉靜,*，縱 偉,*

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450002；2.國家林業和草原局泡桐研究開發中心，河南鄭州 450003）

柿（Diospyros kakiThunb.）為柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros），是我國主要經濟林樹種之一，具有重要的經濟、生態和社會價值[1]。據2018 年聯合國糧農組織統計，我國柿栽培面積約98.15 萬 hm2，年產量達421.64 萬 t，均居世界之首，分別占世界的91.32%和73.32%[2?4]。“陽豐”甜柿作為種植面積最廣泛的甜柿品種之一，主要分布在山西、陜西、河北、湖北等地。其果實香甜多汁，含有豐富的糖、維生素、礦物質、胡蘿卜素等營養物質，不僅可以清熱潤肺和健脾澀腸，還能起到治療咳嗽和止血的作用，深受消費者喜愛[5?6]，但在貯藏期間因受到內源乙烯的影響，果實容易軟化、褐變，耐貯性差[7]。因此，適當的貯藏保鮮技術對于延長采后柿果實的貯藏期極其重要。目前已有的保鮮技術有物理保鮮（氣調貯藏保鮮）[8]、化學保鮮（亞硫酸氫鈉保鮮）[9]和生物保鮮（基因工程保鮮）[10]，但這些保鮮技術因成本過高、存在化學試劑的殘留和操作麻煩等缺點而未得到大量的推廣應用[11]。

與傳統保鮮方法相比，超聲波保鮮技術具有條件溫和、安全、清潔和無副作用等特點[12]。其作用機理主要依賴于空化效應，空化效應使液體介質中產生大量微小氣泡，氣泡在運動過程中產生強烈的局部高溫和高壓，可有效殺滅果蔬表面微生物、降解農藥殘留、抑制酶活、調控質構和顏色等采后品質[13?14]。陳廣艷[15]對沂州木瓜進行了超聲波處理保鮮效果的研究，研究發現經超聲處理后的果實可較好的保持維 C和可滴定酸含量，且果實硬度保持時間長，可溶性固形物轉換得到較好抑制，與對照組相比，果實質量損失率及腐爛率均明顯降低。Aday 等[16]以草莓為試材，研究表明經過超聲波處理的草莓與未處理的草莓相比其硬度差異顯著。Wang 等[17]研究了超聲技術對采后圣女果腐敗微生物、品質和抗氧化能力的影響，發現超聲波能有效地減少腐敗微生物，通過抑制乙烯產生和呼吸速率來延緩采后成熟，從而保持圣女果的果實硬度、風味、酶活性、抗氧化劑（總酚、總黃酮）和總抗氧化能力。針對超聲波技術在柿果實貯藏保鮮中的應用鮮有報道。

本實驗以“陽豐”甜柿為試材，研究超聲波處理后的柿果實在溫度（20±2）℃、相對濕度 85%～90%條件下貯藏0、5、10、15、20 d 時，果實硬度、色差、含水量、可溶性固形物（SSC）、可滴定酸（TA），果膠組成、總鈣離子含量和相關酶活性的變化規律，以期為超聲波技術在采后柿果實保鮮方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜柿 于2019 年10 月24 日采自中國林業科學研究院經濟林研究開發中心原陽試驗基地，品種為“陽豐”，果實呈扁圓形，果面橙紅色，果肉為橙紅色，采收時要求果形端正、著色均勻、大小相對一致、無病蟲害和機械損傷的果實，采收當天運至實驗室進行處理；貯藏盒 175 mm×135 mm×75 mm，北京懋林福祥工貿有限公司；EDTA、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、氯化鈉、酒石酸鉀鈉 均為分析純，天津大茂化學試劑公司；無水甲醇、無水乙醇、丙酮 均為分析純，天津市富宇精細化工公司；3.5-二硝基水楊酸、咔唑均為分析純，天津市光復精細化工研究所；三氯甲烷、濃硝酸 均為分析純，洛陽昊華化學試劑有限公司；濃硫酸 優級純，洛陽昊華化學試劑有限公司；亞硫酸鈉 分析純，天津市科密歐公司；結晶酚 分析純，羅恩試劑；CDTA、D-葡萄糖 分析純，阿拉??；PVPP、溴麝香草酚藍 均為分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司；D-半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸 均為分析純，源葉生物。

