連翹葉提取物對熱應(yīng)激大鼠的保護(hù)作用

王玲芝，唐建開，王舒恒，靳 翔，張立偉

（1.山西大學(xué)，分子科學(xué)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030006；2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西太原 030006）

隨著全球變暖，暑熱季節(jié)延長、高溫環(huán)境作為一種應(yīng)激源會引起機(jī)體的熱應(yīng)激反應(yīng)[1]。熱應(yīng)激是指機(jī)體在高溫、高濕環(huán)境下機(jī)體的一種防御性自我保護(hù)機(jī)制，當(dāng)環(huán)境溫度超過機(jī)體所能適應(yīng)范圍時，機(jī)體必須通過調(diào)節(jié)自身代謝率等途徑來減少產(chǎn)熱，以適應(yīng)高溫環(huán)境，但當(dāng)熱應(yīng)激超出機(jī)體自我調(diào)節(jié)范圍時，則會導(dǎo)致機(jī)體生理功能出現(xiàn)紊亂[2]。

熱應(yīng)激會影響機(jī)體器官功能，加快全身性炎癥反應(yīng)和急性反應(yīng)的發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可使血清CORT 和ACTH 水平增加，并導(dǎo)致小腸及肝組織受損[4?6]。Erfani 等[7]研究表明熱應(yīng)激可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥而對腦結(jié)構(gòu)和突觸密度產(chǎn)生有害影響，從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元受損造成認(rèn)知障礙。急性熱應(yīng)激還會抑制機(jī)體的免疫功能，影響機(jī)體免疫細(xì)胞的活性等[8]。人類長期處于高溫環(huán)境下可引起熱休克、呼吸急促以及心衰等疾病的發(fā)生[9]。目前，熱應(yīng)激反應(yīng)是在高溫環(huán)境中工作的軍隊(duì)、體育運(yùn)動員和工人等面臨的主要問題之一，其給人類的活動發(fā)展帶來了嚴(yán)重危害，因此，合理開發(fā)中草藥糾正或緩解全身熱應(yīng)激反應(yīng)，降低熱應(yīng)激對機(jī)體產(chǎn)生的不良作用具有重要的意義。

中草藥源于自然界，具有資源豐富、功效多、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。目前，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道諸多中草藥如菊花、魚腥草、金銀花、紅參等被廣泛應(yīng)用于熱應(yīng)激緩解的研究，并表現(xiàn)出良好的抗熱應(yīng)激效果[10?13]。連翹葉為木犀科植物連翹[Forsythia suspense（Thunb.）Vahl]的干燥葉，其所含化學(xué)成分與連翹相同[14]。《中華本草》中記載“連翹莖葉，味苦，性寒”，具有疏風(fēng)散熱、清熱解毒之功效[15]。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明連翹葉提取物具有良好的保肝[16]、抗氧化[17]、抗炎[18]、增強(qiáng)免疫及抗應(yīng)激[19]等藥理作用。在我國民間，人們有將連翹葉作為保健茶飲長期飲用的習(xí)慣，以此達(dá)到降溫、消暑、解渴的目的。隨著研究的不斷深入，近年來連翹葉已被開發(fā)為山西省地方特色資源食品原料[20]，并陸續(xù)開發(fā)出連翹葉紅茶、綠茶等代用茶。目前，已有研究報(bào)道連翹提取物具有一定的抗熱應(yīng)激效果[21]，關(guān)于連翹葉抗熱應(yīng)激作用的研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建大鼠高溫?zé)釕?yīng)激模型，研究連翹葉提取物對大鼠抗熱應(yīng)激能力的影響，探索連翹葉提取物在熱應(yīng)激環(huán)境下對機(jī)體的保護(hù)作用，以期進(jìn)一步完善人們對連翹葉功效的認(rèn)識，并為連翹葉在食品領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD 雄性大鼠（6～8 周齡） 30 只，SPF 級，體重180～200 g 北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物許可號為SCXK-（京）2016-0002。按動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)在山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動物房飼養(yǎng)，光照周期為12 h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為室溫 24±1 ℃，相對濕度為50%±10%，實(shí)驗(yàn)期間自由采食和飲水；連翹葉采摘于山西省陵川縣野生連翹基地，于通風(fēng)條件下自然晾干；促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)酮（CORT）檢測試劑盒 南京建成生物工程有限公司；D101 大孔樹脂 安豫皖樹化工銷售有限公司；對照品連翹酯苷A 純度> 98%，成都曼斯特生物科技有限公司。

