采后水楊酸處理對金刺梨果實活性氧和苯丙烷代謝的影響

董柏余，湯洪敏，姚秋萍，朱德全，韓洪強，周培富，何可群，丁曉春

（1.貴州民族大學民族醫藥學院，貴州貴陽 550025；2.中國科學院華南植物園，廣東廣州 510650）

金刺梨（Rosa sterilis）又稱無籽刺梨，為貴州省安順市特有物種，在當地已大規模種植[1]。相較于普通刺梨，金刺梨果實中VC含量與超氧化物歧化酶（superoxidedismutase, SOD）活性更高。作為具有高營養價值的新型水果，近年來對于金刺梨的研究也逐漸增多[2?3]。金刺梨鮮果含糖量高，易受病原物的侵染而發生腐爛，常溫條件下不耐貯藏，從而給生產者和經營者帶來巨大的經濟損失[4?5]。目前金刺梨的保鮮方法主要集中于物理保鮮技術，如低溫貯藏[5]、PE 袋包裝貯藏[6]、UV-C 輻射[7]、氣調袋貯藏[8]等。其中低溫保鮮技術雖然效果顯著，但存在成本高、技術設備要求高的缺陷，其他物理保鮮技術雖然成本低，設備要求低但是對于病害的控制效果并不顯著。因此，在物理保鮮技術的基礎上急需開發安全、高效的新型保鮮劑[9?10]。

水楊酸（salicylic acid, SA）又名鄰羥基苯甲酸，能夠誘導果蔬產生系統獲得性抗性，在甜瓜[11]、獼猴桃[12]、蘋果[13]、枸杞[14]、臍橙[15]等果實上均表現出良好的誘抗效果，可顯著降低果實的腐爛率。水楊酸相比于市面上常用的殺菌劑具有殘留危害小、無抗藥性以及環境友好等特點，目前尚未見到采后水楊酸處理對金刺梨誘導抗性的報道。水楊酸處理提高果實采后品質的作用機理與其能夠提高活性氧代謝與苯丙烷代謝關鍵酶活性并激發活性氧與酚類物質的產生密切相關[16?17]。但是，尚未見到采后水楊酸處理對金刺梨誘導抗性的報道。本研究以金刺梨果實為試材，采后用水楊酸溶液浸泡處理，探索其對果實活性氧代謝及苯丙烷代謝的影響，以期為水楊酸處理誘導金刺梨果實產生抗性從而延緩果實衰老提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料 采摘自安順市春歸保健科技有限公司金刺梨基地，選擇九成熟的金刺梨果實（盛花期后105 d），紙箱包裝后當天運回實驗室進行處理；水楊酸 Sigma-Aldrich 公司產品；丙酮、四氯化鈦、β-巰基乙醇、Tris-HCl 生工生物工程（上海）股份有限公司；二硫蘇糖醇、愈創木酚、蛋氨酸、苯甲基磺酰氟 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸、乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、MgCl2·6H2O上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑 均為分析純。

TU-1901 型分光光度計 北京普析; CP70ME日立超速離心機 日本日立；IKA-2900025 冷凍磨樣機 中國艾卡。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與處理 挑選大小一致，成熟度一致的金刺梨果實，用1.5 mmol/L（預實驗篩選獲得）水楊酸溶液（0.05% Tween 80）浸泡10 min，完全晾干后備用。清水處理作為對照組，每個處理3 個生物學重復，每個重復200 個果實。

1.2.2 取樣 分別在處理的 0、2、4、6、8 d，用直徑5 mm 打孔器在果實赤道部位選三個點，取皮下2～4 mm處約2 g 果肉組織。樣品錫箔紙包裝后液氮冷凍，放入?80 ℃冰箱保存待用。每次處理用果實30 個。