JY92-2D 型超聲波儀 寧波新芝生物科技有限公司；HC-3618R 高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；TU1810 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；JP-400B 高速多功能粉碎機 浙江永康市久品工貿有限公司；GY-4 數字型硬度計 浙江樂清市艾德堡儀器有限公司；PAL-1 型便攜式手持折光儀 日本 Atago 公司；SC-80C 型色差計 北京康光光學儀器有限公司；MB23水分分析儀 奧豪斯儀器（常州）有限公司；FE28 型pH 計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；BC / BD-429H 型低溫冰柜 山東青島海爾股份有限公司；MARS6 微波消解儀 美國 CEM 公司；AA240FS 原子吸收儀 美國Varian 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果實處理 將柿果實隨機分成2 組，清水組和超聲組，每組處理果實約24 kg。清水處理條件為浸泡 30 min，（25±2）℃；超聲波處理條件為420 W，30 min，（25±2）℃[18]，處理完的柿果實晾干后，放入貯藏盒中，每盒裝 4 個果實，在溫度（ 20±2）℃、濕度85%～90% 下貯藏，于 0、5、10、15、20 d 時取樣測定，每組每次取10 個果實進行指標的測定。

1.2.2 感官指標的測定

1.2.2.1 果皮顏色的測定 用 SC-80C 全自動色差儀反射模式進行果皮顏色的測量，隨附的標準白板用于校準測量柿果實的表面色差。在柿果實的赤道面附近相對應的位置各取一個點進行測定，取平均值。讀取L*值（亮度）、a*值（紅色/綠色）和b*值（黃色/藍色）的值，總色差（ΔE）[18]表示色度差的大小：ΔE=[（L*?L0*）2+（a*?a0*）2+（b*?b0*）2]1/2（其中L0*、a0*和b0*是第 0 d 對照樣品的值）。

1.2.2.2 腐爛率測定 腐爛率（%）= 腐爛果實個數/果實總個數×100

1.2.2.3 萼片觀察 觀察萼片的果萼片伸展方向、卷曲姿態和重疊度。

1.2.3 硬度的測定 用 GY-4 果實硬度計在柿果實赤道面位置取三個點進行測量，探頭直徑 11.1 mm，將探針垂直指向平面，均勻施加壓力至刻度線，讀取數值。

1.2.4 SSC 含量 的測定 用PAL-1 數顯折光糖度儀測定可溶性固形物含量。

1.2.5 TA 含量的測定 用酸堿滴定法測定可滴定酸的含量[19]。

1.2.6 含水量的測定 用 MB23 水分分析儀測定果實含水量[20]。

1.2.7 細胞壁果膠組分含量的測定 細胞壁果膠多糖組分的提取和分離參考齊秀東等[21]的方法。準確稱取 5 g 液氮冷藏保存的果肉，研磨，加 12 mL 80%乙醇，80 ℃水浴20 min，冷卻后離心，棄上清，用12 mL甲醇和氯仿（1:1）混合液去除蛋白質等有機雜質，離心棄上清，再用 12 mL 80%乙醇和丙酮各洗 2 遍，45 ℃下干燥至恒重，得細胞壁物質。

稱取烘干的細胞壁物質 100 mg，8 mL ddH2O 30 ℃ 恒溫浸提 2 h 后離心得水溶性果膠（WSP），8 mL 50 mmol·L?1CDTA（pH6.5，含 50 mmol·L?1乙酸鈉）浸提 6 h 后離心得離子結合果膠（ISP），8 mL 50 mmol·L?1Na2CO3（含2 mmol·L?1CDTA）4 ℃ 靜置 12 h 后離心得共價結合果膠（CSP）。以半乳糖醛酸為標準，用咔唑比色法測定各果膠組分。

