毛水蘇多糖對糖尿病小鼠腎臟的保護作用

孫宏萊，劉 悅，劉德江，李麗麗，N.V.扎依湄科，申 健,*

（1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.中-烏農(nóng)林技術(shù)開發(fā)與應用國際合作聯(lián)合實驗室，黑龍江佳木斯 154007；3.烏克蘭國家科學院M.M.格里什科國家植物園，烏克蘭基輔 01014）

隨著全球經(jīng)濟水平的不斷提高，人們的生活習慣、膳食方面發(fā)生了巨大的改變，紛至沓來的是糖尿病等多種慢性疾病發(fā)生率的不斷上升，極大地影響了人們的日常生活，危害了身體的健康[1]。糖尿病是一種由胰島素分泌量降低，生物作用受到損傷所導致的代謝性疾病。Ⅱ型糖尿病患者不可能被徹底治愈，生活中，飲食的控制、身體鍛煉的加強、防止相關并發(fā)癥的發(fā)生與惡化是控制這類病人的病情發(fā)展的基本方式[2]。而蛋白尿、血尿等正是糖尿病并發(fā)癥的一種主要臨床特征，其發(fā)病機制與糖代謝紊亂、血脂異常和細胞因子表達異常等多種因素密切相關[3]。近年來研究表明，腎小球細胞炎癥因子的過度表達會導致腎小球血管及濾過膜通透性增加，進而導致尿蛋白滲出增加，加劇糖尿病病理進展[4]。因此對于糖尿病患者腎臟的保護也成為了輔助治療手段的一種。

目前，臨床上使用的一些降糖類藥物雖然能改善Ⅱ型糖尿病患者的健康狀況，但都會產(chǎn)生低血糖、胃腸道疾病及心腦血管疾病等不同的不良反應及毒副作用[5?6]。因此，天然的降糖活性物質(zhì)的研究開發(fā)及生產(chǎn)問題成為了主要研究熱點之一。查閱大量文獻可知，從植物中提取出的多糖具有良好的降糖作用，這與加強機體抗氧化活性、降低脂質(zhì)過氧化損傷存在著密切的關系，如黨參多糖、黃芪多糖等[7?8]。因此，從植物中提取天然多糖并研究開發(fā)出無不良反應或毒副作用小的降糖類藥物已經(jīng)成為了主要的發(fā)展趨勢。

毛水蘇（Stachys baicalensisFisch. ex Benth.）是唇形科水蘇屬多年生草本植物，喜歡生長于濕潤、微酸的肥沃土壤，原產(chǎn)于巴爾干半島、黑海沿岸至西亞，主要分布于我國東北三省、內(nèi)蒙、山東、陜西等濕地地區(qū)，具有祛風解毒，止血之功效，可全株入藥，但目前針對其多糖等藥理活性成分的研究未見詳細報道[9?10]。本實驗采用STZ 低劑量腹腔注射結(jié)合喂養(yǎng)高脂高糖飼料創(chuàng)建Ⅱ型糖尿病小鼠模型。通過研究毛水蘇多糖（polysaccharides fromStachys baicalensis,SBP）對糖尿病小鼠的生活狀態(tài)、體重、血糖、腎臟指數(shù)與腎臟功能的影響，檢測腎臟組織中的抗氧化指標，觀察腎臟病理，以及測定腎臟組織中炎癥因子mRNA 的表達水平，對毛水蘇多糖在糖尿病患者腎臟的防治過程中的作用機制進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明小鼠SCXK（吉）-2020-0002 延邊大學；高糖高脂飼料 北京博愛港生物技術(shù)有限公司；丙二醛測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶活力測定試劑盒、過氧化氫酶活力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；毛水蘇采于佳木斯大學農(nóng)林實驗實習基地（46°46′58″N,130°21′6″E）；Animal Total RNA Isolation Kit Cat.No.RE-03011/03014，成都福際生物技術(shù)有限公司 ；2×F8 FastLong PCR Master Mix 北京艾德萊生物科技有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Code No.RR047A，TaKaRa ；SYBR Green qPCR Mix（with Rox） Cat. No P2091a，東盛生物科技有限公司 ；檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸二甲雙胍緩釋片 北京博愛港生物技術(shù)有限公司；無水乙醇天津市凱通化學試劑有限公司；鏈脲佐菌素Sigma；氯化鈉注射液 吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司。