1.2.3 腐爛率的測定 以貯藏期間腐爛果實數占果實總數的百分比表示。每組處理用果實100 個，重復3 次。

1.2.4 失重率測定 采用稱量法進行測定，按下列公式計算：

失重率（%）=[（貯藏前質量?貯藏后質量）/貯藏前質量]×100。每組處理用果實10 個，重復3 次。

1.2.5 細胞膜完整性測定 參照Sayyari 等[18]的方法并修改。取赤道部位的皮下1～4 mm 處果肉組織2 g，切成10 片厚約2 mm 左右薄片后用去離子水沖洗3 次，然后用濾紙吸干多余水分，加入裝有20 mL去離子水的離心管中，在 25 ℃下浸泡 3 h 后用電導率儀測定電導率，計為 CI，再在沸水浴中煮沸 30 min，待冷卻至室溫（22 ℃）后再次測定電導率為其最終電導率，記為 CF，最后按照下面的公式計算細胞膜完整性：細胞膜完整性（%）=[1?（CI/ CF）]×100。

1.2.6 O2－·產生速率的測定 參照Xu 等[19]的方法并修改。取2.0 g 果肉組織，加入5 mL 100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8），在冰浴條件下研磨成勻漿后于4 ℃下12000×g 離心20 min。取1 mL 上清液，加入1 mL 50 mmol/L 磷酸緩 沖液（pH 7.8）和1 mL 1 mmol/L 的鹽酸羥胺溶液，搖勻后在25 ℃保溫1 h。取出后加入1 mL 17 mmol/L 對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/Lα-萘胺，于25 ℃保溫20 min 進行顯色反應，測定顯色液在530 nm 處測定吸光度值，以不進行保溫1h 的測定作為參比對照，重復三次。單位以mmol·g?1·min?1表示。

1.2.7 過氧化氫（H2O2）含量測定 參照Prochazkova等[20]的方法并修改。稱取2.0 g 果肉組織用冷凍磨樣機打成粉末后，轉移至預冷的研缽，加入2 mL 冷丙酮，繼續研磨成勻漿。轉移勻漿至15 mL 離心管，4 ℃溫度下，12000×g 離心20 min。取1 mL 上清液轉移至新的2 mL 離心管，加入100 μL 20%的四氯化鈦溶液（溶于濃鹽酸，V/V）和200 μL 濃氨水，充分混勻反應5 min，4 ℃溫度下離心15 min。沉淀用冷丙酮洗滌3 次，加1.5 mL 1 mmol/L H2SO4重懸沉淀，在410 nm 波長下用紫光分光光度計處測定吸光值。H2O2含量以μmol/g 鮮重（FW）表示。

1.2.8 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 參照Lacan 等[21]方法并修改。稱取2.0 g 果肉組織用冷凍磨樣機打成粉末后，轉移至預冷的研缽，加入3 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.5，含5 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）和2% 交聯聚乙烯吡咯烷酮（PVPP，W/V），繼續研磨成勻漿。在4 ℃條件下12000×g離心20 min，棄沉淀保留上清液即為粗酶液。反應體系包含：0.4 mL 的粗酶，1.5 mL 的50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 7.8），0.2 mL 的130 mmol/L 蛋氨酸（MET），0.3 mL 的100 μmol/L EDTA，0.3 mL 的750 μmol/L 硝基藍四唑（NBT）和0.3 mL 的20 μmol/L核黃素。對照組：將裝有混合液的離心管置于暗處。實驗組：將裝有混合液的離心管在光照培養箱中（4000 LUX 日光燈）放置15 min。在560 nm 處測定吸光值，以對照組作為空白參比。NBT 光化還原的50%，作為一個酶活性單位（U/mg protein）。

1.2.9 過氧化氫酶（CAT）活性測定 測定方法參考Wang 等[22]并修改。稱取2.0 g 果肉組織用冷凍磨樣機打成粉末后，轉移至預冷的研缽，加入3 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.5，含5 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）和2% PVPP（W/V）），充分研磨成勻漿。在4 ℃下12000×g 離心20 min，取上清液作為粗酶用于酶活性測定。反應體系包括：2 mL 10 mmol/L H2O2（用50 mmol/L、pH 7.5 的磷酸緩沖液配制）和150 μL 粗酶液。在240 nm 波長下，記錄2 min 內樣品動態吸光值變化。以每分鐘OD 值變化0.01 為1 U，CAT 活性表示為U/mg protein。

