分子量對(duì)蜜蜂巢脾多糖抑菌及抗氧化活性影響

◎ 周 楊，胡嘉琪，趙純曦，朱 祺，殷 玲

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分，其中多糖是巢脾中的主要活性成分[1-2]。蜜蜂巢脾多糖來源復(fù)雜，源于巢脾是蜜蜂世代棲息和繁衍的場所，也是蜜蜂貯存蜂蜜、花粉、蜂王漿、蜂膠的場所，老巢脾中殘留大量蜂產(chǎn)品、幼蟲繭衣及其分泌物，因此巢脾多糖很可能是動(dòng)植物多糖的復(fù)合物[3]。研究前期發(fā)現(xiàn)巢脾多糖具有較好的抗氧化活性、抗脂質(zhì)氧化活性、對(duì)于環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠造成的免疫抑制也有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，巢脾多糖有較好的抗氧化活性[4]，而多糖的生物學(xué)活性受到多糖分子量的影響。為進(jìn)一步分析不同分子量巢脾多糖的生物活性，本試驗(yàn)采用超濾法對(duì)巢脾多糖進(jìn)行分級(jí)分離，獲得分子量為 4 ～ 100 kDa（HCP-L） 和 ＞ 100 kDa（HCP-H）2個(gè)不同分子量段的巢脾多糖，并對(duì)2個(gè)分子量段巢脾多糖的抗氧化活性及抑菌活性進(jìn)行比較分析，以期篩選出活性更好的巢脾多糖組分，從而為進(jìn)一步研究蜜蜂巢脾多糖的生物活性及開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西方蜜蜂老巢脾（使用3年以上）。

抗超氧陰離子測定試劑盒、羥自由基測定試劑盒、總抗氧化測定試劑盒，均購自南京建成生物制藥研究所。

無水乙醇（無錫佳妮化工有限公司）、硫化鋇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、硫酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）等均為分析純。

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌均為購自中國藥品生物制品菌檢定所的凍干粉。

1.2 儀器與設(shè)備

MSC300超濾杯及截留分子量為4 kDa、100 kDa的超濾膜，上海魔速科學(xué)器材有限公司；紫外可見分光光度計(jì)T6，北京普析通用儀器有限公司；雙光束紫外可見分光光度TU-1901，北京普析通用儀器有限公司；雙人單面垂直凈化工作臺(tái) SW-CJ-2FD，吳江市亞泰凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂巢脾多糖的提取及分級(jí)

粉碎的蜜蜂巢脾→按1∶15比例加入蒸餾水→50 ℃水浴鍋水浴90 min→120目紗布過濾→重復(fù)3次→濃縮至體積大幅度減少→冷卻離心→1∶4無水乙醇→4 ℃靜置過夜→沉淀離心得蜜蜂巢脾粗多糖→去色素→去蛋白得蜜蜂巢脾多糖→依次使用截留分子量的為4 kDa、100 kDa的超濾膜超濾→獲得分子量為4～100 kDa（HCP-L）、＞100 kDa（HCP-H）的多糖樣品。

1.3.2 體外抗氧化能力檢測

按照試劑盒方法測定各分子量段的巢脾多糖體外抑制羥自由基能力、抗超氧陰離子能力及總抗氧化能力。

1.3.3 巢脾多糖的抑菌性試驗(yàn)

菌種復(fù)蘇并傳2代后，挑取細(xì)菌菌落置10 mL血清肉湯培養(yǎng)基于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，取出離心（2 000 r·min-1，10 min），用無菌生理鹽水洗滌，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ脽o菌生理鹽水參照[9]的方法稀釋成不同濃度懸菌液，以青霉素鉀溶作為陽性對(duì)照，生理鹽水作為陰性對(duì)照，采用紙片擴(kuò)散法[5]測定兩組巢脾多糖的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖溶液對(duì)供試菌的抑菌性

2.1.1 蜜蜂巢脾多糖對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌性

以濾紙片周圍抑菌圈的直徑大小作為巢脾多糖抑菌效果的測定指標(biāo)，用游標(biāo)卡尺測量培養(yǎng)皿中濾紙片對(duì)1×108CFU·mL-1的肺炎鏈球菌的抑菌圈直徑（包含濾紙片的直徑6 mm，下同）。兩個(gè)分子量段蜜蜂巢脾多糖對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌性情況如圖1所示。