人工智能氣候箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī) 金壇市水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠；Spectra Max 190 酶標(biāo)儀 美國molecular devices 公司；一次性96 孔板 耐思生物科技有限公司；OHAUS CP114 電子天平 美國奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 連翹葉提取物的制備 稱取干燥連翹葉1.4 kg，置于5 L 圓底燒瓶中，分別以10、8 倍量的40%乙醇回流提取兩次，每次回流1.5 h，回流結(jié)束過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至適當(dāng)體積后，過D101 大孔樹脂，依次用水、20%、40%和60%乙醇洗脫，洗脫過程中，通過中壓制備色譜在線監(jiān)測功能監(jiān)測不同洗脫溶劑出峰情況，并結(jié)合流出樣品的顏色來收集洗脫餾分。隨后，將收集的各洗脫餾分進(jìn)行減壓濃縮，并將其置于表面皿中，經(jīng)?20 ℃凍存過夜后，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中凍干，并置于干燥器中保存?zhèn)溆谩２捎梦墨I(xiàn)[22]中報(bào)道的色譜條件對各洗脫部位的樣品進(jìn)行HPLC 分析。

1.2.2 動物分組及處理 將30 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為五組。用飲用水溶解連翹葉提取物，連翹葉提取物高、中、低劑量組分別按照116、58、29 mg/kg·d 的劑量灌胃給藥，空白組和模型組給予等量的飲用水。

各組大鼠以單劑量連續(xù)灌胃給藥7 d 后，從第8 d開始進(jìn)行熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。每天（11:00～13:00）將連翹葉提取物高、中、低劑量組和熱應(yīng)激模型組大鼠置于42 ℃、相對濕度為60%的人工智能氣候箱中熱應(yīng)激兩小時，熱應(yīng)激期間可自由采食和飲水，2 h 后將大鼠取出，放回動物房中正常飼養(yǎng)。連續(xù)熱應(yīng)激7 d，給藥組保持給藥，空白對照組給予等劑量的水。

1.2.3 樣品采集和處理 在第14 d 應(yīng)激結(jié)束，所有大鼠經(jīng)麻醉后進(jìn)行腹主動脈取血，并以3500 r/min離心10 min，取上層血清，分裝到1.5 mL 的EP 管中，置于?80 ℃凍存?zhèn)溆谩２裳Y(jié)束后取出肝臟、胸腺和脾臟等組織。取一部分回腸組織、肝組織浸泡在10%甲醛溶液中，充分固定后用于組織病理學(xué)觀察。其余組織稱重后迅速置于液氮冷凍，然后轉(zhuǎn)至?80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.4 指標(biāo)測定

1.2.4.1 大鼠行為學(xué)觀察 熱應(yīng)激過程中觀察各組大鼠的活動狀況、毛色光澤、飲水量等以評估大鼠是否處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

1.2.4.2 生長性能指標(biāo)的測定 按時記錄大鼠體重以及采食情況，分別計(jì)算各組的平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比。料重比(F/G) =平均日采食量 (g) /平均日增重 (g)

1.2.4.3 免疫器官指數(shù)的測定 取大鼠的胸腺和脾臟，用濾紙吸去血漬，去除周圍組織和脂肪等，稱其濕重。按照公式計(jì)算各組大鼠免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（mg/g）=免疫器官重量（（mg）/大鼠熱應(yīng)激后體重（g）

1.2.4.4 血清CORT 和ACTH 含量的測定 取冷凍保存的血清樣本，逐級復(fù)融至室溫融解，按照試劑盒說明書操作步驟，使用酶標(biāo)儀測定大鼠血清中CORT、ACTH 的含量。

1.2.4.5 回腸和肝臟組織病理學(xué)觀察 分別取空腸和肝臟右葉同一組織部位經(jīng)10%甲醛固定24 h 以上，然后將固定組織經(jīng)過脫水、二甲苯透明、包埋、切片、貼片及干燥后制作成組織切片，組織切片經(jīng)過脫蠟、水化、蘇木精-伊紅（HE）染色、脫水、透明封固后，在光學(xué)顯微鏡下分別觀察空腸和肝臟組織病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并采用GraphPad Prism Version 5.0 軟件繪圖。通過單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹葉提取物的制備分析

各洗脫部位色譜圖如圖1 所示，從圖1 中可以看出40%乙醇洗脫部位中含有以連翹酯苷A 為主的總苯乙醇苷類物質(zhì)，采用液相色譜條件：流動相為甲醇（A）-0.3%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min：

圖1 連翹酯苷A 標(biāo)準(zhǔn)品及不同洗脫部位的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of forsythiaside A standard and different elution parts

