不同前處理方法對山藥中13種真菌毒素檢測的影響

◎ 黎思樂，趙美平，容 順，陳 維，梁達清，李詞周，郭偉鵬

（1.廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東 廣州 510000；2.廣州王老吉大健康產業有限公司，廣東 廣州 510000）

真菌廣泛存在于空氣、水、土壤等自然環境中，在環境條件適宜時，如溫濕度過高，產毒真菌可大量繁殖。真菌產生的有害物質稱為真菌毒素。常見的真菌毒素有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、T-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、桔青霉素和雜色曲霉素，這些毒素的結構式及其危害具體見表1。

表1 真菌毒素結構式與危害表

山藥，生活中最常見“藥食同源”藥材之一，富含淀粉、多糖、腺苷、環肽類和微量元素等多種營養成分，所以在栽培、采收、加工和分裝運輸過程中，如果存儲條件不佳，容易受到各種產毒真菌及真菌毒素的污染。本文以山藥為樣品，通過優化前處理步驟，建立了高效、簡潔的多種真菌毒素檢測方法。

續表1

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13種毒素標準品：黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2；赭曲霉毒素OTA；嘔吐毒素DON；玉米赤霉烯酮F-2；T-2毒素；桔青霉素CIT；雜色曲霉毒素ST；伏馬毒素FB1、FB2、FB3；均購自青島普瑞邦生物工程有限公司。Pribolab試劑為甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，購自上海安譜公司。超純水，實驗室一級水，由Millipore超純水機制備。

1.2 儀器與設備

UPLC-MS/MS超高效液相色譜-質譜儀，配電噴霧離子源：SCIEX Triple Quad 5500+；QT-1渦旋混合器：上海琪特分析儀器有限公司；多功能自動樣品濃縮儀：Biotage；BSA224S-CW電子分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KDC-40低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；EYELA旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；氮吹儀：TurboVap。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

山藥樣品用粉碎機粉粹，稱取山藥樣品2.5 g于50 mL離心管中，加入5 mL甲醇/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸溶液，渦旋混勻1 min，超聲20 min，在低速離心機以5 000 r·min-1離心5 min。上清液移去另一離心管，再加入5 mL乙腈/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸溶液，重復前面步驟進行提取，合并2次上清液。取上清液5 mL，40 ℃水浴下，氮吹濃縮至近干，加入甲醇/水（50/50，V/V）定容2 mL，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.2 基質標準溶液配制

按1.3.1處理，獲得空白樣品液，根據后續實驗稀釋不同濃度。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（Waters，1.6 μm×2.1 mm×100 mm）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL，分析總時間10 min；流動相A：0.1%甲酸-0.5%乙酸銨，流動相B：甲醇；UPLC-MS/MS梯度洗脫條件：0～ 0.5 min，95%A，5%B；0.5～ 5 min，10%A，90%B；5.01～8 min，10%A，90%B；8.01～10 min，95%A，5%B。

1.3.4 質譜條件

質譜檢測采用電噴霧離子源（ESI），檢測模式為多反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM），13種真菌毒素質譜采集參數見表2，MRM色譜圖見圖1。

表2 13種真菌毒素的質譜采集參數表

圖1 13種真菌毒素標準溶液-MRM譜圖

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的優化

合適的提取溶劑不僅能減少樣品中的雜質如脂肪和蛋白質等，降低基質效應，還可以提高回收率。樣品提取一般采用有機溶劑加水作為溶劑，提取液含水可以濕潤基質，增強有機溶劑的滲透能力[3]。不同毒素性質各有差異，如伏馬毒素，它屬于水溶性真菌毒素，在提取溶劑中加入一定比例的水，可有效地提取水溶性真菌毒素。

考察不同有機溶劑比例、酸堿度對13種真菌毒素的提取效果。第一組5種提取液和回收率見圖2，當采用單一溶劑“甲醇/水”提取時，黃曲霉毒素回收率均小于65%，其他毒素采用甲醇/水時，回收率基本在60%～125%。當采用單一溶劑“乙腈/水”提取時，黃曲霉毒素回收率基本在60%～75%，其他毒素回收率均在70%～120%。所以兩種有機溶劑中，乙腈/水的提取效果優于甲醇/水。而采用單一溶劑乙腈/水（80/20，V/V）提取和混合溶劑提取時，2種提取溶劑的回收率比較接近，雖都滿足要求，但黃曲霉毒素回收率還是相對偏低。因黃曲霉毒素在中性或弱酸性溶液中穩定，第二組在提取液中加入0.1%甲酸，考察酸堿度對13種毒素提取效果和穩定性。第二組結果見圖3，13種真菌毒素的回收率均略有提高，尤其回收率偏低的黃曲霉毒素。