臺式高速冷凍微量離心機 Sigma；GA-3 型血糖儀、血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司；TDZ4-WS 低速臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；XDS-18 倒置顯微鏡 北京榮興光恒科技有限公司；FA2004 電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；全自動多功能酶標儀 Bio Tek；HWS-250B恒溫恒濕箱 天津市泰斯特儀器有限公司；NanoDrop One Thermo Scientific；梯度PCR 儀 Eppendorf；LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀 羅氏；?80 ℃超低溫冰箱 Thermo Scientific USA；微量移液器

Eppendorf；DYY-12 型電泳儀 北京六一。

1.2 實驗方法

1.2.1 SBP 的提取 在錐形瓶中加入3.00 g 烘干后的毛水蘇粉末，按22:1 mL/g 的液料比加入蒸餾水，超聲輔助提取（22 min，350 W，70 ℃）的溶液冷卻至室溫，3500 r/min 條件下離心15 min，保留上清液，進行抽濾，將得到的濾液減壓濃縮，定容至10 mL，按1:4 的比例加入無水乙醇，4 ℃冰箱醇沉24 h，醇沉液離心（3500 r/min，15 min），保留沉淀物，并將沉淀加蒸餾水溶解，再次減壓濃縮，冷凍干燥得到粗多糖粉末。稱取適量的凍干粉末，加入一定的蒸餾水溶解，采用AB-8 大孔樹脂脫除色素，5%三氯乙酸脫除蛋白，使用3500 目透析袋除鹽，將得到的去雜溶液減壓濃縮，經(jīng)DEAE-52 纖維素層析柱分離得4 組分，取含量占比最高組分為樣品（多糖純度70.50%），凍干備用[11?12]。

1.2.2 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立及實驗分組 挑選體重在（20±2）g 范圍內(nèi)的清潔級昆明小鼠，隨機平均分為7 組，每組10 只，共計70 只，均為雄性。將小鼠于恒定溫度18～22 ℃和濕度50%～60%的環(huán)境下飼養(yǎng)，普通飼料適應性飼養(yǎng)7 d，適應性飼養(yǎng)后，隨機抽取其中一組用普通飼料喂養(yǎng)，為空白組。其余6 組改用高脂高糖飼料持續(xù)喂養(yǎng)，每7 d 對小鼠的體重進行一次測量并每天更換墊料，4 周后，小鼠禁食12 h 后，使用STZ 溶液對小鼠迅速進行腹腔注射，注射劑量為80 mg/kg，注射后死亡率為4.29%。空白組小鼠注射相同劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，恢復小鼠飲食，空白組小鼠喂食普通飼料，其余6 組小鼠喂養(yǎng)高脂高糖飼料維持血糖，腹腔注射結(jié)束72 h 后，對小鼠做禁食12 h 處理后，斷尾取尾靜脈血用于測定小鼠空腹血糖值。以11 mmol/L 作為臨界值，當測定的血糖值大于此數(shù)值時，則認定為成功創(chuàng)建Ⅱ型糖尿病小鼠模型[8]。造模完成后，取造模成功小鼠50 只，將其隨機分為5 個組，每組10 只，分別為模型、多糖低、中、高劑量組和陽性對照組。空白組和模型組小鼠每天灌胃0.1 mL/10 g 蒸餾水，多糖組小鼠按低、中、高順序每天分別用SBP 灌胃50、100、200 mg/kg，陽性組小鼠每天用200 mg/kg 二甲雙胍進行灌胃，連續(xù)灌胃28 d。除空白組小鼠一直用普通飼料喂養(yǎng)，其他組小鼠從開始造模至試驗結(jié)束，以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，保證維持小鼠高血糖癥狀[13?15]。

1.2.3 糖尿病小鼠體重與血糖的測定 每天給藥前先記錄小鼠死亡情況，觀察并記錄毛發(fā)、氣味、精神狀況及“三多一少”狀，造模成功后，每周稱量一次小鼠體重。給藥后每7 d 取小鼠尾靜脈血一次，用于測定小鼠空腹血糖值，測定前小鼠做禁食12 h 處理，連續(xù)測量4 次。

1.2.4 腎功能指標的測定 灌胃28 d 后，末次給藥24 h 后，無菌環(huán)境下進行脊椎脫臼處死，用酒精球擦拭小鼠腹部，手術(shù)剪開腹，腹腔主動脈取血0.5 mL，3500 r/min 離心15 min，取上清液，分離血清，注明標簽于?20 ℃保存[16]。試驗結(jié)束后，按照血液分析儀操作規(guī)程，測定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿蛋白含量。