1.2.10 過氧化物酶（POD）活性測定 參照Venisse 等[23]并調整。稱取2.0 g 果肉組織用冷凍磨樣機打成粉末后，轉移至預冷的研缽，加入3 mL pH 7.5 的 50 mmol/L 磷 酸 提 取 緩 沖 液（內 含 4%PVPP（W/V），1 mmol/L 聚乙二醇，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF），0.01% Triton X-100（V/V）），迅速充分研磨成勻漿。于4 ℃下，15000×g 離心20 min，轉移上清液至新的離心管，作為粗酶液用于酶活性測定。POD 反應體系為2.5 mL 0.025 mol/L 愈創木酚、0.2 mL 0.25 mol/L H2O2和0.2 mL 粗酶液。加酶液后，于470 nm 波長系下記錄2 min 內反應體系中吸光值變化。以每分鐘OD 值變化0.01 為1 U，POD 活性表示為U/mg protein。

1.2.11 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定 參照Assis 等[24]方法并作修改。取2.0 g 果肉組織，用液氮磨碎，在研缽中加入5 mL 經4 ℃預冷的0.1 mol/L pH 8.8 的硼酸緩沖液（含1 mmol/L EDTA，10%（w/v）PVPP 和50 mmol/Lβ-巰基乙醇）繼續在冰浴下研磨成勻漿，然在4 ℃條件下，12000×g 離心20 min，取上清液作為粗酶液,并用于酶活性測定。將1 mL 粗酶與3 mL 1-苯丙氨酸在37 ℃下孵育60 min。在290 nm 處測定吸光值。活性表示為U/mg protein，其中U = 0.01ΔOD290min?1。

1.2.12 4-香豆酰-輔酶A 連接酶（4CL）活性測定參考范存斐等[25]方法并修改。稱取2.0 g 果肉組織用冷凍磨樣機打成粉末后，轉移至預冷的研缽，加入3 mL 0.2 mol/L Tris-HCL 緩沖液（25%甘油、0.1 mol/L DTT、pH 8.0）及少量石英砂。在4 ℃溫度下，15000×g，離心30 min，取上清液至新的離心管中作為粗酶備用。反應液包括：0.45 mL15 μmol/L MgCl2·6H2O，0.15 mL 5 μmol/mL p-香豆酸，0.15 mL 50 μmol/mL ATP，0.15 mL 1 μmol/mL CoA 以及0.5 mL酶液。混合液在40 ℃水浴鍋中，反應10 min。紫外分光光度計在333 nm 處測定樣品吸光值，1 min內OD333變化0.1 作為1 個活性單位（U）。活性表示為U/mg protein。

1.2.13 總酚含量測定 參考范存斐等[25]并修改。稱取2.0 g 果肉組織用冷凍磨樣機打成粉末后，轉移至預冷的研缽，加入5 mL 1% HCl–甲醇后，充分研磨。12000×g 離心30 min，棄沉淀保留上清液。在280 nm 測定吸光值。總酚含量表示為OD280·g FW?1。

1.2.14 木質素含量的測定 參照范存斐等[25]方法。稱取2.0 g 果肉組織用冷凍磨樣機打成粉末后，轉移至預冷的研缽，研缽中加入5 mL 預冷的95%乙醇，充分研磨。12000×g 離心30 min。保留沉淀，先用95%乙醇沖洗3 次，再用乙醇:正己烷=1:2（V/V）沖洗3 次。收集沉淀在60 ℃烘箱中使其充分干燥，用1 mL 25%溴化乙酰冰醋酸溶液重懸沉淀，70 ℃恒溫水浴30 min，然后加1 mL 2 mol/L NaOH 中止反應。再加2 mL 冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L 羥胺鹽酸，離心。取0.02 mL 上清液，用冰醋酸定容至5 mL。紫外分光光度計在280 nm 波長下，測定樣品吸光值。木質素含量以OD280·g FW?1表示。

