膠原蛋白的提取、性質及其應用的研究進展

◎ 梁健華

（陽江市檢測檢驗中心，廣東 陽江 529500）

膠原蛋白是哺乳動物組織中細胞外基質的關鍵蛋白質之一，約占全身蛋白質的25%～35%，主要存在于纖維組織中，如筋腱、韌帶、軟骨和皮膚等。膠原蛋白由成纖維細胞合成，分子量約為300 kDa，具有三股螺旋結構。目前已知的膠原蛋白有29種，其中I型膠原蛋白的含量最高，約占人體內膠原蛋白的90%以上，廣泛存在于皮膚、骨骼和肌腱中。

目前，從動物組織中提取是膠原蛋白的主要來源之一，如來源于豬、牛、羊、鼠等陸生動物的皮、筋腱和骨骼等。此外，水產加工中的下腳料如魚皮、魚翅、魚鱗和魚骨等也是膠原蛋白的重要來源之一。然而，不同來源的膠原蛋白，其制備工藝和結構性質存在差異。本文基于膠原蛋白的提取制備工藝、對膠原蛋白性質的影響因素及膠原蛋白的應用進行了總結介紹。

1 膠原蛋白的提取制備

動物組織中膠原纖維的分布、纖維間結合的緊密程度、組織中的其他成分（如黏多糖、礦物質）與膠原纖維的交聯程度等的差異，均影響著組織中膠原蛋白提取的難易程度、提取率、純度和膠原蛋白結構的完整性。綜合目前的研究報道，從動物組織中提取膠原蛋白通常包括原材料的除雜處理和膠原蛋白的提取純化這兩個步驟。

1.1 原材料的除雜處理

為使膠原蛋白能滿足不同領域的要求，在膠原蛋白提取前需對原料進行除雜處理。原材料的雜質通常是雜蛋白、黏多糖、脂肪和礦物質等。雜蛋白的混入會增加膠原蛋白基產品的免疫原性的風險，一般可使用稀堿溶液除去這些雜蛋白。LIU等[1]研究了在4 ℃、10 ℃、15 ℃和20 ℃下，不同濃度（0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1、0.20 mol·L-1和 0.50 mol·L-1）的 NaOH 溶液對草魚魚皮中雜蛋白的除去效率和效果的影響，結果發現，NaOH的濃度對雜蛋白的除去效率沒有顯著影響，而當 NaOH 的濃度 為 0.20 mol·L-1和 0.50 mol·L-1時，膠原蛋白的的共價鍵部分被破壞，導致膠原蛋白的損失。梁健華等[2]研究了超聲波輔助0.01 mol·L-1的NaOH溶液去除羅非魚皮中的雜蛋白的條件，超聲處理60 min，魚皮中雜蛋白的溶出量約為37.37 mg·g-1，膠原蛋白的遷出量為0.63 mg·g-1，且超聲處理能使魚皮中的膠原纖維充分伸展，利于后續膠原蛋白的提取。為了獲得無色無味的膠原液，組織中的色素一般采用H2O2溶液或者0.1 mol·L-1的NaOH溶液除去。此外，原材料中的脂肪極易氧化產生臭味，且脂肪的存在會阻礙膠原蛋白的溶出，使膠原蛋白溶液變渾濁，因此在提取前需去除組織中的脂肪，通常使用有機溶劑，如乙醇。

1.2 膠原蛋白的提取純化

膠原蛋白分子中的三螺旋結構在縱向和雙側排列成具有周期性的纖維結構，4～8個膠原分子通過共價鍵連接形成膠原微纖維，而后逐漸形成直徑為10～500 nm的膠原纖維，纖維結構的致密性使膠原蛋白難溶于溶液中。近年來，使用中性鹽、堿法、酸法和酶法提取分離不同來源和組織中不同類型的膠原蛋白已有很多報道，如表1所示。酸酶結合提取法通常是首選的方法，稀酸溶液能有效作用于膠原蛋白分子間的氫鍵，使膠原纖維膨脹展開，利于后續膠原蛋白的提取；但酸溶液不能切斷膠原分子端肽間的共價鍵，使得膠原蛋白不能有效溶出。基于酶解的方法可將膠原分子端肽間的共價鍵切除，促進膠原蛋白的溶出，常用的酶有胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等，使用這些酶的原因有如下幾點：①酶能水解組織中的非膠原蛋白，以便于后續的鹽純化和透析除去這部分雜蛋白，提高膠原蛋白的純度。②在膠原蛋白分子沒有展開、融化或破壞時，這些酶主要切割膠原蛋白的N-端和C-端，極大地提高了膠原蛋白的提取效率。③經酶提取后的膠原蛋白，由于大部分端肽已被切除，極大地降低了其免疫原性，利于后續的應用。