1.2.5 腎臟指數(shù)的測定 小鼠處死取腹主動脈血后，解剖小鼠觀察腎臟情況，并摘取小鼠雙側(cè)腎臟，用生理鹽水沖洗粘連組織，濾紙吸干血水，將雙腎筋膜剝離后稱濕重，按以下公式計算腎臟指數(shù)。取兩部分組織分別浸泡在4%福爾馬林固定液中和冰浴的生理鹽水溶液中保存待用，進行腎臟組織病理學檢測和抗氧化酶活力的測定。

式中，N 為腎臟指數(shù)；m0為腎臟重量，g；m 為小鼠體重，g。

1.2.6 腎臟抗氧化酶活力的測定 剪取生理鹽水溶液中的腎臟組織0.2 g，加入1.5 mL 預冷的生理鹽水，冰浴下充分研磨，勻漿，3000 r/min 離心15 min，取上清液，迅速轉(zhuǎn)移到新的離心管中，分離出組織勻漿注明標簽，置于?20 ℃保存待測。試驗結(jié)束后，按檢測試劑盒說明書，測定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力、過氧化氫酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）的含量。

1.2.7 組織病理學觀察 固定液中的腎臟組織經(jīng)脫水，石蠟包埋，制片，HE 染色（蘇木素-伊紅染色）后，在電子顯微鏡下觀察各組小鼠組織形態(tài)學差異。

1.2.8 qRT-PCR 法檢測腎臟組織中VCAM-1、IL-1β及IL-6 的mRNA 水平 取腎臟組織20 mg 在液氮中研磨，Animal Total RNA Isolation Kit 試劑盒提取總RNA。使用Nanodrop 2000 檢測RNA 濃度及純度。取適量RNA 溶液按照2×F8 FastLong PCRMasterMix試劑盒合成cDNA 第一鏈。對cDNA 進行PCR 擴增反應，并以GAPDH 為內(nèi)參。PCR 循環(huán)條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火并延伸30 s，40 個循環(huán)；熔解曲線65 ℃到95 ℃，每15 s 升溫0.3 ℃。

引物使用Primer Premier 5.0 設計，由深圳華大基因科技服務有限公司合成，見表1。所得數(shù)據(jù)采用2?△△Ct法進行統(tǒng)計分析。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of fluorescent quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)（average）±標準差（SD）形式表示，采用SPSS 16.0 軟件分析所得數(shù)據(jù)，P<0.05 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠外觀形態(tài)的觀察

在試驗期間每天觀察小鼠狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)空白組小鼠進食、飲水及排尿量基本正常，活潑好動，毛色潔白鮮亮且順滑，體重持續(xù)增長并且增長較快，墊料更換時基本無異味；模型組小鼠體重持續(xù)下降，毛色粗糙、暗淡且有泛黃的表現(xiàn)，精神狀態(tài)萎靡，攝食量、進水量及排尿量增加，典型的“三多一少”癥狀，墊料異味加重。與模型組相比較，SBP 高、中、低劑量組及二甲雙胍組治療，小鼠狀態(tài)均有所改善。

2.2 SBP 對糖尿病小鼠體重的影響

體重變化是評價是否患糖尿病指標之一，它能直觀的反應出能量攝入與消耗之間的動態(tài)變化。造模成功后，小鼠體重均無明顯差異，將給藥7、14、21、28 d 的體重列于表2。由表中數(shù)據(jù)可知：給藥期間，空白組食用常規(guī)飼料，體重漲幅均在正常變化范圍內(nèi)，與空白組相比，實驗組食用高脂高糖飼料結(jié)合STZ 注射破壞體內(nèi)激素水平，致使小鼠體重均顯著低于空白組（P<0.05）；與模型組小鼠相比，給藥組小鼠體重逐漸上升，但仍低于空白組，說明SBP 對糖尿病小鼠體重減輕狀況有所改善。結(jié)束給藥后，與灌胃初期（7 d）相比SBP 低、中、高劑量及陽性組體重分別提升了19.85%、23.98%、30.52%、33.48%，其中，高劑量組小鼠體重與陽性組小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明SBP 高劑量組在改善糖尿病小鼠體重方面與二甲雙胍陽性組效果相當。

表2 SBP 對糖尿病小鼠體重的影響（g, ±s，n=10）Table 2 Effect of SBP on body weight of diabetic mice（g, ±s, n=10）