1.2.8 果膠降解酶活性的測定 多聚半乳糖醛酸酶（PG）的提取和測定參考 Ren 等[22]的方法并加以改進。稱取 5 g 柿果實樣品，研磨，加 20 mL 預冷 95%乙醇，冰浴條件下研磨勻漿后，低溫放置 10 min，后離心。傾去上清液，向沉淀物中再加入 10 mL 預冷80% 乙醇，振蕩，低溫靜置 10 min 后離心。再傾去上清液，向沉淀物中再加入 5 mL 預冷提取緩沖液，于 4 ℃ 放置 20 min，離心后收集上清液即為酶提取液。用比色法測定其含量。PG 活性以每分鐘每克果肉在 37 ℃催化半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的質量表示，單位μg/（min·g）。

果膠裂解酶（PL）的提取和測定參考Zhi 等[23]的方法并加以改進。稱取1 g 柿果實樣品，加 5 mL 50 mmol Ttris-HCl 緩沖液（pH 8.5），在4 ℃、10000×g 離心15 min，收集上清液為酶提取液。然后將 1.5 mL 上清液加入到3.5 mL 50 mmol Ttris-HCl 緩沖液（pH8.5）中，37 ℃反應30 min，用分光光度計測量232 nm 處的吸光度。PL 活性被定義為每分鐘作用果膠產生 1 μmol 雙鍵所需的酶量，單位為 U/g。

果膠甲酯酶（PME/PE）的提取參考Ren 等[22]的方法，稱取1 g 柿果實樣品，加6 mL 含 10 g/L PVPP的 8.8% NaCl 溶液，在4 ℃反應 1 h 后，在4 ℃、10000×g 離心 20 min，收集上清液，用氫氧化鈉調節至pH 7.5 即為酶提取液。PE 的測定參考Guo 等[24]的方法并加以改進，取 2 mL 0.5%（w/v）果膠溶液，0.15 mL 0.01% 溴麝香草酚藍，0.7 mL 蒸餾水，0.15 mL酶提取液，混合均勻，在25 °C 下保溫30 min。測定620 nm 處的吸光度。PE 活性被定義為每克果肉每分鐘吸光度值的變化，單位為 ΔOD/（g·min）。

1.2.9 總鈣離子含量的測定 參考 GB 5009.92-2016，用火焰原子吸收光譜法測定柿果實中鈣離子的含量。稱取 0.3 g 柿果實樣品，加入 8 mL 硝酸，與MARS6 微波消解儀中進行微波消解。將消解液轉移至25 mL 容量瓶中，以蒸餾水定容。使用AA240FS原子吸收儀測定總鈣離子含量。

1.3 數據處理

采用Origin 8.5 和SPSS 25 對數據進行統計分析。P<0.05 為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 柿果實的理化指標分析

在貯藏 20 d 內，柿果實沒有發生腐爛的現象，同時果萼片伸展方向為直立、卷曲姿態呈中部捏合狀、不重疊，且在整個貯藏期變化不明顯。不同處理柿果實的理化指標如圖 1 所示。果實硬度是反映果實質地的一個重要指標。由圖 1 A 可知，隨著貯藏天數的增加，柿果實的硬度顯著性降低（P<0.05），說明柿果實在逐漸后熟變軟。但在整個貯藏期間，超聲處理的柿果實硬度都顯著高于對照組（P<0.05），相比對照，貯藏第 15 d 和 20 d，硬度分別提高 3.74 kg/cm2和2.97 kg/cm2。水分是柿子口感的基礎，也是保鮮的關鍵指標[2]。由圖 1 B 可知，貯藏的前 10 d，果實水分含量持續上升，其兩組變化差異較小，其后熟過程中自身的生理生化反應對柿果含水量的影響較大；隨著貯藏時間的延長，兩組之間水分含量開始出現差異，在第 20 d 時，超聲處理組和對照組含水量分別下降到 81.17% 和 80.77%。超聲處理組水分含量仍然高于對照組，說明超聲處理可保持柿果實較高的水分含量。

