NAF與EGCG聯合應用對變異鏈球菌的作用研究

劉曉璇,方 圓,王 瑞

齲病是一種牙體硬組織疾病，主要是由于牙菌斑生物膜附著在牙齒表面產酸，對牙體硬組織造成損傷[1]。早在19世紀，研究結果已經證實變異鏈球菌與齲病具有相關性[2]。變異鏈球菌在口腔中具有極強的附著能力，能在牙面上形成細菌生物膜，通過利用多種碳水化合物產酸形成低pH值環境，從而改變口腔內環境，為其他產酸菌和耐酸菌提供有利的生存環境[3-4]。因此，通過減少變異鏈球菌生長及其生物膜的形成，可以有效預防齲病的發生。

氟化鈉(sodium fluoride，NAF)是一種公認的雙重功能防齲劑，對牙齒硬組織保護和口腔微生物調節均具有重要作用[5]，NAF既是糖酵解酶抑制劑，又是跨膜質子載體，可以通過誘導細胞質酸化來抑制細菌的生長[6-7]。茶葉作為一種天然的抗齲物質，茶多酚已被證實可以有效防止齲病的形成，甚至抑制齲病的發展[8]，此外它還具有抑制口腔相關致齲菌生長的功能。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是茶多酚中主要的抗微生物單體成分，它具有抑制變異鏈球菌生長繁殖和產酸的作用[9-10]。現有研究顯示NAF與EGCG都具有良好的抗菌性能，因此我們想要探討兩者聯合應用是否能夠對變異鏈球菌產生協同抑制作用，增強其抗菌性能，從而減少藥物的使用量。

1 材料與方法

1.1 材料

變異鏈球菌(Streptococcusmutans，UA159)由吉林大學口腔醫學院牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室提供，牛腦心浸出液培養基(brain heart infusion，BHI)購自北京索萊寶科技有限公司，結晶紫染料購于珠海迪爾生物工程有限公司，EGCG購自北京索萊寶科技有限公司，NAF購于上海易恩化學技術有限公司。

1.2 細菌的培養

將-80 ℃凍存的變異鏈球菌復蘇后接種于瓊脂板，于37 ℃恒溫培養箱、厭氧條件下培養24 h后，接種于BHI液體培養基中繼續培養至對數生長期，用于后續實驗。

1.3 NAF與EGCG對變異鏈球菌生長的抑制作用

通過微量稀釋法測量NAF與EGCG對變異鏈球菌生長的抑制作用[11]，在96孔微量滴定板的孔中均加入100 μL變異鏈球菌(1×107CFU/mL)和100 μL系列稀釋的試劑。先通過預實驗，最終確定NAF的濃度范圍為125.000、100.000、62.500、31.250、25.000、15.625 mg/L，EGCG濃度范圍為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 mg/L。將菌液分別和不同濃度的EGCG或NAF試劑在96孔微量滴定板中混合，在37 ℃厭氧環境下孵育24 h，然后用酶標儀測定各孔于600 nm波長處的OD值以評估細菌生長情況，定性檢測藥物最小抑菌濃度值(minimal inhibition concentration，MIC)，藥物最小抑菌濃度值(MIC50)定義為與對照組相比至少抑制50%細菌生長的最低藥物濃度。

1.4 NAF與EGCG聯合應用對變異鏈球菌生長的抑制作用

NAF與EGCG聯合應用對變異鏈球菌生長的抑制作用通過棋盤微量稀釋法來測定，將菌液與不同濃度的NAF和EGCG混合溶液加入96孔板中，檢測聯合應用時NAF與EGCG的MIC值，然后計算分級抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration，FIC)用來判斷兩者是否有潛在協同作用[11]。FIC=聯合用藥時甲藥MIC/單獨應用甲藥時MIC+聯合應用乙藥時MIC/單獨應用乙藥時MIC。FIC指數為<0.500、0.500～1.000、1.000～2.000、>2.000時分別表示協同、相加、無關、拮抗作用。