表2 SBP 對糖尿病小鼠體重的影響（g, ±s，n=10）Table 2 Effect of SBP on body weight of diabetic mice（g, ±s, n=10）

注：與空白組相比，*：P<0.05；與模型組相比，#：P<0.05；與陽性組相比，▲：P>0.05；表3～表6同。

分組 0 d 7 d 14 d 21 d 28 d空白組 45.34±0.34 48.67±0.76 52.17±0.58 55.33±1.04 60.00±1.50模型組 46.09±0.61 43.33±1.26* 40.00±0.50* 36.33±1.04* 33.00±0.50*低劑量組 45.11±0.14 42.83±0.76* 45.50±1.00* 49.67±0.76*#▲ 51.33±1.04*#中劑量組 47.02±0.52 44.50±0.87* 48.00±0.50*#▲ 50.33±1.04*#▲ 55.17±0.76*#高劑量組 46.34±0.39 43.67±1.04* 48.00±0.50*#▲ 50.50±1.32*#▲ 57.00±0.50*#▲陽性組 45.92±0.58 42.83±2.24* 47.50±1.00*# 49.50±1.50*# 57.17±0.58*#

2.3 SBP 對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

根據(jù)每周對小鼠空腹血糖的監(jiān)測，如表3 可知，模型組小鼠血糖明顯高于空白組，存在顯著性差異（P<0.05），且一直維持高血糖水平，說明高糖高脂飼料結(jié)合低劑量STZ 誘導的糖尿病小鼠模型成功。給藥期間，高劑量組和陽性組的降血糖效果明顯優(yōu)于低、中劑量組，且給藥組小鼠血糖持續(xù)降低，說明多糖對糖尿病小鼠有降血糖作用且較穩(wěn)定，無自我恢復現(xiàn)象。在結(jié)束給藥后，高劑量組血糖水平的調(diào)節(jié)效果已經(jīng)較為明顯并接近于陽性組，與模型組相比SBP 低、中、高劑量及陽性組分別降低了18.76%、23.17%、43.31%、49.92%，其中，高劑量組小鼠血糖值和陽性組血糖值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明SBP 高劑量組在治療糖尿病小鼠體內(nèi)激素紊亂現(xiàn)象具有一定的調(diào)節(jié)作用，其治療效果與二甲雙胍陽性組相當。

表3 SBP 對糖尿病小鼠空腹血糖的影響（mmol/L, ±s，n=10）Table 3 Effect of SBP on fasting blood glucose of diabetic mice（mmol/L, ±s, n=10）

表3 SBP 對糖尿病小鼠空腹血糖的影響（mmol/L, ±s，n=10）Table 3 Effect of SBP on fasting blood glucose of diabetic mice（mmol/L, ±s, n=10）

分組 7 d 14 d 21 d 28 d空白組 5.28±0.14 5.87±0.08 5.40±0.25 5.64±0.25模型組 23.38±1.16* 26.70±0.74* 28.17±0.76* 29.64±0.60*低劑量組 24.89±1.42* 23.16±2.02*# 22.03±0.39*# 20.22±0.39*#中劑量組 24.69±4.12* 23.04±1.50*# 19.90±0.61*# 18.97±0.59*#高劑量組 23.60±2.57* 22.52±1.51*# 19.05±0.96*#▲ 13.38±1.26*#▲陽性組 25.16±1.25* 22.74±1.55*# 18.08±1.58*# 12.60±2.29*#

2.4 SBP 對糖尿病小鼠腎臟功能的影響

肌酸在體內(nèi)進行代謝分解，其產(chǎn)物主要就是血肌酐（Scr），蛋白質(zhì)在體內(nèi)進行分解代謝后的末端產(chǎn)物即為尿素氮（BUN）。目前，臨床上一般將Scr 和BUN 作為腎衰竭的常用檢測項目。通常情況下健康的生物體的尿液中是不能夠檢測出蛋白質(zhì)，對人類而言，一旦在尿常規(guī)中檢測出小分子蛋白，那么就可以初步判定該患者腎臟濾過功能不完全。本試驗將解剖時所取的腹主動脈血經(jīng)血液分析儀檢測，從而間接地反映出糖尿病小鼠腎功能情況。由表4 可知，與空白組相比，模型組、SBP 低、中、高劑量組及陽性組小鼠的Scr、BUN 和尿蛋白含量均顯著升高（P<0.05），說明糖尿病小鼠的腎功能均表現(xiàn)出損傷情況。但經(jīng)SBP 灌胃治療28 d 后，SBP 低、中、高劑量組的Scr 較模型組相比均存在有下降趨勢（P<0.05），且隨著SBP 濃度的增加，下降幅度越大；SBP 低、中、高劑量組中的高劑量組BUN 下降趨勢最為明顯，且藥效與陽性組接近，二者間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；此外，數(shù)據(jù)顯示，糖尿病小鼠在進行SBP 治療后，較模型組而言，尿蛋白含量均顯著降低，且隨著SBP 濃度的增加，尿蛋白含量呈遞減趨勢。