SSC 的含量對水果的營養價值，風味口感等方面有著重要影響，是呼吸代謝的主要底物。SSC 含量的變化是衡量柿果實品質和耐貯藏性的一個重要指標[25?26]。由圖 1 C 可知，在貯藏期間，超聲處理后的果實 SSC 含量一直呈顯著性增加的趨勢（P<0.05），對照組的 SSC 含量先增加后趨于穩定，說明超聲處理可以保持柿果實較高的 SSC 含量。TA含量會對果實的口味、風味、耐貯藏性等產生影響[27]。TA 含量會隨著細胞呼吸和果實衰老而被逐漸地分解，所以 TA 的含量是衡量柿果實保鮮品質的重要指標。由圖 1 D 可知，隨著貯藏天數的增加，柿果實的 TA 含量逐漸下降，這可能是柿果實中的有機酸在呼吸代謝過程中發生了氧化作用，導致了 TA 含量的下降[27]。兩組對比變化差異不顯著（P>0.05），說明超聲處理對柿果實 TA 含量影響不大。色澤是表征果實品質的重要指標。由圖 1 E 可知，隨著貯藏天數的增加，果實的L*值整體呈降低趨勢，在第 5、10 d和 20 d 時，超聲處理的柿果實L*值都顯著性高于對照組（P<0.05），說明超聲處理對保持柿果皮的亮度有積極影響。由圖 1 F 可知，在貯藏期間，超聲處理后的果實ΔE顯著性降低（P<0.05），且兩組對比變化差異顯著（P<0.05），超聲處理的ΔE從 12.95 下降到9.89，下降了 3.05，對照組的ΔE從 10.97 下降到6.58，下降了 4.39。其中，超聲處理的柿果實ΔE顯著性高于對照組（P<0.05），最大差值為 3.31，說明超聲處理對果實ΔE的降低有抑制作用。

圖1 不同處理柿果實理化指標變化Fig.1 Changes in physical and chemical indexes of persimmon fruits in different treatments

2.2 柿果實果膠含量的變化

果膠是細胞壁的重要組成部分，是反映果實硬度變化的重要相關參數。隨著果實的成熟，果膠物質會逐漸與纖維素分離形成易溶于水的果膠，使細胞壁結構受到破壞，導致果實硬度的下降[1]。由圖 2 A 可知，貯藏的前 15 d，柿果實 WSP 含量顯著性上升（P<0.05），與 0 d 相比，在 15 d 時超聲處理組和對照組分別上升 0.96% 和 0.80%。貯藏 15 d 后 WSP 出現下降的趨勢，與 15 d 相比，在 20 d 時超聲處理組和對照組分別下降 0.67% 和 0.45%。由圖 2 B 可知，在貯藏期間，ISP 的含量在前 5 d 降低，在 5～15 d顯著性上升（P<0.05）。與 5 d 相比，在 15 d 時超聲處理組和對照組分別增加 1.19% 和 1.38%，在 15 d后含量下降，且超聲處理組 ISP 含量顯著性低于對照組（P<0.05）。果膠的不同變化可能是因為果實細胞壁中不同溶解性果膠代謝模式并不是此消彼長的關系。在果實成熟軟化過程中，細胞壁組分（包括果膠）會發生溶解、側鏈斷裂、解聚、去甲酯化、直接降解和溶脹等多種變化，從而影響果實質地變化的模式[28]。由圖 2 C 可知，貯藏期間，對照組的 CSP 含量先降低后顯著性升高（P<0.05），超聲處理組 CSP 含量整體呈先上升后下降的趨勢，且在第 10 d 之后，顯著低于對照組（P<0.05）。在貯藏前期，超聲處理的WSP 含量顯著性高于對照組（P<0.05），這可能是由于超聲處理產生了過強的空化作用，而空化作用產生的機械能促進了柿果實的細胞壁降解，使得貯藏前期，經超聲處理后的果實 WSP 含量高于對照組[1]。

圖2 不同處理柿果實的果膠含量變化Fig.2 Changes in pectin content of persimmon fruits with different treatments