38%～40%A；6～21 min：40%～48%A；21～37 min：48%～64%A）。進(jìn)樣量10 μL，流速為0.8 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃；通過HPLC 法測得40%乙醇洗脫部位中連翹酯苷A 的含量為55%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道連翹酯苷A 在抗炎[23]、保肝[24]、提高免疫功能[25]等方面具有較良好的藥理作用。因此，實(shí)驗(yàn)選用含有大量總苯乙醇苷物質(zhì)的40%洗脫部位的樣品進(jìn)行熱應(yīng)激研究。

2.2 大鼠的行為學(xué)變化

在熱應(yīng)激處理初期，大鼠煩躁不安、活動量增加、四處竄動，甚至大鼠會有逃出飼養(yǎng)籠的行為；隨著熱應(yīng)激時間的延長，大鼠變得安靜，飲水增加，呼吸加快，毛發(fā)雜亂、爪底濕潤。行為學(xué)觀察結(jié)果表明大鼠處于熱應(yīng)激狀態(tài)，該結(jié)果與文獻(xiàn)[26]報(bào)道結(jié)果一致，表明熱應(yīng)激模型復(fù)制成功。此外，高劑量組與模型組相比，行為學(xué)略有改善。

2.3 連翹葉提取物對熱應(yīng)激大鼠生長性能的影響

由表1 可知，與空白組相比，模型組采食量和日增重降低，料重比增加，飼料轉(zhuǎn)化率降低。給藥組較模型組的平均日采食量和平均日增重均有提高趨勢，但給藥組與模型組相比差異不顯著（P>0.05）。

表1 連翹葉提取物對大鼠生長性能的影響（n=6）Table 1 Effect of Forsythia suspensa leaf extracts on growth performance in rats（n=6）

2.4 連翹葉提取物對熱應(yīng)激大鼠免疫器官指數(shù)的影響

從圖2 中可以看出，與空白組相比，模型組大鼠的免疫器官指數(shù)顯著（P<0.05）降低，說明高溫應(yīng)激后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到影響，大鼠免疫器官受損。而連翹葉提取物高劑量組與模型組相比可明顯提高脾臟指數(shù)，中、低劑量組對脾臟指數(shù)提高效果不明顯。此外，各劑量組均可顯著增加大鼠胸腺指數(shù)（P<0.05)，其中，以高劑量組效果更佳（P<0.01)。研究結(jié)果提示，高劑量的連翹葉提取物能有效緩解熱應(yīng)激所造成的大鼠免疫器官損傷。

圖2 連翹葉提取物對大鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig.2 Effect of Forsythia suspensa leaf extracts on immune organ index in rats

2.5 連翹葉提取物對血清CORT 和ACTH 含量的影響

熱應(yīng)激模型組大鼠血清中CORT 和ATCH 水平均顯著（P<0.05)高于空白組（如圖3），說明大鼠受到熱應(yīng)激時，為了適應(yīng)熱應(yīng)激狀態(tài)，會引發(fā)體內(nèi)大量的皮質(zhì)酮合成，最終導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)分泌失調(diào)。而給予高劑量的連翹葉提取物，血清CORT 和ATCH 的激素水平會顯著降低（P<0.05)。該結(jié)果說明高劑量的連翹葉提取物能有效降低熱應(yīng)激所導(dǎo)致的CORT 和ATCH 水平的升高，并使其趨于正常水平。

圖3 連翹葉提取物對大鼠血清CORT、ACTH 水平的影響（n=6）Fig.3 Effect of Forsythia suspensa leaf extracts on the level of CORT and ACTH in serum of rats（n=6）

2.6 回腸和肝臟組織病理學(xué)觀察

2.6.1 連翹葉提取物對熱應(yīng)激大鼠空腸組織學(xué)形態(tài)的影響 各組大鼠回腸組織切片如圖4 所示，從圖4可以看出，正常組大鼠的回腸絨毛完整且排列整齊。連續(xù)高溫的熱應(yīng)激導(dǎo)致模型組大鼠的回腸絨毛出現(xiàn)嚴(yán)重變性，腸絨毛之間排列散亂，部分腸絨毛出現(xiàn)變短、變粗，甚至有斷裂或脫落現(xiàn)象。與模型組相比，高劑量組的大鼠腸絨毛排列較為整齊，僅少量腸絨毛發(fā)生斷裂，說明高劑量的連翹葉提取物可改善大鼠腸絨毛斷裂的現(xiàn)象，提高腸絨毛結(jié)構(gòu)的完整度。中、低劑量組大鼠的部分腸絨毛雖仍有斷裂現(xiàn)象，但是腸絨毛完整度較模型組有明顯的改善。結(jié)果表明，連翹葉提取物能在一定程度上緩解熱應(yīng)激所導(dǎo)致大鼠空腸組織損傷，其中以高劑量組效果最好。