1.5 生物膜的檢測

檢測NAF與EGCG對變異鏈球菌生物膜的抑制作用是將100 μL變異鏈球菌(1×107CFU/mL)與100 μL不同濃度的藥物溶液一同加入96孔板中，根據預實驗確定藥物的最終濃度梯度為NAF(125.000、62.500、31.250、15.625 mg/L)、EGCG(125.000、62.500、31.250、15.625 mg/L)、檢測單獨與聯合應用對生物膜抑制實驗時藥物的濃度分別為(25.0 mg/L NAF、62.5 mg/L EGCG、25.0 mg/L NAF+62.5 mg/L EGCG)，于37 ℃、厭氧條件下進行培養24 h[12]，吸出上清液，生理鹽水洗滌3次，用戊二醛固定15 min，結晶紫染色10 min后用生理鹽水清洗3次，加入95%的乙醇，將板在室溫下搖動30 min，用酶標儀測量600 nm波長處的OD值。最小生物膜抑制濃度(minimal biofilm inhibitory concentration，MBIC)定義為與未處理的對照相比，至少抑制了50%生物膜(MBIC50)形成時的藥物濃度。

1.6 NAF與EGCG對變異鏈球菌產酸的影響

測定不同濃度的NAF與EGCG聯合應用以及單獨應用時對變異鏈球菌產酸的影響[11]，取對數生長期的變異鏈球菌培養于BHI培養基(含1%蔗糖)中，調整初始pH值為7.5，每個試管中各含有4 mL菌液和4 mL不同濃度的藥物溶液，檢測單獨與聯合應用對產酸抑制作用時藥物的濃度分別為(25.0 mg/L NAF、62.5 mg/L EGCG、25.0 mg/L NAF+62.5 mg/L EGCG)，37 ℃厭氧環境下培養24 h，每隔4 h測量各個試管中變異鏈球菌的pH值，即pH1。計算ΔpH=pH0-pH1，抑制產酸率=(ΔpH對照組-ΔpH實驗組)/ΔpH對照組×100%，并繪制“時間—pH值”曲線。

1.7 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，進行單因素方差分析(ANOVA)，并使用t檢驗進行多組之間均值的比較，以P<0.05為差異有統計學意義。所有實驗重復3次。

2 結 果

2.1 NAF與EGCG單獨及聯合應用對變異鏈球菌生長的影響

NAF對變異鏈球菌生長的抑制作用，從圖1可以看出NAF能夠顯著抑制變異鏈球菌的生長，NAF對變異鏈球菌的MIC值為100 mg/L。

n=3;***:P<0.01

EGCG對變異鏈球菌生長的抑制作用，從圖2可以看出EGCG能夠抑制變異鏈球菌的生長，EGCG對變異鏈球菌MIC值為500 mg/L。

n=3；***：P<0.01

NAF與EGCG聯合應用對于變異鏈球菌生長的影響由棋盤微量稀釋法得出NAF與EGCG聯合應用時NAF的MIC值為25.0 mg/L，EGCG的MIC值為62.50 mg/L，而單獨應用時，NAF的MIC值為100 mg/L，EGCG的MIC值為500 mg/L，通過公式計算FIC值為0.375，<0.500，認為具有協同抑制作用。結果顯示25.000 mg/L NAF與62.50 mg/L EGCG聯合應用能達到單獨應用100 mg/L NAF或500 mg/L EGCG時的抑菌效果，NAF與EGCG能夠協同抑制變異鏈球菌的生長。

2.2 NAF與EGCG對變異鏈球菌生物膜的影響

NAF對變異鏈球菌生物膜的抑制作用，從圖3可以看出NAF能夠顯著抑制變異鏈球菌生物膜的生長，NAF對變異鏈球菌的MBIC值為62.50 mg/L。

n=3；***：P<0.01

EGCG對變異鏈球菌生物膜的抑制作用，從圖4可以看出EGCG能夠抑制變異鏈球菌生物膜的生長，EGCG對變異鏈球菌MBIC值為62.50 mg/L。

n=3；***：P<0.01

NAF與EGCG單獨與聯合應用對變異鏈球菌生物膜的影響，如圖5、6結果顯示,當聯合應用25.000 mg/L NAF和62.50 mg/L EGCG時，變異鏈球菌的生物膜形成量與對照組相比顯著減少(P<0.01)，并且與單獨應用25.000 mg/L NAF和62.50 mg/L EGCG時生物膜的形成量也相對減少(P<0.01)。

n=3；***：P<0.01

2.3 NAF與EGCG單獨與聯合應用對變異鏈球菌產酸的影響

如圖7結果顯示，NAF與EGCG均能抑制變異鏈球菌的產酸活動，24 h后25 mg/L NAF產酸抑制率為22.5%，62.50 mg/L EGCG產酸抑制率為35%。NAF與EGGC聯合應用時25.000 mg/L NAF與62.50 mg/L EGCG混合溶液對變異鏈球菌的產酸抑制率為60%，比單獨應用NAF或EGCG時產酸抑制率明顯增加(P<0.01)，充分說明兩者聯合應用能夠增強對變異鏈球菌產酸的抑制作用。