表1 膠原蛋白的提取方法及提取率表

此外，提取后的膠原蛋白需經過純化處理，以盡可能的去除膠原液中的雜質，包括部分變性的膠原蛋白。可溶性膠原蛋白通常使用鹽或聚電解質沉淀，經后續的離心和透析可獲得純化的膠原蛋白。提取后的膠原蛋白溶液可冷凍干燥或者冷凍保存。

2 影響膠原蛋白性質的因素

膠原蛋白的性質決定了其應用的領域。在食品領域上，膠原蛋白最重要的特性是凝膠強度、粘彈性、凝膠化作用和熔融點。而在生物醫學應用上，膠原蛋白最重要的特性是成纖維的能力、熱穩定性和降解性能等。影響膠原蛋白性質的因素有很多，例如分子量、羥脯氨酸（Hyp）的含量、共價交聯的程度等。其中，膠原蛋白的來源和種類決定了其內在的化學和物理性質，此外，膠原蛋白的制備工藝也是影響其性質的主要原因。

2.1 膠原蛋白的來源對其性質的影響

不同來源的膠原蛋白在各應用領域上都依賴于其熱穩定性。膠原蛋白的熱穩定性主要與分子內的脯氨酸（Pro）和Hyp形成的吡咯烷環、Hyp的羥基形成的氫鍵有關[5]。由于交聯密度的增大，較高含量的Hyp和Pro可提高膠原蛋白的熱穩定性。表2列舉了幾種不同來源膠原蛋白氨基酸含量及其熱變性溫度。一般而言，陸生哺乳動物來源的膠原蛋白的熱穩定性較水產膠原蛋白的高，如來自羊骨、牛皮、豬皮和鼠尾肌腱的膠原蛋白的熱變性溫度均高于水產膠原蛋白（羅非魚皮膠原蛋白除外）。而動物的棲息溫度[6]也影響著膠原蛋白的熱穩定性。

結合表2可知，熱水和溫水來源的魚的膠原蛋白的熱變性溫度較冷水和冰水來源的魚的膠原蛋白的高。如羅非魚皮膠原蛋白的熱變性溫度明顯高于深海紅鮭魚皮膠原蛋白。此外，由于氨基酸的組成也與動物組織的部位有關，因此不同組織部位的膠原蛋白其熱穩定性也存在微小的差異。對于鳙魚來說，來自內部組織（魚鰾和骨頭）的膠原蛋白的Hyp和Pro含量高于來自外部組織（魚鰭、鱗片和魚皮）的膠原蛋白[7]。MUYONGA等[8]在對尼羅河鱸魚皮膠原蛋白的研究中發現，處于成熟階段的魚的膠原蛋白其Hyp和Pro的含量與非成熟階段的魚無顯著性差異。

表2 不同來源膠原蛋白的Hyp、Pro含量和熱變性溫度表

2.2 膠原蛋白的制備工藝對其性質的影響

膠原蛋白的性質不僅與來源有關，與其制備工藝也密切相關，主要包括提取工藝和改性工藝兩方面。

2.2.1 提取工藝對膠原蛋白性質的影響

膠原蛋白的提取步驟為：①長時間（＞12 h）堿液浸泡除雜蛋白處理。②長時間（＞24 h）酸或酸酶液攪拌提取。③鹽析、長時間透析純化處理。這使得膠原蛋白需長時間暴露于化學試劑（堿、酸、鹽等）中，而這些條件有可能會改變膠原蛋白的化學性質。