圖1 兩個(gè)分子量段蜜蜂巢脾多糖對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌性圖

由圖1可知，兩個(gè)分子量段的巢脾多糖對(duì)肺炎鏈球菌均有較好的抑菌活性，且其抑菌活性均呈現(xiàn)濃度依賴性，在多糖濃度為200 mg·mL-1時(shí)，兩個(gè)分子量段的巢脾多糖均對(duì)肺炎鏈球菌呈現(xiàn)最大抑菌活性，在此濃度下HCP-L及HCP-H產(chǎn)生的抑菌圈分別是15.72 mm及14.82 mm。在6個(gè)濃度梯度下，HCP-L對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌活性均稍強(qiáng)于HCP-H，但是兩個(gè)分子量的巢脾多糖對(duì)肺炎鏈球菌的抑制作用差異并不明顯。

但是這些努力沒有來得及挽回另外3個(gè)受害者的生命：27歲的瑪麗·瑞娜剛剛生完小孩，正在休產(chǎn)假，結(jié)果服了有毒膠囊，當(dāng)場喪生。美國航空公司空乘波拉·普林斯死在芝加哥郊區(qū)的家中，身邊是泰諾速效膠囊的藥瓶。同樣慘遭厄運(yùn)的還有與她同齡的瑪麗·邁克菲蘭。短短兩天，小小的膠囊就奪走了7條人命。

2.1.2 蜜蜂巢脾多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性

由圖2可知，兩個(gè)分子量段的巢脾多糖對(duì)枯草芽孢桿菌均有較好的抑菌活性，其抑菌活性均呈現(xiàn)一定濃度依賴性，在多糖濃度為200 mg·mL-1時(shí)兩個(gè)分子量段的巢脾多糖均對(duì)枯草芽孢桿菌呈現(xiàn)最大抑菌活性，在此濃度下HCP-L及HCP-H產(chǎn)生的抑菌圈分別是11.79 mm及10.83 mm。在6個(gè)濃度梯度下，HCP-L對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性均稍強(qiáng)于HCP-H，但是總體而言兩個(gè)分子量的巢脾多糖對(duì)肺炎鏈球菌的抑制作用差異并不顯著。

圖2 兩個(gè)分子量段蜜蜂巢脾多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性圖

2.1.3 蜜蜂巢脾多糖對(duì)大腸桿菌的抑菌性

兩個(gè)分子量段巢脾多糖對(duì)大腸桿菌的抑菌活性檢測結(jié)果如圖3所示，HCP-H對(duì)大腸桿菌不具有抑菌活性，而HCP-L則對(duì)大腸桿菌均有較好的抑菌活性，其抑菌活性均呈現(xiàn)一定濃度依賴性，在多糖濃度為200 mg·mL-1時(shí)對(duì)肺炎鏈球菌呈現(xiàn)最大抑菌活性，在此濃度下產(chǎn)生的抑菌圈是11.24 mm。

圖3 兩個(gè)分子量段蜜蜂巢脾多糖對(duì)大腸桿菌的抑菌性圖

2.1.4 蜜蜂巢脾糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性

兩個(gè)分子量段巢脾多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性檢測結(jié)果如圖4所示，兩個(gè)分子量段的巢脾多糖對(duì)金黃色葡萄球菌均有較好的抑菌活性，其抑菌活性均呈現(xiàn)一定濃度依賴性，在多糖濃度為200 mg·mL-1時(shí)兩個(gè)分子量段的巢脾多糖均對(duì)金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)最大抑菌活性，在此濃度下HCP-H及HCP-L產(chǎn)生的抑菌圈分別是11.28 mm及13.65 mm。在6個(gè)濃度梯度下，HCP-L對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用均強(qiáng)于HCP-H。