1.3 數據處理

各項指標結果均以“平均數±標準誤（SE）”表示，用 SPSS 16.0 軟件進行 Duncan’s 多重差異顯著性分析，*表示P<0.05。用 Microsoft Excel 2010 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 水楊酸處理對金刺梨果實腐爛率和失重率的影響

由圖1 可知，從貯藏6 d 開始，對照組與水楊酸處理果實出現腐爛。貯藏8 d 時，對照組腐爛率為7.6%，水楊酸處理組腐爛率為4.0%并顯著（P<0.05）低于對照組（圖1A）。由此可見，1.5 mmol/L 水楊酸處理能夠有效抑制采后常溫貯藏期間金刺梨果實腐爛的發生。水楊酸處理組與對照組果實失重率均呈現逐漸升高的趨勢。但是，在整個貯藏期間水楊酸處理組果實的失重率始終低于對照組，并且在4、8 d兩個時間點顯著低于對照組（圖1B）。水分蒸騰是導致果蔬采后失重的重要原因，結果表明，水楊酸處理能夠減緩采后金刺梨果實的水分損失。

圖1 水楊酸處理對金刺梨果實腐爛率（a）和失重率（b）的影響Fig.1 Effects of salicylic acid treatment on the decay rate（a）and weight loss rate（b）in Rosa sterilis

2.2 水楊酸處理對金刺梨果實細胞膜完整性的影響

水楊酸處理組和對照組細胞膜完整性隨貯藏時間延長均出現呈緩慢下降的趨勢，但與對照組相比，水楊酸處理能有效保持果實細胞膜的完整性。在貯藏4、6、8 d 三個時間點，水楊酸處理果實的細胞膜完整性顯著（P<0.05）高于對照果實（圖2）。由此可見，水楊酸處理能夠較好的保持金刺梨果實的細胞膜完整性。細胞膜起到維持果肉細胞內外滲透壓平衡的作用，細胞膜完整性的提高可以延緩果實的采后衰老進程。

圖2 水楊酸處理對金刺梨果實細胞膜完整性的影響Fig.2 Effects of salicylic acid treatment on the cell membrane integrity in Rosa sterilis

2.3 水楊酸處理對金刺梨果實O2－·產生速率和H2O2含量的影響

由圖3A 可知，水楊酸處理果實中 O2?·產生速率在貯藏開始階段迅速升高，并在4 d 達到最大值，顯著（P<0.05）高于對照組48.2%，隨后緩慢下降。整個貯藏期間，水楊酸處理組 O2?·產生速率始終高于對照組（圖3A）。在貯藏過程中，處理和對照果實中H2O2含量均呈現出在前6 d 升高隨后下降的趨勢，但水楊酸處理提高了果實H2O2含量，在貯藏6 d 時達到最大值并顯著（P<0.05）高于對照，高出對照23.5%。整個貯藏期水楊酸處理組H2O2含量始終高于對照組（圖3B）。誘導ROS 產生是果蔬增強其本身抗病能力的機制之一，其中 O2?·和H2O2是ROS 的典型代表，結果顯示，水楊酸處理能夠促進金刺梨果實O2?·和H2O2貯藏期間的積累，并且與對照組相比，水楊酸處理促進了 O2?·產生速率峰值的提前出現。

圖3 水楊酸處理對金刺梨果實O2?·產生速率（A）和H2O2 含量（B）的影響Fig.3 Effects of salicylic acid treatment on the O2?· production rate（A）and H2O2 content（B）in Rosa sterilis