2.3 柿果實果膠降解酶活性的變化

果膠降解酶是指分解果膠物質的多種酶的總稱，主要包括 PG、PE 和 PL 等，這些酶會作用于果實中細胞壁的降解，是研究果實質地軟化的重要指標[29]。圖 3 A 顯示，貯藏前 15 d，對照組柿果實的PG 活力呈顯著上升的趨勢（P<0.05），超聲處理組在第 10 d 時下降，這可能是樣本之間的差異性造成的，與 0 d 相比，在 15 d 時超聲處理組和對照組分別增加 10.48 μg/（min·g）和 9.03 μg/（min·g）。第 20 d 時，處理組比對照組降低 8.79 μg/（min·g）；圖 3 B 顯示，貯藏期間，柿果實的 PE 活力呈先上升后下降的趨勢，兩組變化差異顯著（P<0.05），第 15 d 時，超聲處理組的 PE 活力比對照組降低 3.31 ΔOD/（g·min），這與李江闊等[1]在柿果實采后保鮮中的研究結果一致；圖 3 C 顯示，貯藏期間，超聲處理后柿果實的 PL 活力顯著性低于對照組（P<0.05），第 20 d 時差異最顯著（P<0.05），兩者相差 1.47 U/g。由圖 3 可知，經超聲處理后的柿果實果膠降解酶（PG/PE/PL）的酶活低于對照組，說明超聲處理可以抑制果實中果膠降解酶（PG/PE/PL）的活力，減少柿果實中細胞壁物質（果膠酯酸及果膠酸）的水解，從而減緩柿果實的軟化，延長其貨架期。

圖3 不同處理柿果實果膠降解酶活性變化Fig.3 Changes of pectin degrading enzyme activity in persimmon fruit with different treatments

2.4 柿果實總鈣離子含量的變化

鈣具有維持細胞壁、細胞膜的結構及功能和調節控制離子環境與酶活性等的生理功能，是研究果實保鮮的重要指標[30]。由圖 4 可知，在貯藏期間，柿果實的鈣離子含量呈先上升后下降的趨勢，第 15 d時含量最高，超聲處理組和對照組分別達到了104.14 mg/kg 和93.53 mg/kg。在貯藏期間，兩組果實的鈣含量差異顯著（P<0.05），第 20 d 時，超聲處理后的果實鈣離子含量比對照組增加 22.28 mg/kg。這與 Zhi 等[23]在棗果實中的研究結論一致，說明超聲處理可以抑制柿果實中鈣離子含量的降低?？掠袂宓萚31]指出果實中鈣含量與其采后呼吸強度密切相關，對于躍變型果實，鈣與其呼吸強度呈負相關；鈣還可激活果實內固有抗菌物質活性，從而誘導果實產生抗病性或增強其抗病能力。超聲處理可能通過抑制柿果實鈣含量的降低，從而保持柿果實較高的硬度。

圖4 不同處理柿果實鈣離子含量變化Fig.4 Changes of calcium ion content in persimmon fruits with different treatments

3 結論

本研究采用超聲波技術處理采后柿果實，通過硬度、果膠組分與降解酶活性的分析，探討超聲波技術對柿果實保鮮效果的影響。研究發現，超聲處理后果實的硬度及含水量均顯著高于對照組（P<0.05），15 d時兩組硬度差異最顯著（P<0.05），經超聲處理后的硬度比對照組高 3.74 kg/cm2。超聲處理后可保持果實較高的 SSC 含量，隨著貯藏時間的延長超聲處理后果實的L*值和ΔE值顯著高于對照組（P<0.05），ΔE最大差值為 3.31。20 d 時，三種果膠降解酶（PG/PE/PL）含量顯著低于對照組（P<0.05），超聲處理組 PG、PE 和 PL 的活力分別比對照降低了 8.79 μg/（min·g）、3.31 ΔOD/（g·min）和 1.47 U/g，鈣離子含量提高了 22.28 mg/kg。綜合表明，超聲波技術能夠有效延緩柿果實的軟化，保持果實的最佳品質，延長果實市場供應期，在柿果實的保鮮中具有較好的應用前景。