LIN等[9]報道了隨著提取時間的延長，鳥爪膠原蛋白的成纖維能力逐漸減低，且長時間（24 h、48 h和72 h）提取的膠原蛋白的熱變性溫度明顯低于短時間（4 h、12 h和18 h）提取的膠原蛋白。ZEUGOLIS等[10]報道了經醋酸提取的牛跟腱膠原蛋白的黏度顯著（P＜0.002）高于胃蛋白酶提取的膠原蛋白，而胃蛋白提取的牛跟腱膠原蛋白在酸性pH下的溶解度約為酸溶液提取的10倍。YOSHIMURA等[11]發現，堿溶液會破壞膠原蛋白分子端肽部分的共價鍵，減少膠原蛋白分子間的共價交聯，從而降低其熱穩定性。

由此可見，膠原蛋白的提取工藝條件（如溫度、pH、提取時間等）均會影響它的結構性質，因此，為了使膠原蛋白保持其天然的結構特性，提取溫度通常為低溫，且盡可能減少膠原蛋白暴露于化學試劑中的時間。

2.2.2 改性工藝對膠原蛋白性質的影響

為了提高膠原蛋白的熱穩定性、成纖維能力、力學性能和降解性能等，通常使用物理或化學方法對其進行改性，以滿足實際生產應用的需要。表3列舉了膠原蛋白的一些改性方法及改性后膠原蛋白的結構性質的差異。

表3 膠原蛋白部分改性方法表

KANTH等[12]使用雙醛纖維素對鼠尾肌腱膠原蛋白進行改性，改性后膠原蛋白的交聯度達到94.06%，且收縮溫度由62.5 ℃提高到80.5 ℃，對膠原蛋白酶的耐受性提高了13.68倍。當使用丙二酸對鼠尾肌腱膠原蛋白進行改性時[13]，膠原蛋白的機械性能有所提升，拉伸強度可達7.9 MPa，斷裂伸長率提高了11.8%。此外，由于膠原蛋白是一類聚合電解質，其等電點接近生理的pH，這使得膠原蛋白在中性pH的溶液的溶解度較小，限制了膠原蛋白在保健品、化妝品和注射用生物材料中的應用。ZHANG等[14]研究了使用聚-N-羥基琥珀酰亞胺對膠原蛋白進行改性，膠原蛋白的等電點由6.90降低到4.00，增大了其在中性pH溶液中的溶解度。

這些化學交聯的方法能明顯提高膠原蛋白的熱穩定性和機械強度，但引入交聯的化學試劑可能導致潛在的毒副作用和不良的生物相容性，而物理交聯的方法則不會引入潛在的細胞毒性。

YUNOKI等[15]比較了真空熱交聯和紫外輻照交聯對大馬哈魚皮膠原蛋白改性的影響，結果發現，真空熱交聯大馬哈魚皮膠原蛋白3 d（110 ℃），膠原蛋白熱變性溫度由19 ℃提高到87 ℃，且三螺旋結構的破壞程度最小，但降低了其溶解性及對膠原酶的耐受性；使用15 J·cm-2的輻照劑量，膠原蛋白的熱變性溫度由19 ℃提高到102 ℃，溶解性和對膠原酶的耐受性也顯著降低。物理的方法雖然能提高膠原蛋白的熱穩定性，但也會不同程度地破壞膠原蛋白的螺旋結構。總體上，膠原蛋白的性質由其結構所決定，改性的方法雖然會不同程度的提高膠原蛋白的部分化學性質（如機械強度、熱穩定性等），但也會不可避免破壞膠原蛋白的三螺旋結構，降低膠原蛋白其他的功能性質（如溶解性能、生物相容性等）。

3 膠原蛋白的應用

3.1 膠原蛋白在食品保健品中的應用

膠原蛋白中含有豐富的必需氨基酸和非必需氨基酸，可作為新型功能性食品中的營養成分，以提高不同食品產品的質量。如由膠原蛋白原料制備的明膠，由于其具有優越的凝膠化、成膜性和增稠性，通常作為提高膠體食品的凝膠及成膜的穩定性和質地的增強劑。果汁中添加適量的明膠可提高果汁的黏稠度，果凍中加入適量的明膠可增強果凍的膠體穩定性，香腸中添加適量的明膠可提高香腸彈性。利用酶水解膠原蛋白得到的功能性肽也常用于保健食品中，這些功能性肽具有增加骨密度、降低血壓和抗氧化的作用。