圖4 兩個(gè)分子量段蜜蜂巢脾多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性圖

研究表明，動(dòng)植物多糖具有體外直接抑菌活性[6-8]，本研究結(jié)果顯示，兩個(gè)分子量段巢脾多糖對(duì)肺炎鏈球菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌均具有較好的體外抑菌活性。抗菌化合物的抗菌機(jī)制包括細(xì)胞壁的破壞、膜通透性的變化、蛋白質(zhì)和核酸分子的變化、酶的抑制及核酸合成的抑制等[9-10]。本研究中不同分子量的巢脾多糖對(duì)不同的細(xì)菌呈現(xiàn)出不同的抑菌活性，低分子量的HCP-L略高于高分子量的HCP-H，說明分子量對(duì)巢脾多糖抑菌活性的有一定影響，推測其原因可能是巢脾多糖對(duì)細(xì)菌的抑制主要是通過破壞細(xì)胞壁來作用，高、低分子量的巢脾多糖對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用沒有差異或者差異不大，而低分子量的巢脾多糖由于分子量小，更易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步對(duì)蛋白質(zhì)和核酸產(chǎn)生微量作用，因此抑菌作用略高于高分子量巢脾多糖。這一推測還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，HCP-H對(duì)大腸桿菌不具有抑菌活性，而HCP-L則對(duì)大腸桿菌具有較好的抑菌活性，杜恒裔等[7]也發(fā)現(xiàn)滸苔多糖對(duì)大腸桿菌無抑制活性，其具體原因及機(jī)制還需要進(jìn)一步分析研究。但是兩個(gè)分子量巢脾多糖的抑菌活性差異并不顯著，因此從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)對(duì)其進(jìn)行分離純化沒有意義。

2.2 兩個(gè)分子量多糖的體外抗氧化活性比較分析

2.2.1 抑制羥自由基能力測定結(jié)果

兩個(gè)分子量段巢脾多糖抑制羥自由基能力測定結(jié)果如圖5所示，兩個(gè)分子量段巢脾多糖均具有較好的抑制羥自由基能力，且與濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系。多糖濃度在5～20 mg·mL-1時(shí)，HCP-L和HCP-H抑制羥自由基的能力隨著濃度的升高逐漸增強(qiáng)，且HCP-L的抑制羥自由基能力強(qiáng)于HCP-H；當(dāng)濃度為20～40 mg·mL-1時(shí)，HCP-H抑制羥自由基能力隨著濃度的增加迅速增加，超過HCP-L。

圖5 兩個(gè)分子量段巢脾多糖對(duì)羥自由基的清除能力圖

2.2.2 抗超氧陰離子自由基測定結(jié)果

兩個(gè)分子量段巢脾多糖抗超氧陰離子自由基測定結(jié)果如圖6所示，兩個(gè)分子量段巢脾多糖均具有較好的抑制羥自由基能力，且與濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系。當(dāng)多糖濃度＜20 mg·mL-1時(shí)，兩個(gè)分子量段的巢脾多糖的抗超氧陰離子能力差異不大；當(dāng)濃度為20～40 mg·mL-1時(shí)，HCP-H的抗超氧陰離子能力呈持續(xù)上升趨勢且明顯強(qiáng)于HCP-L，HCP-L的抗超氧陰離子能力在多糖濃度為40 mg·mL-1達(dá)到最高 37.78 U·L-1。

圖6 兩個(gè)分子量巢脾多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力圖

2.2.3 總抗氧化能力測定結(jié)果

不同分子量段多糖的總抗氧化能力測定結(jié)果如圖7所示，兩個(gè)分子量段巢脾多糖均具有較好的總抗氧化能力，且與濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，HCP-H的總抗氧化能力略大于HCP-L。

圖7 兩個(gè)分子量巢脾多糖對(duì)總抗氧化能力的測定圖

多糖是一類具有多種活性的生物大分子[11-14]，其中研究較多的是抗氧化活性[15-18]，但是對(duì)不同分子量多糖活性的研究較少[19-20]。本研究結(jié)果顯示，兩個(gè)分子量段的巢脾多糖都具有較好的抗氧化活性，且HCP-H較HCP-L具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

課題組前期研究結(jié)果表明，巢脾多糖具有較好的體外抗氧化活性，為進(jìn)一步研究其生物活性，以更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際，本實(shí)驗(yàn)利用超濾技術(shù)將巢脾多糖分為分子量4～100 kDa（HCP-L）及大于100 kDa（HCP-H）兩個(gè)級(jí)別，首先采用紙片擴(kuò)散法測定HCP-L和HCP-H對(duì)肺炎鏈球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌性，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HCP-L的抑菌活性略高于HCP-H，而HCP-H較HCP-L具有較好的抗氧化活性。

中國是傳統(tǒng)養(yǎng)蜂大國，每年淘汰的老巢脾數(shù)量可觀，而這些老巢脾大都被用來提取蜂蠟，其中水溶性的活性物質(zhì)如多糖常常被丟棄，本研究結(jié)果提示，巢脾多糖可作為天然保鮮劑進(jìn)行開發(fā)，同時(shí)若生產(chǎn)以抑菌活性為需求的產(chǎn)品則無需考慮其分子量的影響，而若以抗氧化活性為功效需求，則可選擇活性相對(duì)較高的HCP-H。