A：25.000 mg/L NAF+62.50 mg/L EGCG組；B：EGCG(62.50 mg/L)組；C：NAF(25.000 mg/L)組；D：對照組

圖7 NAF與EGCG單獨和聯合應用對變異鏈球菌產酸的影響

3 討論

NAF作為一種傳統防齲藥物，在齲病預防上發揮著重要作用，但是近年來對氟化物安全性問題進行了大量研究討論[13]。研究顯示氟化物如果使用不當很容易造成氟中毒、氟牙癥等其他疾病[14-15]，因此提高NAF功效，減少NAF用量顯得尤為重要[16]。通過研究NAF與EGCG聯合應用對于變異鏈球菌的影響，尋找一個更好抑制變異鏈球菌生長繁殖的方法，為預防齲病提供一個新的思路[17]。

變異鏈球菌的致齲能力主要為耐酸性、產酸性以及生物膜形成能力，使變異鏈球菌能以生物膜的形式附著在牙齒表面，其糖酵解以及其他反應產生的酸性產物可對牙體硬組織造成損傷，并使變異鏈球菌在菌斑生物膜中保持優勢地位[3]。通過對變異鏈球菌的生長，生物膜的形成，以及產酸方面進行研究，結果發現EGCG和NAF都能夠顯著抑制變異鏈球菌浮游菌以及生物膜的生長，并明顯抑制變異鏈球菌的產酸反應。當NAF與EGCG聯合應用時，抗菌性能顯著增強，25.000 mg/L NAF與62.50 mg/L EGCG聯合應用就可以達到單獨使用100 mg/L NAF以及單獨使用500 mg/L EGCG時的抑菌效果。NAF與EGCG聯合應用生物膜的形成量比單獨應用時生物膜形成量明顯減少并且可以增強對變異鏈球菌產酸的抑制作用。相關研究顯示變異鏈球菌的耐酸性主要與胍丁胺脫亞氨酶系統(agmatine deiminase system，AgDS)和F-ATP酶有關，而耐酸性是變異鏈球菌能在酸性環境中存活以及繁殖的重要特征，EGCG 可以抑制F-ATP酶活性與AgDS的作用，從而造成細胞質酸度增加，抑制細胞內一些不耐酸酶類的正常功能，包括糖酵解反應和EPS的生成，進而降低了細菌對酸性環境的適應性[18-20]。氟化鈉以HF的形式進入細胞膜內，解離成H+和F-，還可將F-ATP酶排出的質子帶回細胞質，不僅抑制了F-ATP酶的功能還使細胞質酸化，破壞了細菌的耐酸性，還可以導致細菌的死亡[21]。EGCG與氟化鈉合用不僅可以破壞變異鏈球菌的耐酸性，還可以通過抑制葡萄糖基轉移酶(glucosyltransferase，GTF)和唾液淀粉酶的活性來影響碳水化合物的代謝，一方面抑制細菌的生長和生物膜的形成，另一方面也減少了酸的產生，生物膜形成量的減少也使細菌繁殖及生長速率減慢，產酸量也可隨之下降[8]。EGCG和氟化鈉還可以通過多種途徑抑制變異鏈球菌產酸，既可通過上述細胞質酸化影響糖酵解反應抑制細菌產酸，還可以通過抑制乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的活性[9-10]抑制酸性產物的生成。EGCG和氟化鈉對變異鏈球菌的生長繁殖，生物膜以及產酸的抑制是通過一系列復雜生物聯級反應造成的，除了上述的抑菌機制外還可通過其他途徑抑菌。

本研究得出結論，當EGCG和氟化鈉聯合應用時，可以在增強NAF對變異鏈球菌抑制作用的同時減少NAF用量，并充分發揮EGCG天然抗齲劑的作用，從而為齲病防治提供一個新的方法。NAF與EGCG聯合應用既可以通過相同的抑菌途徑共同抑制細菌毒性，也可以通過不同的方式對細菌多種毒性因子進行抑制，從而達到比單獨應用時更好的抑菌效果，但是具體抑制機制需要我們更加深入的研究。