2.4 水楊酸處理對金刺梨果實SOD 和CAT 活性的影響

SOD 與CAT 是活性氧代謝的關鍵酶，SOD 可以直接將不穩定的O2?·分解成為更穩定的H2O2，而CAT 能夠將H2O2分解為H2O 和O2。在整個貯藏過程中，水楊酸處理果實SOD 活性逐漸升高，而對照組SOD 活性在前2 d 先下降隨后緩慢上升。水楊酸處理果實SOD 活性在第2、4、8 d 顯著（P<0.05）高于對照，分別高出對照組10.9%，15.5%和17%（圖4A）。對照組CAT 活性在整個貯藏期間變化不明顯，處理組CAT 活性總體呈先升高后下降趨勢，在貯藏第6 d達到最大，高出對照119%（圖4B）。由此可知，水楊酸處理促進了金刺梨果實常溫貯藏期間SOD 與CAT 活性的升高。

圖4 水楊酸處理對金刺梨果實SOD（a）和CAT（b）活性的影響Fig.4 Effects of salicylic acid treatment on the activity of SOD（a）and CAT（b）in Rosa sterilis

2.5 水楊酸處理對金刺梨果實 POD 活性的影響

POD 廣泛存在于植物中，在果實體內主要參與活性氧的清除、木質素的合成等過程。在整個貯藏期間水楊酸處理和對照果實 POD 活性都呈先上升后下降的趨勢，但水楊酸處理果實 POD 活性始終高于對照，并在貯藏第4、6、8 d 三個時間點顯著（P<0.05）高于對照，分別高出對照23.7%，35.3%和35.0%（圖5）。從上述結果得知，水楊酸處理促進了金刺梨果實常溫貯藏期間POD 活性的升高。

圖5 水楊酸處理對金刺梨果實POD 活性的影響Fig.5 Effects of salicylic acid treatment on the activity of POD in Rosa sterilis

2.6 水楊酸處理對金刺梨果實 PAL 和4CL 活性的影響

PAL 是苯丙烷途徑的限速酶，其活性的高低與酚類、黃酮類和木質素合成密切相關。在整個貯藏期間，處理組果實PAL 活性始終高于對照組，水楊酸處理果實 PAL 呈現先升高后降低的趨勢，在貯藏第4 d 達到最大，高出對照 64.2%，而對照果實PAL 活性變化不大（圖6A）。4CL 可催化各種羥基肉桂酸生成相應的硫酯，從而形成木質素合成所必須的中間產物香豆酸、阿魏酸以及咖啡酸。水楊酸處理后，金刺梨果實4CL 活性迅速升高，并在第4 d 達到最大，高出對照50.9%，而對照組果實4CL 活性在整個貯藏期間變化不明顯（圖6B）。由此可知，水楊酸處理提高了金刺梨果實常溫貯藏期間苯丙烷代謝途徑中關鍵酶PAL 與4CL 的活性。

圖6 水楊酸處理對金刺梨果實PAL（A）和4CL（B）活性的影響Fig.6 Effects of salicylic acid treatment on the activity of PAL（A）and 4CL（B）in Rosa sterilis

2.7 水楊酸處理對金刺梨果實總酚和木質素含量的影響

水楊酸處理明顯提高了金刺梨果實的總酚含量，在貯藏過程中，處理組總酚含量呈現先升高后下降的趨勢，在貯藏第6 d 時達到最大，高出對照41.0%，而對照組總酚含量在整個貯藏期間緩慢下降（圖7A）。木質素含量的變化趨勢與總酚變化基本一致，水楊酸處理明顯提高了木質素含量，并在6 d 達到最大，高出對照 31.1%（圖7B）。由此可見，水楊酸處理能夠提高采后金刺梨果實實驗貯藏中后期酚類物質與木質素的含量。

圖7 水楊酸處理對金刺梨果實總酚（A）和木質素（B）含量的影響Fig.7 Effects of salicylic acid treatment on the content of total phenolic compounds（A）and lignin（B）in Rosa sterilis