表4 SBP 對糖尿病小鼠腎功能的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of SBP on kidney function of diabetic mice（±s, n=10）

表4 SBP 對糖尿病小鼠腎功能的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of SBP on kidney function of diabetic mice（±s, n=10）

分組 Scr（μmol/L） BUN（mmol/L） 尿蛋白（g/μmol）空白組 45.54±1.11 8.06±0.33 0.81±0.02模型組 88.85±0.49* 18.75±0.35* 12.54±0.86*低劑量組 71.87±1.68*# 17.62±0.55*# 8.40±0.24*#中劑量組 61.12±0.98*# 16.74±0.52*# 7.70±0.48*#高劑量組 56.55±0.52*# 14.05±0.81*#▲ 6.69±0.49*#陽性組 51.15±1.51*# 13.96±0.76*# 4.48±0.47*#

2.5 SBP 對糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的影響

糖尿病患者的腎臟損傷是常見的高血糖慢性并發(fā)癥之一，由于體內(nèi)激素分泌紊亂，致使腎臟負擔加重，進而會導致腎臟損傷或者腫大等現(xiàn)象的發(fā)生。將計算后的腎臟指數(shù)列于下表，由表5 數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠腎臟指數(shù)顯著增加（P<0.05），說明STZ 誘導的糖尿病小鼠腎臟功能存在一定損傷。與模型組相比，SBP 低、中、高劑量及陽性組的腎臟指數(shù)均顯著下降（P<0.05），分別降低了6.01%、15.74%、20.37%、24.07%，表明SBP 對于糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的改善效果存在量效關系，且SBP 高劑量組與陽性組的腎臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表5 SBP 對糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of SBP on the viscera index of diabetic mice（±s, n=10）

表5 SBP 對糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of SBP on the viscera index of diabetic mice（±s, n=10）

分組 腎臟指數(shù)（%）空白組 1.60±0.03模型組 2.16±0.06*低劑量組 2.03±0.11*中劑量組 1.82±0.04*#高劑量組 1.72±0.03*#▲陽性組 1.64±0.04#

2.6 SBP 對糖尿病小鼠腎臟組織抗氧化能力的影響

超氧酸氫酶（SOD）是一種防止機體體內(nèi)氧化的重要金屬酶。它是唯一一個將超氧陰離子作為反應底物的酶。讓超氧陰離子直接分解成水和氧，阻礙過氧化脂質(zhì)的生產(chǎn)，能夠減少對機體的傷害，使機體抗氧化能力增強[17?19]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是一種廣泛存在于身體中的分解酶，分解過氧化物（有毒）轉(zhuǎn)化生成為羥基化合物（無毒），促進過氧化氫的分解，進而促使過氧化物無法損壞細胞膜的功能及構(gòu)造[20?21]。過氧化氫酶（CAT）是促進細胞內(nèi)過氧化氫分解的酶。為了保護防止過氧化氫破壞抗氧化酵素系統(tǒng)的功能，不產(chǎn)生有的氫氧自由基，在機體部分組織中廣泛存在于紅細胞和過氧化體中[22?23]。由表6中數(shù)據(jù)可知，成功建立模型后，與空白組相比，模型組小鼠腎臟組織的SOD、GSH-Px 和CAT 含量均迅速下降，分別下降了49.12%、51.29%和55.06%（P<0.05）。給藥后，給藥組小鼠的SOD、GSH-Px、CAT 含量均有所上升，且隨濃度的增加呈現(xiàn)遞增趨勢，與模型組相比，SBP 高劑量組SOD、GSH-Px 和CAT 含量分別上升了45.59%、52.99%和50.24%（P<0.05），其中CAT 含量變化與陽性組接近，二者間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明SBP 能改善糖尿病小鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px 和CAT 活力下降的癥狀，且其中對于CAT 活力的改善效果SBP 高劑量組等同于陽性組。