在美國，膠原蛋白肽已廣泛用于保健食品領域中。WU等[16]報道了攝入膠原蛋白肽可減輕患者的膝關節疼痛癥狀；此外，口服膠原蛋白肽和鈣劑比單獨服用鈣劑對于緩解骨質疏松的效果更好。SAIGA等[17]報道了膠原蛋白肽可降低原發性高血壓大鼠的血壓，且在8 h其血壓達到最低值。陳碩等[18]探討了豬骨頭膠原蛋白水解物對自發性高血壓大鼠血壓的影響，發現在30～70 mg·kg-1·d-1劑量范圍內，均具有明顯的長期穩定的降血壓效果。此外，膠原蛋白還可作為天然抗氧化劑和變形劑，降低化學防腐劑的利用率，可以滿足消費者對安全和綠色食品的需求[19]。

3.2 膠原蛋白在生物醫藥中的應用

目前膠原蛋白基的生物醫藥產品已有很多，例如外科植入物、止血劑、創面敷料、組織修復材料和口腔填充物等。膠原蛋白在生物醫藥中的應用主要有3方面，分別為：①用作止血材料。②用作組織工程材料。③用于藥物釋放的媒介。膠原蛋白的三股螺旋結構能誘導血小板的附著，激活凝血因子，起到良好的止血作用。此外，膠原蛋白還具有良好的滲水和吸水的能力，對止血有輔助作用。市面上膠原蛋白止血產品主要有膠原蛋白海綿和膠原微纖維粉末，可用于體內如血管、器官、口腔等的止血，也可用于體外創面的止血。近年來膠原蛋白在組織工程中的應用引起了學者的廣泛關注，如作為皮膚和骨骼的修復材料、支架材料、生物膜材料等。由于膠原蛋白具有良好的機械強度和生物相容性，重組的I型膠原蛋白可以直接替代受損的皮膚。例如，豬的全層皮膚切除傷口模型已用于研究膠原基植入物對肉芽組織的形成、傷口收縮和上皮化的影響。膠原蛋白在藥物釋放的臨床應用形式有水凝膠、顆粒劑、海綿和薄膜等，用于低分子量化學物如抗生素和癌癥抑制劑等藥物的釋放。

3.3 膠原蛋白在化妝品中的應用

皮膚中膠原蛋白的含量約占30%，膠原蛋白在皮膚中的含量和強度直接與皮膚的老化程度相關。隨著年齡的增長，皮膚中的膠原纖維逐漸受損，厚度變薄且強度下降。為了緩解這些問題，膠原蛋白被作為美容治療中的一種重要成分以促進使用者皮膚恢復年輕和健康，在化妝品領域中的應用劑型可以是霜類、營養補充劑和植入劑等。利用膠原蛋白含有較多的親水性氨基酸，如甘氨酸、羥脯胺酸、脯氨酸等，能與水分形成氫鍵，膠原蛋白常常制備成高保濕的凝膠霜，能夠提高皮膚的貯水能力，對皮膚進行有效保濕。此外，膠原蛋白的修復作用常常被應用于皮膚的抗衰老、抗皺、防紫外線輻照和傷口愈合中，膠原蛋白能于皮膚上形成薄膜，覆蓋于皮膚上，減少經皮水分的流失，保護皮膚免受腐蝕性因素的侵害。

4 結語

據報道[20]，截止至2017年底，全球膠原蛋白市場的規模約為37.1億美元，且在2018年持續增長，預計在2025年，達到66.3億美元的規模。這種增長歸因于膠原蛋白在食品保健品、化妝品和生物醫藥領域應用中能滿足消費者的需要。在過去幾十年里，從各種原材料提取膠原蛋白已經取得了重大的進展，確定了膠原蛋白的溶劑、時間、溫度等加工條件以生產最佳產量和質量（如維持其三螺旋結構）的膠原蛋白。但大規模短時間提取和生產膠原蛋白的最佳工藝和過程控制條件目前仍需繼續探討。

此外，膠原蛋白的改性，特別是熱穩定性在目前也取得了較為重大的研究進展。使用的化學方法或物理方法均能對膠原蛋白進行改性，但是，這些方法都不可避免地會破壞膠原蛋白的螺旋結構，為了使膠原蛋白能滿足更多領域的需求，更多有效的改性方法仍需后續的深入研究。膠原蛋白如何與其他功能性物質的配合使用發揮其功能特性也需后續研究。