3 討論

水楊酸作為一種重要的植物誘抗劑，可誘導植物產生系統獲得性抗性，增強植物的廣譜抗性[26]。采后水楊酸處理可以通過提高相應防御酶活性來增強果實抗病性、延緩果實衰老。本研究發現，1.5 mmol/L水楊酸采后處理不僅可以降低貯藏期間金刺梨果實的腐爛率，還可以減輕果實失重率以及保持細胞膜完整性，從而延緩采后金刺梨果實品質下降。這與采后水楊酸處理在芒果[27]、枸杞[14]、哈密瓜[11]等果實上的研究結果相似。

植物體受到外界環境脅迫后，會在短時間內產生大量ROS[28]。低水平的ROS 充當誘導防御基因表達的信號分子，并參與細胞壁的交聯和木質化以抵抗真菌感染[29?30]。本研究發現，水楊酸處理能夠提高采后金刺梨H2O2含量，這有可能與果實中SOD 活性的提升相關。該結果與水楊酸處理誘導“玉金香”厚皮甜瓜H2O2含量升高的結果類似[31]。但是，過量的ROS 則會對細胞本身造成破壞[29]。由SOD、CAT、POD 等活性氧代謝關鍵酶組成ROS 清除系統，能夠及時清除植物細胞中過量的ROS[32?33]。本實驗結果表明，水楊酸能顯著提升采后金刺梨果實中SOD、CAT 和POD 活性。在對梨[34]、厚皮甜瓜[31]、樹莓[35]、棗[36]以及番茄[37]的研究中也得到了類似結果。這說明水楊酸提高金刺梨果實抗性，延緩果實衰老與其調節活性氧代謝有關。

苯丙烷代謝是植物的次級代謝，植物中許多主要的抗菌物質均由苯丙烷代謝直接或間接的生成，如酚類化合物、木質素等[38]。PAL 和4CL 是苯丙烷代謝中的兩個重要的限速酶，PAL 已被證實為植物體內最主要的抗性酶之一，其活性的強弱與酚類和木質素等抗菌物質密切相關[39]。而4CL 的作用是調控苯丙烷代謝主途徑向木質素合成途徑與花青素合成途徑進行轉折[40]。本實驗表明，水楊酸能顯著提升金刺梨果實中PAL 和4CL 的活性。這就說明，采后水楊酸處理可激活金刺梨果實苯丙烷代謝途徑中關鍵酶活性，進而增強金刺梨果實的采后抗病性。在對葡萄[41]、柑橘[42]果實的研究中也得到了類似的結果。酚類和木質素是苯丙烷代謝的末端產物，具有一定的抗菌作用，酚類化合物在多酚氧化酶作用下可氧化成毒性更強的醌類物質，能有效抑制病原物的擴展。此外，酚類物質也是木質素合成的前體物[43?45]。果實中木質素大量沉積，能夠導致細胞壁木質化，從而有效抵抗病原物的侵染[38]。本實驗結果表明，采后水楊酸處理促進了金刺梨果實中總酚與木質素的積累。在水楊酸處理柑橘[42]、葡萄[41]與煙草[46]的研究中也得到了類似的結果。

4 結論

采后1.5 mmol/L 水楊酸處理抑制金刺梨果實衰老過程中失重率、腐爛率和電導率的升高。水楊酸處理激活金刺梨果實中活性氧代謝，增強了SOD，CAT 和POD 抗氧化酶活性。另外，水楊酸處理提高了果實中與苯丙烷代謝關鍵酶PAL 與4CL 的活性，促進了總酚和木質素的積累。綜上所述，采后水楊酸處理可以延緩金刺梨果實衰老從而提高果實品質。但由于本研究僅僅是在短期室溫條件下通過水楊酸浸泡處理對金刺梨果實活性氧以及苯丙烷代謝中部分酶的變化進行了研究，未來可以對活性氧代謝、苯丙烷代謝進行更深入的研究，另外還可以從呼吸代謝、能量代謝方面開展研究，以便更全面地揭示水楊酸處理對金刺梨果實衰老的影響。