表6 SBP 對糖尿病小鼠抗氧化指標的影響（±s，n=10）Table 6 Effect of SBP on antioxidant indicators of diabetic mice（±s, n=10）

表6 SBP 對糖尿病小鼠抗氧化指標的影響（±s，n=10）Table 6 Effect of SBP on antioxidant indicators of diabetic mice（±s, n=10）

分組 SOD（U/mg） GSH-Px（U/mg） CAT（U/mg） MDA（nmol/mg）空白組 26.61±0.74 1314.51±78.78 45.66±0.45 1.22±0.10模型組 13.54±0.53* 640.35±65.94* 20.52±0.97* 3.04±0.10*低劑量組 15.91±0.93*# 801.05±25.29*# 26.62±0.76*# 2.89±0.05*中劑量組 18.70±0.49*# 878.43±35.11*# 27.75±0.80*# 2.18±0.08*#高量組 19.70±0.59*# 979.65±40.74*# 30.83±0.34*#▲ 1.95±0.05*#陽性組 21.92±0.75*# 1151.82±58.35*# 30.66±0.41*# 1.56±0.17*#

丙二醛（MDA）是人體脂質(zhì)過氧化傷害的重要標志，其含量降低可提高機體抗氧化能力[24?25]。由下表數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠腎臟組織的MDA 含量迅速升高（P<0.05），說明模型組小鼠處于脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象。給藥結(jié)束后，與模型組相比，SBP 低、中、高劑量組及陽性組MDA 含量均顯著下降（P<0.05），說明SBP 對糖尿病小鼠腎臟組織中的MDA 具有一定程度的抑制作用，且隨著濃度的增高，效果更加明顯。

2.7 SBP 對糖尿病小鼠腎臟組織影響的病理學觀察

為了更加直觀檢驗糖尿病小鼠的腎臟存在的損傷情況，驗證SBP 可以有效緩解糖尿病小鼠的腎臟損傷情況，在給藥28 d 后，將各組小鼠的腎臟組織切片經(jīng)HE 染色后，結(jié)果如圖1 所示。從圖中可以看出，空白組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰正常，外形細胞規(guī)則飽滿，血管充盈，腎小管形態(tài)、管腔正常，腎間質(zhì)清晰可見，細胞核排列緊密均勻較為圓滿。與空白組相比，模型組腎臟結(jié)構(gòu)、腎小球結(jié)構(gòu)不清晰且被破壞，組織出現(xiàn)病變情況，外形細胞形狀不規(guī)則且分布不均勻，內(nèi)部浸潤著大量的炎性細胞，腎小管形態(tài)畸變腫脹肥大、管腔被擠壓或撕扯，腎間質(zhì)模糊，纖維

圖1 各組小鼠腎臟組織形態(tài)學觀察（HE100×）Fig.1 Histopathology of renal hetle in mice of each group（HE100×）

化程度高，細胞核排列雜亂無章，且形狀多為橢圓形，個別為扁狀形態(tài)，細胞核多為空核狀態(tài)，個別出現(xiàn)溶解、破碎情況。與模型組相比，SBP 各劑量組糖尿病小鼠的腎臟病變情況有所改善，其中高劑量組治療效果較為明顯，腎小球形狀有所緩解，形狀較為規(guī)則清晰，腎間質(zhì)纖維程度與炎性細胞浸潤情況稍有改善，腎小管形態(tài)和管腔孔道有所恢復，細胞核形態(tài)也在逐步恢復，發(fā)生溶解和破碎數(shù)量較少，表明SBP 高劑量組對腎臟組織損傷具有一定的改善作用。