圖2 不同提取溶劑加標回收率對比圖

圖3 未加甲酸提取溶劑與加0.1%甲酸提取溶劑的回收率對比圖

因此本實驗選擇混合溶液（第一次甲醇/水（80/20，V/V），0.1% 甲 酸； 第 二 次 乙 腈 /水（80/20，V/V）-0.1%甲酸）作為提取溶劑。

2.2 濃縮方式的優化

前處理過程中濃縮也可能存在損失，常見方法有旋蒸和氮吹，通過樣品加標回收率考察各自的損失情況。結果如圖4所示，通過氮吹方式濃縮的回收率明顯高于旋蒸方式，所以前處理濃縮步驟優先選擇氮吹方式。

圖4 不同濃縮方式樣品加標回收率對比圖

2.3 基質效應

除前處理步驟，必須考慮另外一個影響因素——基質效應。基質效應是除分析物外的其他成分，其會對檢測結果有影響，有增強或抑制作用[4]。樣品中的基質如脂肪、蛋白質、色素對分析物測定有干擾，直接干擾分析物在檢測器中的響應[5]。

基質效應（SSE,%）=空白基質標準溶液配制標準曲線的斜率/純溶劑標準曲線的斜率×100[5]。該比值代表了干擾物對目標物離子化效率的影響。SSE為80%～120%為基質不明顯；SSE＜80%為基質抑制效應；SSE＞120%為基質增強效應[6]。通過表3可知，山藥中只有F-2、ST、T-2的SSE在80%～120%，所以基質效應不算明顯；OTA、CIT、FB的都大于120%，對樣品有增強效應；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON的都＜65%，對樣品有明顯抑制效果。現在解決基質效應的方法主要有兩個：使用合適的內標和采用基質標準溶液校正[6]。本實驗通過配制基質校正曲線，用其定量樣品，可以補償其基質效應[7]。

表3 13種真菌毒素的信號抑制/增強效應表

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線、檢測限、定量限

13種真菌毒素響應值有差異，所以其線性范圍有區別。按建立的樣品預處理方法制備空白基質溶液，配制基質校正曲線，除CIT、FB、DON 3種真菌毒素外，其他毒素曲線濃度 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和 20 ng·mL-1，CIT 曲 線 濃 度1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和 100 ng·mL-1；FB 曲線濃度 0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1和 50 ng·mL-1；DON 曲線濃度 10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、150 ng·mL-1和 200 ng·mL-1。 按 1.3.4 和1.3.5色譜-質譜條件進樣檢測，以待測物色譜峰峰面積（Y）為縱坐標，進樣濃度（X，ng·mL-1）為橫坐標進行線性回歸。標準曲線、檢出限和定量限如表4所示，各種真菌毒素相關系數（R）均大于0.997，線性關系良好。

表4 13種真菌毒素的線性范圍、檢測限和定量限表

2.4.2 準確度和精密度

實驗采用樣品加標回收率方式檢驗其準確度和精密度。選取3個低、中、高加標濃度，添加標準品溶液到空白樣品中，每個濃度進行3平行測定。按確定好實驗方法進行測定，計算回收率和相對標準偏差（RSD）。準確度和精密度結果見表5，黃曲霉毒素在3個加標濃度的回收率在69.3%～85.6%，相對偏差RSD為0.6%～7.4%；其他12種加標濃度的回收率在70.1%～112.4%，相對偏差RSD為0.7%～7.2%，回收率良好，可滿足山藥中真菌毒素的檢測要求。

表5 13種真菌毒素的方法回收率和RSD表

2.4.3 實際樣品的檢測

從廣州市市區不同類型超市隨機購買山藥干10批次。通過建立的方法對10批山藥進行13種真菌毒素檢測，結果均小于食品標準的檢出限，未檢出。

3 結論

本文以山藥為樣品，經過優化提取溶劑、濃縮方式，最終實驗確定提取溶劑為甲醇/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸、乙腈/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸混合提取液，氮吹方式進行濃縮。基質效應分析可知，部分真菌毒素在山藥中有增強或抑制作用的基質效應，因此本實驗選擇用空白山藥基質配制標準曲線，以此來補償標準溶液和樣品溶液中標物的響應。

經方法學驗證，線性、準確度、精密度均符合實驗要求，證明該方法前處理能快速實現13種真菌毒素測定。從廣州市區不同類型的超市隨機購買山藥干10批次進行13種真菌毒素檢測，均小于食品標準的檢出限，結果均未檢出。