圖4 回腸組織病理學(xué)形態(tài)（100×）Fig.4 Pathological observation of ileum tissue（100×）

2.6.2 連翹葉提取物對熱應(yīng)激大鼠肝臟組織學(xué)形態(tài)的影響 如圖5 所示，空白組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈多邊形，并以中央門靜脈為中心呈放射狀整齊排列，細(xì)胞核大而圓，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)完好且排列緊密。模型組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肝索排列不規(guī)律，肝組織局部區(qū)域出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。低、中劑量組肝組織匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)出現(xiàn)程度不等的炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，但與模型組相比，肝細(xì)胞病變減少，說明低、中劑量對肝損傷的改善效果不明顯。高劑量組肝組織核仁明顯，肝索排列較為整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，中央靜脈周圍炎性細(xì)胞數(shù)量較少，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，說明高劑量連翹葉提取物能減輕熱應(yīng)激所導(dǎo)致的臟組織損傷。

圖5 肝組織病理學(xué)形態(tài)（200×）Fig.5 Pathological observation of liver tissue（200×）

3 討論

熱應(yīng)激模型組大鼠的料重比降低，可能是由于大鼠的內(nèi)分泌活動受高溫環(huán)境的影響，從而導(dǎo)致機(jī)體脂肪及蛋白質(zhì)等的合成量減少[27]。胸腺和脾臟作為機(jī)體重要的免疫器官，同時參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，免疫器官指數(shù)的高低可在一定程度上反映機(jī)體免疫水平的強(qiáng)弱[28]。熱應(yīng)激發(fā)生時免疫器官指數(shù)降低，說明熱應(yīng)激發(fā)生時會對機(jī)體免疫功能有產(chǎn)生抑制作用。張?jiān)粕降萚29]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激會導(dǎo)致免疫器官發(fā)生萎縮，免疫器官指數(shù)降低，本文研究結(jié)果與該文獻(xiàn)報(bào)道一致。通過給予連翹葉提取物免疫器官指數(shù)有不同程度的上升，說明連翹葉提取物對熱應(yīng)激大鼠造成的免疫器官損傷具有一定的保護(hù)作用，這可能與連翹葉提取物含有大量的苯乙醇苷類成分有關(guān)。據(jù)報(bào)道連翹酯苷A 等苯乙醇苷類成分具有改善機(jī)體免疫功能[30]，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)免疫器官發(fā)育等作用[25,31]。

HPA 軸對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的作用，其能控制機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)[32]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)時，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)的HPA 軸被激活，釋放大量ACTH、CORT 參與調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)，以提高機(jī)體耐受力和適應(yīng)性，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，CORT 和ATCH 常被用于衡量機(jī)體是否出現(xiàn)熱應(yīng)激的一項(xiàng)重要指標(biāo)[33]。連翹葉提取物能夠使熱應(yīng)激大鼠體內(nèi)ACTH 和CORT 的分泌減少，進(jìn)而通過負(fù)反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)HPA 軸，使其亢奮性降低，最終起到了緩解熱應(yīng)激的效果。

此外，熱應(yīng)激可通過多種途徑損傷腸道細(xì)胞或使細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而破壞小腸結(jié)構(gòu)的完整性[34]。當(dāng)大鼠長期處于熱應(yīng)激狀態(tài)得不到改善時，會引起回腸組織受損，腸道黏膜的完整性遭到破壞，影響機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，最終導(dǎo)致機(jī)體健康水平降低、生長發(fā)育遲緩、體重下降，體弱者易感染疾病出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。連翹葉提取物可能夠改善熱應(yīng)激所導(dǎo)致的大鼠小腸組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)的完整性，對熱應(yīng)激引起的小腸組織受損具有良好的保護(hù)作用。此外，當(dāng)大鼠長期處于高溫環(huán)境下，肝組織會受到嚴(yán)重的損傷，長期以往會影響肝臟的正常功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連翹葉提取物能在一定程度上改善熱應(yīng)激引起的肝組織病變，這與總苯乙醇苷類物質(zhì)具有良好的保肝作用有關(guān)[35]。

4 結(jié)論

連翹葉提取物可有效地抑制熱應(yīng)激所引起的CORT 和ACTH 水平增加，改善大鼠小腸和肝組織損傷，表明連翹葉提取物可緩解熱應(yīng)激所造成的機(jī)體損傷，這可能與連翹葉提取物中含有具抗炎、抗氧化能力的苯乙醇苷類化合物有關(guān)。該研究為開發(fā)連翹葉相關(guān)食品用于緩解熱應(yīng)激不良反應(yīng)提供了一定的參考依據(jù)。當(dāng)然，未來還需要在熱應(yīng)激動物模型中對連翹葉提取物的作用機(jī)理做進(jìn)一步研究。