2.8 SBP 對糖尿病小鼠腎臟組織炎癥反應的抑制作用

糖代謝的障礙紊亂可能會引起一系列病理學變化，其中炎癥反應與腎小球硬化癥的發(fā)生密切相關，是促進糖尿病腎病發(fā)病和發(fā)展的重要機制之一[26?27]。藥理學研究表明，微炎癥是初期糖尿病腎癥病理學變化的特點之一。因此，靶向炎癥反應是用于抑制糖尿病腎病惡化的一項有力手段。VCAM-1 是通過促進炎癥反應和纖維化而參與糖尿病腎病發(fā)病的一種重要血管細胞粘結(jié)分子，其水平與患者的尿蛋白和浸潤細胞的數(shù)量存在著密切的關系，可以用于患者的臨床評價[28?29]。IL-1β及IL-6 可以改變血管通透性，增加了趨化蛋白因子的表達，導致腎小球膜細胞外基質(zhì)部分的增殖和合成。是誘發(fā)血管病變的關鍵炎癥因子之一[30?31]。由圖2 可知，與空白組相比，模型組小鼠中VCAM-1、IL-1β及IL-6 的mRNA 水平顯著升高（P<0.05），SBP 高劑量干預能夠有效抑制糖尿病小鼠VCAM-1、IL-1β及IL-6 的mRNA 水平（P<0.05）。

圖2 SBP 對糖尿病小鼠腎臟組織中VCAM-1、IL-1β 和IL-6mRNA 表達量的影響Fig.2 Effect of SBP on mRNA levels of VCAM-1,IL-1β and IL-6 of in kidney of diabetic mice

3 討論與結(jié)論

采用STZ 低劑量腹腔注射結(jié)合喂養(yǎng)高脂高糖飼料建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，研究了毛水蘇多糖對糖尿病小鼠腎臟的保護作用。結(jié)果表明，在高脂高糖的飼養(yǎng)條件下，小鼠出現(xiàn)體重減輕、血糖升高、腎臟器官腫脹、腎功能以及腎臟結(jié)構(gòu)損傷等癥狀。經(jīng)過毛水蘇多糖28 d 灌胃干預后，可顯著降低糖尿病小鼠的血糖和腎臟指數(shù)（P<0.05），改善小鼠體重下降的情況，使小鼠的精神狀態(tài)趨于正常。與模型組相比，高劑量組的毛水蘇多糖降低了小鼠體內(nèi)血肌酐、尿素氮含量，緩解糖尿病尿糖、尿蛋白等癥狀的發(fā)生，修復腎臟的腫大和損傷，緩解腎臟組織發(fā)生的病理學改變，炎癥細胞浸潤而造成的腎小球畸變和細胞核空核、腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊混亂等癥狀都有所改善。

此外，實驗結(jié)果顯示，毛水蘇多糖能夠顯著改善糖尿病小鼠的抗氧化能力減弱癥狀（P<0.05）。較空白組而言，模型組小鼠腎臟組織的抗氧化酶活力系統(tǒng)中SOD、GSH-Px 和CAT 活力均下降，MDA 含量上升。但在毛水蘇多糖各劑量組連續(xù)灌胃干預28 d后，小鼠腎臟組織的抗氧化酶活力系統(tǒng)中SOD、GSHPx 和CAT 活力有所回升，MDA 含量較模型組也明顯降低。因此，可以初步判定毛水蘇多糖對糖尿病小鼠腎臟的保護可能與抗氧化損傷有關。毛水蘇多糖高劑量組的效果最為明顯，雖與空白組水平仍存在一定差距，但從總體上分析可以得出，毛水蘇多糖確實具有增強小鼠抵抗脂質(zhì)過氧化反應的能力，有效抑制機體過氧化和脂質(zhì)過氧化情況的發(fā)生。并且從檢測的VCAM-1、IL-1β及IL-6 的mRNA 水平中可以看出毛水蘇多糖具有調(diào)節(jié)糖尿病小鼠腎臟組織的炎癥作用，本實驗以與糖尿病患者腎臟惡化的相關炎癥因子VCAM-1、IL-1β及IL-6 為指標，評價了毛水蘇多糖對改善腎臟炎癥損傷的效果，發(fā)現(xiàn)毛水蘇多糖高劑量組能夠調(diào)節(jié)炎癥因子，明顯降低其mRNA 的表達水平，進而間接性的抑制糖尿病腎臟組織的損傷。

綜上所述，毛水蘇多糖具有明確的降血糖活性，能夠明顯改善糖尿病小鼠的腎臟損傷情況。其保護機制可能與下調(diào)VCAM-1、IL-1β及IL-6 介導的炎癥反應，上調(diào)SOD、GSH-Px、CAT 并下調(diào)MDA 抗氧化通路減輕氧化應激損傷有關，但由于所用多糖成分為粗提物，其重復性、穩(wěn)定性尚未可知，雖然經(jīng)歷了除雜的過程但仍然是一種復合物，其確切機制、藥物的具體作用成分以及作用靶點尚不明確，因此有待進行更深一步研究。